第十五章-精斑检验课件.ppt

1、 精液（斑）检验是法医学鉴定实践中的一项精液（斑）检验是法医学鉴定实践中的一项重要内容，与血痕检验占有同等重要地位，特别重要内容，与血痕检验占有同等重要地位，特别是对有关是对有关性犯罪性犯罪或有性犯罪嫌疑的案件，以及对或有性犯罪嫌疑的案件，以及对死亡性质不明的女尸死亡性质不明的女尸检查，精液（斑）的检验尤检查，精液（斑）的检验尤为重要。为重要。 精液（斑）的法医学鉴定，可为判断案件性精液（斑）的法医学鉴定，可为判断案件性质、划定侦查范围、认定或排除犯罪嫌疑人提供质、划定侦查范围、认定或排除犯罪嫌疑人提供重要线索。在亲子鉴定或其它有关性功能鉴定中，重要线索。在亲子鉴定或其它有关性功能鉴定中，有时

2、需对新鲜精液进行检验。有时需对新鲜精液进行检验。精液精液: : 男性各附属性腺分泌物所形成的复杂混合物，男性各附属性腺分泌物所形成的复杂混合物，精囊精囊液液约占约占50508080，前列腺液占，前列腺液占15153030，尿道球，尿道球腺液，尿道旁腺液约占腺液，尿道旁腺液约占5 5。精液斑：精液斑： 精液浸润或附着于基质上，干燥后形成的斑痕。精液浸润或附着于基质上，干燥后形成的斑痕。 精子精子 精液精液 精浆精浆 男性生殖细胞，含亲代遗传男性生殖细胞，含亲代遗传物质，由睾丸产生，每次射物质，由睾丸产生，每次射精大概有精大概有0.6-20.6-2亿个精子。亿个精子。细胞成分：细胞成分：精子精子、

3、睾丸细胞、白细胞、脱落柱状上皮细胞等、睾丸细胞、白细胞、脱落柱状上皮细胞等非细胞成分（非细胞成分（90%90%是水是水）：）： 无机物：水、盐类、金属离子（无机物：水、盐类、金属离子（锌锌） 有机物有机物 正常精子分正常精子分头、体、头、体、尾尾 三 部 分 ， 长 约三 部 分 ， 长 约60m，外形似蝌蚪，外形似蝌蚪,头部长头部长35m，宽，宽23m,厚厚l2m,正面观呈卵圆形，正面观呈卵圆形，侧面观呈梨形，主侧面观呈梨形，主要由顶体和致密的要由顶体和致密的精子细胞核组成。精子细胞核组成。细胞核，致密，重细胞核，致密，重要成分是要成分是DNA空泡状，含多种空泡状，含多种水解酶和糖蛋白水解酶

4、和糖蛋白线粒体鞘线粒体鞘凝固酶（精囊腺）凝固酶（精囊腺）5 5minmin内凝固成较冻状内凝固成较冻状 中性蛋白酶及纤溶酶（前列腺）中性蛋白酶及纤溶酶（前列腺）20-3020-30minmin内液化成稀薄内液化成稀薄半流动体半流动体精斑检验的目的：精斑检验的目的：为案件侦查和审理提供线索和证据。为案件侦查和审理提供线索和证据。需解决的问题：需解决的问题：斑痕是否为精斑？若是精斑，确定精斑的个体来源。斑痕是否为精斑？若是精斑，确定精斑的个体来源。精斑检验程序：精斑检验程序：肉眼检验肉眼检验预试验预试验确证试验确证试验个人识别个人识别1011床单上精液斑精斑的分布：精斑的分布： 多附着于犯罪嫌疑人

5、或被害人的衣裤、多附着于犯罪嫌疑人或被害人的衣裤、女性外阴部、大腿内侧、腹壁，偶见口腔女性外阴部、大腿内侧、腹壁，偶见口腔内、肛门。现场的被褥、草席、床板、毛内、肛门。现场的被褥、草席、床板、毛巾、纸张、沙土、丢弃的避孕套等。此外，巾、纸张、沙土、丢弃的避孕套等。此外，阴道擦拭物也是常见的精斑检材。阴道擦拭物也是常见的精斑检材。1315161718床上的精斑在紫外灯下床上的精斑在紫外灯下 肉眼检验的意义肉眼检验的意义：发现可疑精斑，确定发现可疑精斑，确定部位和分布情况，以便准确取材。部位和分布情况，以便准确取材。2021原理：原理： 精液中的酸性磷酸酶可分解磷酸苯二钠，产生精液中的酸性磷酸酶可

