酶改性基本理论课件.pptx
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1、第二章第二章 酶学基础酶学基础第一节第一节 酶的化学本质酶的化学本质1.酶大多数是蛋白质酶大多数是蛋白质l酶经酸水解的产物是氨基酸;酶经酸水解的产物是氨基酸;l凡能使蛋白质变性的因素也能使酶变凡能使蛋白质变性的因素也能使酶变性;性;l酶存在两性解离和等电点的性质;酶存在两性解离和等电点的性质;l和蛋白质一样不能透过半透膜;和蛋白质一样不能透过半透膜;胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶溶菌酶溶菌酶1.酶大多数是蛋白质酶大多数是蛋白质1926年美国Sumner脲酶的结晶,并指出酶是蛋白质 1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶,并进一步证明了酶是蛋白质。 J.B.Sumne
2、rJ.H.Northrop 1982年美国Cech等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工,发现RNA有催化活性. Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA 少部分酶是核糖核酸少部分酶是核糖核酸l19821982年,年,CechCech和和Altman Altman 等人发现等人发现RNARNA具有生物催化活性。具有生物催化活性。 1983年美国S.Altman等研究核糖核酸酶PRNaseP(由20%蛋白质和80%的RNA组成),发现RNaseP中的RNA具有核糖核酸酶P的催化活性,而蛋白质部分确没有。 Si
3、dney Altman Yale University New Haven, CT, USA Cech和Altman各自独立地发现了RNA的催化活性,并命名这一类酶为ribozyme(核酶),2人共同获1989年诺贝尔化学奖。 1982年年绝大多数的酶属于此类酶。绝大多数的酶属于此类酶。SumherNorthrop纯化得到脲纯化得到脲酶结晶而荣获酶结晶而荣获1946诺贝尔奖诺贝尔奖具有催化作用的具有催化作用的一类蛋白质一类蛋白质四膜虫的四膜虫的26SrRNA均能自我剪接均能自我剪接形成成熟的形成成熟的rRNA。CechAltman获获1989诺贝尔奖诺贝尔奖有自剪切或催有自剪切或催化功能的核酸
4、化功能的核酸核酶的发现,是对酶概念的重要发展。核酶的发现,是对酶概念的重要发展。蛋白质酶类蛋白质酶类核酶核酶2.酶的化学组成酶的化学组成l蛋白类酶蛋白类酶(p-(p-酶酶) )的基本组成单位的基本组成单位 氨基酸氨基酸l核酸类酶(核酸类酶(R-R-酶)的基本组成单酶)的基本组成单位位核苷酸核苷酸l从酶的组成来看,有些酶仅由蛋白从酶的组成来看,有些酶仅由蛋白质或核糖核酸组成质或核糖核酸组成单成分酶单成分酶;l有些酶除了蛋白质或核糖核酸以外,有些酶除了蛋白质或核糖核酸以外,还需要有其他还需要有其他非生物大分子非生物大分子(辅助(辅助因子)因子)成分成分双成分酶。双成分酶。全酶全酶=酶蛋白(或酶核糖
5、核酸)酶蛋白(或酶核糖核酸) + 辅助因子辅助因子全酶的结构与分子组成全酶的结构与分子组成(一一)无机辅助因子无机辅助因子l镁离子镁离子(Mg(Mg2+2+):):多种酶的辅助因子,在酶的多种酶的辅助因子,在酶的催化中起重要作用。催化中起重要作用。eg:eg:柠檬酸裂合酶、异柠檬酸裂合酶、异柠檬酸脱氢酶。柠檬酸脱氢酶。l锌离子锌离子(Zn(Zn2+2+):):是各种金属蛋白酶的辅助因是各种金属蛋白酶的辅助因子。子。l铁离子铁离子(Fe(Fe2+2+) )、铜离子、铜离子(Cu(Cu2+2+) )、锰离子、锰离子 (Mn(Mn2+2+) )、钙离子、钙离子(Ca(Ca2+2+) )。(二)有机辅
6、助因子(二)有机辅助因子l烟酰胺核苷酸(烟酰胺核苷酸(NADNAD+ +和和NADPNADP+ +)l黄素核苷酸(黄素核苷酸(FMNFMN和和FADFAD)l铁卟啉铁卟啉l辅酶辅酶Q Ql辅酶辅酶A Al生物素等等生物素等等 酶分子上只有少数氨基酸残基与催化活性直接相酶分子上只有少数氨基酸残基与催化活性直接相关,这些氨基酸残基集中的、与酶活性相关的区关,这些氨基酸残基集中的、与酶活性相关的区域称作酶的活性中心,亦称作活性部位。这些氨域称作酶的活性中心,亦称作活性部位。这些氨基酸残基往往分散在相距较远的氨基酸顺序中,基酸残基往往分散在相距较远的氨基酸顺序中,有的甚至分散在不同的肽链上。有的甚至分
