第6章食用菌的基因工程课件.ppt
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- 关 键 词:
- 食用菌 基因工程 课件
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1、1第第6 6章章 食用菌基因工程食用菌基因工程Section 6 Genetic engineering in edible fungi概念食用菌外源基因表达系统宿主的选择载体构建银耳芽孢外源基因表达系统双孢蘑菇外源基因表达系统-2 基因工程实际上就是基因重组,就是按照人类的需要把这种生物的“基因”与另外一种生物的“基因进行重新组合,“组装”成新的基因组合,创造出新的物质或生物(基因工程菌)。这种完全按照人的意愿,由重新组装基因表达产生新的物质或新生的生物科学技术,就称为“基因工程”,或者说是“遗传工程”。 基因工程是生物工程的一个重要分支,它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成
2、了生物工程。u 什么是基因工程?什么是基因工程?-3(1)目的基因;)目的基因;(2)表达元件及表达载体(即将目的基因与质粒或病)表达元件及表达载体(即将目的基因与质粒或病毒毒DNA连接成重组连接成重组 DNA););(3)转化方法(把重组)转化方法(把重组DNA引入某种细胞);引入某种细胞);(4)重组体的筛选(把目的基因能表达的受体细胞挑)重组体的筛选(把目的基因能表达的受体细胞挑选出来)。选出来)。 u基因工程的主要要素基因工程的主要要素-4食用菌外源基因表达系统食用菌外源基因表达系统一、宿主的选择一、宿主的选择-5u现有外源基因表达系统的缺陷现有外源基因表达系统的缺陷l大肠杆菌表达系统
3、大肠杆菌表达系统蛋白质翻译后修饰加工体系不完善,表达蛋白活性蛋白质翻译后修饰加工体系不完善,表达蛋白活性 低或没有活性低;低或没有活性低;细胞产生内毒素,影响表达蛋白的纯化;细胞产生内毒素,影响表达蛋白的纯化;细胞质内表达的目标蛋白形成包涵体颗粒,包涵体细胞质内表达的目标蛋白形成包涵体颗粒,包涵体要用变性剂溶解,再通过复性才能得到在缓冲液中溶要用变性剂溶解,再通过复性才能得到在缓冲液中溶解的蛋白解的蛋白-6l酵母表达系统酵母表达系统表达产物过渡糖基化:酵母细胞合成糖链多为甘露表达产物过渡糖基化:酵母细胞合成糖链多为甘露糖残基,常形成过长的侧链,如糖残基,常形成过长的侧链,如cel基因的表达;基
4、因的表达;表达产物缺乏糖基化:如人尿激酶基因(表达产物缺乏糖基化:如人尿激酶基因(uPA)有)有一一O-糖基化位点,酵母缺乏在该位点的糖基化;糖基化位点,酵母缺乏在该位点的糖基化;表达真核生物基因的产物与天然产物在结构上有些表达真核生物基因的产物与天然产物在结构上有些 差异差异-7成本高、工艺复杂;我国成本高、工艺复杂;我国20多产家还处于转瓶生产多产家还处于转瓶生产(EPO和乙肝疫苗),年产量不足和乙肝疫苗),年产量不足100g/year;细胞凋亡难以克服(细胞凋亡难以克服(CHO细胞)细胞)l哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统l丝状真菌表达系统丝状真菌表达系统-8u食用菌作为外源基因
5、表达系统的特点食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌美味可食,营养丰富,是健康食品和保健食品;食用菌美味可食,营养丰富,是健康食品和保健食品;-9培养工艺简单、培养基质来源丰富。不仅可以利用发酵培养工艺简单、培养基质来源丰富。不仅可以利用发酵罐大规模深层发酵培养,还可以利用农业下脚料进行工罐大规模深层发酵培养,还可以利用农业下脚料进行工厂化种植;厂化种植;u食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌作为外源基因表达系统的特点-10食用菌是高等真核生物,表达真核生物的基食用菌是高等真核生物,表达真核生物的基 因活性高;因活性高;食用菌有良好的蛋白分泌能力,有利于目的食用菌有良好的蛋白分泌能力,有利于
6、目的 蛋白的分离和纯化;蛋白的分离和纯化;遗传转化系统容易建立遗传转化系统容易建立u食用菌作为外源基因表达系统的特点食用菌作为外源基因表达系统的特点-11银耳是一食药兼用菌银耳是一食药兼用菌有性繁殖无性繁殖-12银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢单核,具有独特的繁殖特性银耳芽孢单核,具有独特的繁殖特性出芽繁殖,出芽繁殖,和酵母一样,生长速度快,容易培养和酵母一样,生长速度快,容易培养-13u银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点银耳芽孢作为生物反应器具备独特优点-14银耳芽孢是高等真核生物,翻译后的蛋白质修饰系银耳芽孢是高等真核生物,翻译后的蛋白质修饰系统