6、分解磷酸苯二钠，产生萘酚萘酚，后者经铁氰化钾作用并与氨基安替比林结，后者经铁氰化钾作用并与氨基安替比林结合，生成合，生成红色醌类化合物红色醌类化合物。方法：方法： 取可疑斑痕取可疑斑痕0.10.1cm（最好取斑痕边缘部位）（最好取斑痕边缘部位）置试管内，加缓冲液置试管内，加缓冲液3-4滴，滴，37温箱内温箱内5-105-10分钟分钟后，加等量显色液。后，加等量显色液。结果判定：结果判定： 阳性：阳性：立即出现红色立即出现红色，表明检材可能是精斑。，表明检材可能是精斑。 阴性：呈橙黄色，表明检材不是精斑或阴性：呈橙黄色，表明检材不是精斑或ACP被破坏。被破坏。25注意事项：注意事项：应同时剪取无

7、斑痕处检材及已知精斑作应同时剪取无斑痕处检材及已知精斑作阴性阴性和和阳性阳性对照。对照。被水洗过淡质精斑，应适当延长缓冲液浸泡时间。被水洗过淡质精斑，应适当延长缓冲液浸泡时间。怀疑为假阳性，可适当加温或延长放置时间。怀疑为假阳性，可适当加温或延长放置时间。试验灵敏度高（剪取检材顺序：试验灵敏度高（剪取检材顺序：先空白、次可疑精斑、最先空白、次可疑精斑、最后已知精斑后已知精斑）特异性较差特异性较差。原理原理：-磷酸萘酚磷酸萘酚 -萘酚萘酚 偶氮化合物（紫红色）偶氮化合物（紫红色）特点：灵敏度好，特异性差阴道液等可能呈阳性反应。特点：灵敏度好，特异性差阴道液等可能呈阳性反应。ACP固蓝固蓝B 人精

8、液中含有一些成分，与不同试剂结合，能人精液中含有一些成分，与不同试剂结合，能形成一定形态的结晶体，据此可推测精斑的存在。形成一定形态的结晶体，据此可推测精斑的存在。 但形成结晶体但形成结晶体非精液斑所特有非精液斑所特有，人体其它器，人体其它器官（肝肾）等浸出液以及其它分泌液（阴道液、官（肝肾）等浸出液以及其它分泌液（阴道液、尿液）等也可形成类似结晶。同时，精液斑尿液）等也可形成类似结晶。同时，精液斑受到受到尿液、血液等污染尿液、血液等污染时，则不出现阳性反应。时，则不出现阳性反应。结晶试验灵敏度低、特异性差，仅作为指向实验。结晶试验灵敏度低、特异性差，仅作为指向实验。 过碘胆碱过碘胆碱原理：原

9、理：精素分解产物与苦味酸生成精素苦味酸结晶精素分解产物与苦味酸生成精素苦味酸结晶（青黄色有折光的十字、柱、星形结晶）（青黄色有折光的十字、柱、星形结晶） 特点：特点：动物精液一般不出现阳性。动物精液一般不出现阳性。 原理：原理： 人体组织和体液中精液含锌量最高，精液中人体组织和体液中精液含锌量最高，精液中的锌主要来自前列腺，此法适用于无精子精斑。的锌主要来自前列腺，此法适用于无精子精斑。 特点：特点： 特异性很高，除乳汁（稀释后阴性），其它特异性很高，除乳汁（稀释后阴性），其它分泌物、体液、排泄物均呈阴性。分泌物、体液、排泄物均呈阴性。混入血迹不影混入血迹不影响响结果。结果。 预试验注意：预试

10、验注意：u除酸性磷酸酶检验外，其他各项试验灵敏度均不除酸性磷酸酶检验外，其他各项试验灵敏度均不高，预试验阴性的检材有时仍需进行确证试验。高，预试验阴性的检材有时仍需进行确证试验。u精斑不一定要经过预试验后才进行确证试验，可精斑不一定要经过预试验后才进行确证试验，可剪取肉眼可见的斑痕剪取肉眼可见的斑痕直接进行确证试验直接进行确证试验。 精斑的确证试验是检验精斑中的特有成精斑的确证试验是检验精斑中的特有成份，其阳性结果可以确证精斑。主要有三份，其阳性结果可以确证精斑。主要有三类方法：类方法：精子检出精子检出、免疫学检验免疫学检验和生物化和生物化学检验。学检验。u显微镜下观察到典型精子，即能确证人精

11、斑。检显微镜下观察到典型精子，即能确证人精斑。检出精子是认定精斑最简便、最可靠的方法，可被出精子是认定精斑最简便、最可靠的方法，可被法医实验室广泛采用。法医实验室广泛采用。u精子具有典型而稳定的形态，不易受其他因素影精子具有典型而稳定的形态，不易受其他因素影响而改变。在精斑中的精子形态相当响而改变。在精斑中的精子形态相当稳定稳定，十余，十余年的陈旧精斑也可能查见精子。镜下观察精子是年的陈旧精斑也可能查见精子。镜下观察精子是无色的，一般情况下精子头部有折光，尾部很细。无色的，一般情况下精子头部有折光，尾部很细。37正常未经染色精子形态正常未经染色精子形态3839404142HEHE染色法：染色法