7、散在不同的肽链上。(一)(一)酶活性中心的概念酶活性中心的概念4、酶的活性中心、酶的活性中心枯草杆菌蛋白酶:枯草杆菌蛋白酶: SerSer221221 ,HisHis6464;胰凝乳蛋白酶:胰凝乳蛋白酶:IleIle1616,HisHis5757,AspAsp102102,LysLys194194,SerSer195195Koshland将酶分子的氨基酸残基分为四类:(1)接触残基接触残基:它们与底物接触、参与底物的化学转变。此类氨基酸残基的一个或几个原子与底物分子中一个或几个原子的距离都在一个键距离 (1.52埃)之内。它们的侧链,起与底物结合作用的称为结合基团结合基团;起催化作用的称为催化
8、基团催化基团。有时结合基团也参与催化作用,不能绝对区分。这些残基中的一些有时可能也起辅助残基的作用。(2)辅助残基辅助残基:它们不与底物接触,而是在使酶与底物结合及协助接触残基发挥作用方面起作用。 上述两类残基构成酶的活性中心上述两类残基构成酶的活性中心。(3)结构残基结构残基:它们在维持酶分子正常三维构维持酶分子正常三维构象方面象方面起重要作用。它们与酶活性相关,但不在酶活性中心范围之内,属于酶活性中心外的必需基团。 上述三类残基统称为酶的必需基团酶的必需基团,若被其它氨基酸残基取代,往往造成酶失活。(4)非贡献残基非贡献残基: 除了上述三类酶的必需基团外,酶分子上其余的氨基酸残基都可称为非
9、贡献残基或非必需基团。它们对酶活性显示不起作用,可以由其它氨基酸残基代替,且在酶分子中占很大比例。 例如,木瓜蛋白酶的三分之二的氨基酸残基是非贡献残基。当然,它们也可能在免疫、酶活性调节、运输转移、防止降解、种系发育的物种专一性等方面起作用。酶蛋白必需基团非必需基团 非贡献残基活性中心活性中心外接触残基辅助残基结构残基结合基团催化基团溶菌酶的活性溶菌酶的活性中心中心* 谷氨酸谷氨酸35和天和天冬氨酸冬氨酸52是催化是催化基团;基团;* 色氨酸色氨酸62和和63、天冬氨酸天冬氨酸101和和色氨酸色氨酸108是结是结合基团;合基团;* AF为底物多为底物多糖链的糖基,位糖链的糖基,位于酶的活性中心
10、于酶的活性中心形成的裂隙中。形成的裂隙中。底底 物物 活性中心以外活性中心以外的必需基团的必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团 活性中心活性中心 活性中心外活性中心外必需基团必需基团结合基团结合基团催化基团催化基团活性中心必需基团活性中心必需基团底物底物肽链肽链活性中心活性中心酶分子中各种残基的作用酶分子中各种残基的作用1.1.接触残基接触残基( R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164,R165)2.2.辅助残基辅助残基 ( R4 )3.3.结构残基结构残基 (Rl0、R162,R169 )4.4.非贡献残基非贡献残基 ( (R3、R5、R7 )第二节第二节 酶的分类和命名酶的分
11、类和命名l酶的分类酶的分类 按化学组成不同,酶可以分为两大类按化学组成不同,酶可以分为两大类别。别。 主要由蛋白质组成的酶称为蛋白类酶主要由蛋白质组成的酶称为蛋白类酶(P P酶)酶); 而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶类酶(R R酶)酶)。(一)蛋白类酶的分类与命名(一)蛋白类酶的分类与命名l习惯命名法习惯命名法1.1.依据底物来命名(绝大多数酶):依据底物来命名(绝大多数酶): 淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶2.2.依据催化反应的性质命名:依据催化反应的性质命名: 水解酶、转氨酶水解酶、转氨酶3.3.结合上述两个原则命名:结合上述两个原则命名
12、:琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶。4.4.有时加上酶的来源有时加上酶的来源 胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶缺点:一酶多名,写出反应难等。缺点:一酶多名,写出反应难等。l国际系统命名法(国际系统命名法(19611961年,国际酶年,国际酶学委员会)学委员会) 底物底物+ +反应性质反应性质( (类型类型)+)+酶酶 例子:乙醇脱氢酶(推荐名)例子:乙醇脱氢酶(推荐名) 乙醇:乙醇:NADNAD+ +氧化还原酶(系统名)氧化还原酶(系统名) 乙醇乙醇+NAD+NAD+ + 乙醛乙醛+NADH+H+NADH+H+ +(反应)(反应)蛋白类酶的分类原则蛋白类酶的分类原则l氧化还原酶氧化还原
13、酶(oxidoreductases)(oxidoreductases)l转移酶转移酶(transferases)(transferases)l水解酶水解酶(hydrolases)(hydrolases)l裂合酶裂合酶(lyases)(lyases)l异构酶异构酶(isomerases)(isomerases)l连接酶连接酶(ligases)(ligases)或合成酶或合成酶(synthetases)(synthetases) 国际系统分类法及编号(国际系统分类法及编号(EC编号)编号)(1)按反应性质分六大类,用1、2、3、4、5、6表示。(2)根据底物中被作用的基团或键的特点,将每一大类分为