7、完善,表达高价值的真核生物基因的活性高统完善,表达高价值的真核生物基因的活性高银耳芽孢已有完善的高密度深层发酵培养体系银耳芽孢已有完善的高密度深层发酵培养体系银耳芽孢营养丰富,可食安全银耳芽孢营养丰富,可食安全-15二、载体构建二、载体构建(一)质粒载体的组成一)质粒载体的组成 克隆载体克隆载体:含抗性基因、自主复制序列(:含抗性基因、自主复制序列(ori)常用克隆质粒载体常用克隆质粒载体(1)pUC系列(含系列(含ampr、 lacZ、Mutiple cloning site)(2)pBR322 (含含ampr、tetr、 Mutiple cloning site)(3)Bluescript
8、 M13系列(含系列(含ampr、 lacZ、Mutiple cloning site)(4) 噬菌体载体噬菌体载体-16-17-18pGgpd3670bplaczlaczf1 oriAmp+Ggpd promoterSpeApaAatSphBstZSacNcoEcoREcoR NotBstZPstSalNdeBstZNotSacBstXNsiGgpd prom oter60bpSacNcopGg-gfp4632bpGgpd promoterGFPterminatorAmp+SacNcoSac是Spe、Sac双酶切 Nco、Sac双酶切adaptor1bpSpeEcoRPstNcoGgpd p
9、romoter60bpSacPstNcoSpeEcoRvector fragment3920bpAmp+GFPterminatorSacSacNcopBluescritGFP4221bpabgpd promoterGFPterminatorAmp+SacSacNcogpd promotor-19表达载体表达载体:组成:启动子,终止子,目的基因,抗性筛选标记基因。组成:启动子,终止子,目的基因,抗性筛选标记基因。-20-21Eco RI 5 -G A A T T C- 3 3 -C T T A A G- 5Pst I5- C T G C A G -33- G A C G T C-5Hae III
10、5-G G C C -33-C C G G -5-22食用菌常用启动子:食用菌常用启动子:1 1)rasras (Le.ras.geneLe.ras.gene)启动子;)启动子;2)gpdgpd(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)启动子;启动子;3)sprspr1(serine proteinase gene )1(serine proteinase gene )启动子;启动子;4 4)trptrp1 1(tryptophan synthetase genet
11、ryptophan synthetase gene)启动子;)启动子;5)其他:)其他:cel1(cellulose-growth-specific gene )cel1(cellulose-growth-specific gene )启动子、启动子、cel3 cel3 启动子、启动子、cel4cel4启动子、启动子、pri(primase gene )pri(primase gene )启动子、启动子、gla1(glu-coamylase gene )gla1(glu-coamylase gene )启动子等。启动子等。-23 筛选标记筛选标记 (1 1)营养缺陷型标记)营养缺陷型标记 :营
12、养缺陷互补标记基因有:A) ural(二氢乳清酸)基因,杨树菇转化;B) pabl(p-氨基苯甲酸)基因,鬼伞 、蘑菇遗传转化;C)trp2(色氨酸)基因,鬼伞 、蘑菇遗传转化;D)银耳肌醇营养缺陷型菌株。-24(2)抗生素抗性筛选标记)抗生素抗性筛选标记 : 抗生素抗性筛选标记已在植物、真菌遗传转化子的筛选上广泛使用。主要有:卡那霉素抗性基因(kan+);氨苄青霉素抗性基因(Amp+)潮霉素抗性基因(Hyg+);腐草霉素抗性基因(Phl+);博来霉素抗性基因(Ble+)。 在培养基中添加抗生素进行筛选。-25(3 3)除草剂和杀菌剂抗性筛选标记)除草剂和杀菌剂抗性筛选标记 : A) 如Bia
13、laphos 抗性基因; B)杀菌剂Carboxin抗性基因(CbxR);-26(4)代谢产物抗性筛选标记)代谢产物抗性筛选标记 如从鬼伞中分离得到的如从鬼伞中分离得到的trp3iar基因。该基因是抗氟基吲基因。该基因是抗氟基吲哚(哚(5-fluoroindole,5-FL)代谢的,草菇和平菇对潮霉素不)代谢的,草菇和平菇对潮霉素不敏感,而对敏感,而对5-FL十分敏感,当把十分敏感,当把trp3iar 转入草菇和平菇时,转入草菇和平菇时,这两种食用菌就能对这两种食用菌就能对5-FL产生抗性,达到筛选的目的产生抗性,达到筛选的目的 。-27载体构建策略载体构建策略()选择合适的表达载体()选择合
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