12、： 苏木素染液苏木素染液 0.50.5伊红染液伊红染液 1 1盐酸酒精溶液盐酸酒精溶液镜检：精子头前半部不着色或浅染，后半部镜检：精子头前半部不着色或浅染，后半部呈蓝色，尾部红色呈蓝色，尾部红色酸性品红亚甲基蓝染色法酸性品红亚甲基蓝染色法镜检：精子头部呈红色，尾部呈蓝色镜检：精子头部呈红色，尾部呈蓝色性交后精子存活时间：性交后精子存活时间：阴道阴道 3-8h3-8h宫颈宫颈 2-52-5天天子宫、输卵管子宫、输卵管 1-101-10天天在性犯罪案件中，取阴道试子的时间越早越在性犯罪案件中，取阴道试子的时间越早越好，提取部位为阴道后穹窿。好，提取部位为阴道后穹窿。u精斑陈旧、取材部位不准或遇到少

13、精子症精斑陈旧、取材部位不准或遇到少精子症者，只要找到者，只要找到一个完整的典型精子一个完整的典型精子，即能，即能确证人精斑。确证人精斑。u精子尾部断落，常只检见精子头部，应与精子尾部断落，常只检见精子头部，应与阴道滴虫、酵母菌等鉴别。典型的精子头阴道滴虫、酵母菌等鉴别。典型的精子头部呈椭圆形，着色特殊。若发现几个部呈椭圆形，着色特殊。若发现几个典型典型的精子头部的精子头部也可确证为精斑。也可确证为精斑。48优点优点:灵敏度高灵敏度高适用于输精管结扎术者和精子缺乏症患者的精斑适用于输精管结扎术者和精子缺乏症患者的精斑方法：方法：抗人精血清沉淀反应抗人精血清沉淀反应 胶体金法胶体金法 前列腺特异

14、性抗原的检测前列腺特异性抗原的检测 ELISA法法原理：原理： 用特异性抗人精液血清与可疑精斑检材浸液作沉淀反应，用特异性抗人精液血清与可疑精斑检材浸液作沉淀反应，出现肉眼所见白色沉淀为阳性反应，证明检材含有人精液出现肉眼所见白色沉淀为阳性反应，证明检材含有人精液方法：方法：环状沉淀反应，环状沉淀反应，琼脂双向扩散试验琼脂双向扩散试验，对流免疫电泳，对流免疫电泳注意：注意：用已知人精斑作用已知人精斑作阳性对照阳性对照，检材无精斑部位作，检材无精斑部位作阴性对照阴性对照51 前列腺特异性抗原（前列腺特异性抗原（prostate specific antigen, PSA）又称又称-精浆蛋白，由人

15、类精浆蛋白，由人类前列腺前列腺上皮细胞所分泌，是成年上皮细胞所分泌，是成年男子精浆中特有的一类糖蛋白，分子量男子精浆中特有的一类糖蛋白，分子量30 000，故名，故名p30，性质稳定性质稳定，是确证精液斑的，是确证精液斑的理想标记理想标记。常用检测方法有免。常用检测方法有免疫胶体金法和疫胶体金法和ELISA。 抗抗-p30血清具有高度的种属特异性和前列腺器官特异血清具有高度的种属特异性和前列腺器官特异性，灵敏度和准确性均高于精子检出法，不受精液中无精性，灵敏度和准确性均高于精子检出法，不受精液中无精子的影响。子的影响。5354u乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶-X：仅出现于人精子：仅出现于人精子u微量元素

16、检测法微量元素检测法u抗人精子单克隆抗体免疫组化法抗人精子单克隆抗体免疫组化法56 分泌型：分泌液与体液中检出分泌型：分泌液与体液中检出ABH抗原抗原 人体液、分泌液中的人体液、分泌液中的ABH血型物质是糖蛋血型物质是糖蛋白，以水溶性形式存在，而白，以水溶性形式存在，而分泌型分泌型精液中精液中的的ABH血型物质的含量比红细胞中多且耐血型物质的含量比红细胞中多且耐热，热，非分泌型非分泌型精液中精液中ABH血型物质含量少，血型物质含量少，常规方法不易检出。常规方法不易检出。1.吸收试验吸收试验2.解离试验解离试验3.中和试验中和试验 精斑中的水溶性精斑中的水溶性ABH物质能与相应抗体特异物质能与相