14、若干个亚类,编号用1、2、3 。(3)每个亚类又可分为若干个亚亚类,用编号1、2、3表示。每一个酶的编号由4个数字组成,中间以“”隔开。第一个数字表示大类,第二个数字表示亚类,第三个表示亚-亚类,第四个数字表示在亚-亚中的编号。 lEC . . . 酶学委员会缩写酶学委员会缩写酶大类号酶大类号亚类号亚类号 亚类中的小类亚类中的小类 该酶在小类中的流水编号该酶在小类中的流水编号乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 EC 1.1.1.27氧化还原酶类氧化还原酶类酶学委员会缩写酶学委员会缩写氧化基团氧化基团CHOH氢受体为氢受体为NAD+流水编号流水编号1 1、氧化、氧化- -还原酶类还原酶类 Oxido-redu
15、ctasesOxido-reductasesv氧化氧化- -还原酶催化氧化还原酶催化氧化- -还原反应。还原反应。v主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(dehydrogenase)(dehydrogenase)和氧化酶和氧化酶(Oxidase)(Oxidase)。如,乳酸如,乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADHAHAH2 2 + B = A + BH + B = A + BH2 22 2、转移、转移( (移换移换) )酶类酶类 TransferasesTransferasesv转移酶催
16、化基团转移反应,即将一个底物分子的转移酶催化基团转移反应,即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。基团或原子转移到另一个底物的分子上。 例如,谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。例如,谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。 AB + C = A + BCAB + C = A + BCCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO3 3、水解酶类、水解酶类 hydrolaseshydrolasesv水解酶催化底物的加水分解反应。水解酶催化底物的加水分解反应。v主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及
17、脂酶等。v例如,脂肪酶例如,脂肪酶(Lipase)(Lipase)催化的脂的水解反应:催化的脂的水解反应:H2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OHAB + HAB + H2 2O = AOH + BHO = AOH + BH4 4、裂合(裂解)酶类、裂合(裂解)酶类 LyaseLyasel主要包括醛缩酶、水化酶(脱水酶)及脱氨酶主要包括醛缩酶、水化酶(脱水酶)及脱氨酶等。等。l裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子而形成双键的反应及其逆反应。而形成双键的反应及其逆反应。l例如,例如, 苹果酸裂合酶即延胡索酸水合酶催化苹果酸裂合酶即延胡索酸水
18、合酶催化的反应。的反应。 AB = A + BAB = A + BHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH5 5、异构酶类、异构酶类 IsomerasesIsomerasesv异构酶催化各种同分异构体的相互转化,即底异构酶催化各种同分异构体的相互转化,即底物分子内基团或原子的重排过程。物分子内基团或原子的重排过程。例如,例如,6-6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。A = BA = B6 6、合成酶类、合成酶类 Ligases or Ligases or SynthetasesSynthetasesv合成酶,又称为连接酶,能够催化合成酶,又称为连接
19、酶,能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。这类反应必须与键的形成反应。这类反应必须与ATPATP分解分解反应相互偶联。反应相互偶联。 A + B + ATP + H-O-H =AA + B + ATP + H-O-H =A- -B + ADP +PiB + ADP +Pi 例如,例如,丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶催化的反应。催化的反应。 丙酮酸丙酮酸 + + COCO2 2 草酰乙酸草酰乙酸(二)核酸类酶的分类与命名(二)核酸类酶的分类与命名l根据根据催化反应的类型催化反应的类型,可以将,可以将R R酶分为剪切酶分为剪切酶、剪接酶和多功能酶。酶、
20、剪接酶和多功能酶。l根据根据R R酶的酶的结构特点结构特点不同,可分为锤头型不同,可分为锤头型R R酶、发夹型酶、发夹型R R酶,含酶,含I I型型IVSIVS的的R R酶和含酶和含IIII型型IVSIVS的的R R酶。酶。l 核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNARNA,能够催化能够催化RNARNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。应。核酸酶(催化核酸)核酸酶(催化核酸) ribozymeribozyme33333333335555555555BBBBBPPP+POHPPBBBBPPPPPBP思考题思考题l1.1.什么
21、是酶学?什么是酶工程?什么是酶学?什么是酶工程?l2.2.酶活性中心的概念,酶分子酶活性中心的概念,酶分子中氨基酸残基或其侧链分为那中氨基酸残基或其侧链分为那四类及其各自的作用。四类及其各自的作用。l3.3.掌握蛋白类酶的分类原则。掌握蛋白类酶的分类原则。第三节、酶活的测定第三节、酶活的测定l酶活力测定是指在一定条件下,酶所酶活力测定是指在一定条件下,酶所催化的反应速度。催化的反应速度。酶活力大小酶活力大小酶反应初速度快慢酶反应初速度快慢外界条件相同外界条件相同选择底物选择底物(浓度、纯度)(浓度、纯度)确定反应条件确定反应条件(温度、(温度、pH)开始酶反应开始酶反应终止酶反应终止酶反应(测
22、定产物的(测定产物的生成量或底物的减少量)生成量或底物的减少量)酶活测定一般经过的几个步骤:酶活测定一般经过的几个步骤:终止酶反应的方法:终止酶反应的方法:l高温高温l酶变性剂酶变性剂l酸或碱酸或碱l低温低温 酶的含量和活性水平可通过特定系统的酶酶的含量和活性水平可通过特定系统的酶( (促促) )反应速度而加以测定。反应速度而加以测定。 在进行这种测定时可采用两种方式:在进行这种测定时可采用两种方式: 一、终点法;一、终点法; 二、动力学法。二、动力学法。 1.酶活力测定方法酶活力测定方法 一一 终点法终点法 这是在特定条件下,将样品中要检测的这是在特定条件下,将样品中要检测的酶作用一定量的底
23、物,然后根据反应进行酶作用一定量的底物,然后根据反应进行到某一程度到某一程度( (即达到某一指标即达到某一指标) )所需要的时所需要的时间长短来估计酶活力的一种方法。间长短来估计酶活力的一种方法。 二二 动力学法动力学法 1.1.原理原理 这种测定法的原理是,在一定的条件下,这种测定法的原理是,在一定的条件下,酶反应速度和酶浓度成正比,因此测定酶酶反应速度和酶浓度成正比,因此测定酶反应速度就可求得酶浓度反应速度就可求得酶浓度。2. 2. 反应条件反应条件 选择反应条件的基本要求是,所有待测定选择反应条件的基本要求是,所有待测定的酶分子都应该能够正常地发挥它的作用。的酶分子都应该能够正常地发挥它
24、的作用。这就是说,反应系统中除了待测定的酶浓度这就是说,反应系统中除了待测定的酶浓度是影响反应速度的唯一因素外,其它因素都是影响反应速度的唯一因素外,其它因素都应处于最适于酶发挥催化作用的水平。应处于最适于酶发挥催化作用的水平。 确定反应条件时应考虑以下因素确定反应条件时应考虑以下因素: : (1)(1)底物;(底物;(2 2)pHpH值;(值;(3 3)温度等。)温度等。 三、测定方法三、测定方法 测定方法有取样法和连续法。测定方法有取样法和连续法。 取样法取样法是在酶反应开始后不同的时间,从反应是在酶反应开始后不同的时间,从反应系统中取出一定量的反应液,并用适当的方法系统中取出一定量的反应
25、液,并用适当的方法停止其反应后,再根据产物和底物在化学性质停止其反应后,再根据产物和底物在化学性质上的差别进行分析,求得单位时间内酶促反应上的差别进行分析,求得单位时间内酶促反应变化量的方法。变化量的方法。 连续连续法则是基于底物和产物在物理化学性质上法则是基于底物和产物在物理化学性质上的不同,在反应过程中对反应系统进行直接,的不同,在反应过程中对反应系统进行直接,连续观察的方法。显然从准确性和测定效率看连续观察的方法。显然从准确性和测定效率看连续法比较好。连续法比较好。常用的一些测定方法:常用的一些测定方法: 1 1 化学法化学法 2 2 光学法光学法: (1): (1)光吸收测定法光吸收测
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