17、应抗体特异性结合，使抗体与指示红细胞的凝集反应能力降性结合，使抗体与指示红细胞的凝集反应能力降低或完全消失，红细胞低或完全消失，红细胞不凝为阳性反应不凝为阳性反应，证明精，证明精斑中含有与抗体相对应的抗原斑中含有与抗体相对应的抗原。方法：方法：精斑浸出液精斑浸出液凹玻板倍比稀释至凹玻板倍比稀释至1：2048，加入效价，加入效价为为4的抗血清（的抗血清（A、B、H）各）各1滴滴室温室温30min 加加2的指示红细胞，摇匀的指示红细胞，摇匀静置静置30min 观察结果观察结果结果判定：结果判定：精液检材与基质的抑制凝集相差精液检材与基质的抑制凝集相差3级以上级以上阳性阳性60特点：特点：准确性较吸

18、收法高准确性较吸收法高可与精斑确证试验同时进行可与精斑确证试验同时进行能判断分泌能力强弱，并能区分是否是分泌型能判断分泌能力强弱，并能区分是否是分泌型检材浸出液混浊时，可水浴煮沸检材浸出液混浊时，可水浴煮沸10min10min，离心，离心，以除去蛋白、细菌、酶类等干扰以除去蛋白、细菌、酶类等干扰注意：注意：抗血清效价一定要标化，一般以抗血清效价一定要标化，一般以4 4为好。为好。4.4.酶标抗体免疫测定法酶标抗体免疫测定法 精斑的精斑的ABOABO血型测定常用直接斑点血型测定常用直接斑点ELISAELISA法、间接斑点法、间接斑点ELISAELISA法及斑点法及斑点ELISAELISA双抗夹双

19、抗夹心法，尤以直接斑点心法，尤以直接斑点ELISAELISA法操作简单，常法操作简单，常作为首选方法。作为首选方法。5.DNA5.DNA分型分型PCR-PCR-直接测序法直接测序法PCR-RFLPPCR-RFLP法法（二）精斑的血清型测定（二）精斑的血清型测定精液中的多态性蛋白：精液中的多态性蛋白：GmGm、KmKm、GCGC、血清类粘蛋白血清类粘蛋白（三）精斑的酶型测定（三）精斑的酶型测定uPGMlPGMl型测定型测定u岩藻糖苷酶型岩藻糖苷酶型u黄递酶型黄递酶型u-GGT-GGT型测定型测定磷酸葡萄糖变位酶：普通凝胶电泳可检出磷酸葡萄糖变位酶：普通凝胶电泳可检出7 7条谱带。条谱带。 黄递酶

20、型（黄递酶型（diaphorase, DIA），），DIA3仅存在于人类仅存在于人类精子和睾丸精子和睾丸中，是男性生殖细胞特有的一种遗传标记，且中，是男性生殖细胞特有的一种遗传标记，且分型不受阴道液和其它体液的影响。分型不受阴道液和其它体液的影响。精液中的精液中的DNA：精子精子、睾丸细胞、上皮细胞、睾丸细胞、上皮细胞精液精液DNA数据：数据：u每个精子含每个精子含DNA约约2.5 pguPCR分析所需精液量低于分析所需精液量低于5 ul，仅需，仅需10个精子个精子u正常成人每次射精约正常成人每次射精约35 ml，约，约0.62亿个精子亿个精子精子细胞核特点：精子细胞核特点： 大量二硫键大量二

21、硫键，能抵抗去污剂和外源性蛋白酶，能抵抗去污剂和外源性蛋白酶提取提取DNA需加入还原剂（如需加入还原剂（如DTT） 二步消化法二步消化法提取精阴混合斑精子提取精阴混合斑精子DNA。DNA提取方法：提取方法：u有机溶剂法：纯度高，损耗大有机溶剂法：纯度高，损耗大uChlelex-100法：纯度低，仅适用于法：纯度低，仅适用于PCRu其它其它69DNA IQ系统系统 Promega公司的公司的DNA IQTM系统通过系统通过独特的顺磁性树脂独特的顺磁性树脂提供了一个从各种提供了一个从各种法医样品中简易，法医样品中简易，快速，有效地定量快速，有效地定量提取纯化提取纯化DNA的方的方法法 。 Promega公司的公司的Differex 系统使用标系统使用标准的蛋白酶准的蛋白酶 K 消化并结合相分离与差速离消化并结合相分离与差速离心的方法来分离精子及上皮细胞心的方法来分离精子及上皮细胞DNA。Y染色体染色体DNA检测特点：检测特点：u男性所特有，男性所特有，Y-STR单倍型遗传单倍型遗传u检测检测Y-STR，无需分离无需分离男女成分男女成分uY-STR呈父系遗传呈父系遗传u检测检测Y-STR标记意义在于排除标记意义在于排除同一性同一性谢谢！