第二章生物制品的制备课件.ppt
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- 第二 生物制品 制备 课件
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1、 第二章第二章 生物制品的制备生物制品的制备 (Preparation) 第一节第一节 一般生物制品的制备方法一般生物制品的制备方法 (Preparation of general bio-preparate )(Preparation of general bio-preparate )一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 (Selection、pretreatment and preservation of raw material of biopreparate) (1 1)原料选择)原料选择 原料的选择原则原料的选择原则: 有效成分含量高,新
2、鲜;有效成分含量高,新鲜; 原料来源丰富,产地较近;原料来源丰富,产地较近; 原料中杂质含量少;原料中杂质含量少; 原料成本低等。原料成本低等。原料的选择注意事项:原料的选择注意事项: 植物原料生长的季节性;植物原料生长的季节性; 微生物原料的对数期;微生物原料的对数期; 动物原料的年龄与性别动物原料的年龄与性别。(2 2)原料的预处理与保存:)原料的预处理与保存: 动物原料动物原料:采集后要立即处理,去除结采集后要立即处理,去除结缔组织、脂肪组织等,并迅速冷冻贮存缔组织、脂肪组织等,并迅速冷冻贮存。植物原料植物原料:要择时采集并就地去除不用要择时采集并就地去除不用的部分,保鲜处理;的部分,保
3、鲜处理;微生物原料微生物原料:要及时将菌细胞与培养液要及时将菌细胞与培养液分开,进行保鲜处理分开,进行保鲜处理。 原料的保存方法主要有原料的保存方法主要有:冷冻法冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用该方法适用于所有生物原料。常用- -4040速速冻冻。有机溶剂脱水法有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料,如脑垂体等质没有破坏作用的原料,如脑垂体等。防腐剂保鲜防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料,如发酵液、提取液等。于液体原料,如发
4、酵液、提取液等。 二、生物制品的提取(二、生物制品的提取(extraction) (1)(1)生物组织与细胞的破碎生物组织与细胞的破碎(obtrude of tissue and cell):生物制品大部分存在于生物组织或细胞中,要):生物制品大部分存在于生物组织或细胞中,要提高提取率,破碎过程是非常重要的。常用的破碎方提高提取率,破碎过程是非常重要的。常用的破碎方法:法: 磨切法磨切法,该法属于机械破碎方法,设备有组织捣碎该法属于机械破碎方法,设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。压力法压力法,有加压、减压、渗透压三种有加压、减压
5、、渗透压三种 反复冻融法反复冻融法,设备简便,活性保设备简便,活性保持好,但用时较长持好,但用时较长。超声波振荡破碎法超声波振荡破碎法,该方法破碎该方法破碎效果较好,但由于局部发热,对效果较好,但由于局部发热,对活性有损失。活性有损失。自溶法或酶解法自溶法或酶解法,用得较少用得较少。(2 2)提取()提取(extraction) 生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时,首先要根据活性物质的性质,时,首先要根据活性物质的性质, 选择提取试剂选择提取试剂。提取试剂主要有:水、缓冲提取试剂主要有:水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂(如氯仿、丙溶液、盐
6、溶液、乙醇、其他有机溶剂(如氯仿、丙酮等)。酮等)。 考虑提取溶剂的考虑提取溶剂的用量用量及提取及提取次数次数、提取、提取时间时间。 注意提取的注意提取的温度温度、pHpH、变性剂变性剂等因素。等因素。 三、蛋白质类制品的分离纯化方法三、蛋白质类制品的分离纯化方法(Isolation and depuration of protein production) 包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有:包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有: (1)(1)沉淀法沉淀法(precipitation):):蛋白质、酶的初步纯化往往用沉蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒
7、破坏,从而沉淀蛋白质。常用淀法。原理是使蛋白质胶体颗粒破坏,从而沉淀蛋白质。常用的有盐析法(的有盐析法(salting out)、有机溶剂沉淀法()、有机溶剂沉淀法(organic solvent precipitation)、等电点沉淀法()、等电点沉淀法(isoelectric precipitation)、与)、与靶物质结合沉淀法(如抗体靶物质结合沉淀法(如抗体抗原)(抗原)(target banding precipitation)等。)等。 蛋白质蛋白质中性盐中和电荷中和电荷水化层减弱水化层减弱溶解度下溶解度下降,沉淀降,沉淀盐析法原理盐析法原理等电点沉淀法等电点沉淀法在等电点时,蛋
8、白质分子以两性离子形式存在,其分子净电荷为零(即正负电荷相等),此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥,分子相互之间的作用力减弱,其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀,所以蛋白质在等电点时,其溶解度最小,最易形成沉淀物。(2) (2) 按分子大小分离的方法按分子大小分离的方法:有有超滤法超滤法(ultrafiltration)和)和透折法透折法(d dialysis)(即)(即膜分离方法)膜分离方法)、凝胶层析法、凝胶层析法(gel chromatography)、)、超速离心法超速离心法(ultra centrifugation转速大于转速大于20 000r/min)等。等。其中膜分离
9、法可用于生物大分子物质的浓其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。缩、分级和脱盐。 凝胶层析又称分子筛层析,主要根据混合物中分子的大小和形凝胶层析又称分子筛层析,主要根据混合物中分子的大小和形状不同状不同 ,在通过凝胶时,分子的扩散速率各异而达到分离的,在通过凝胶时,分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构,小分子易进入凝胶网孔,目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构,小分子易进入凝胶网孔,流程长而移动速度慢,而大分子物质不能进入凝胶网孔,沿凝流程长而移动速度慢,而大分子物质不能进入凝胶网孔,沿凝胶颗粒间隙流动,流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。胶颗粒间隙流动,
10、流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。(3)(3)按分子所带电荷进行分离的方法按分子所带电荷进行分离的方法氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有们具有等电点等电点,在离开等电点的在离开等电点的pHpH时便会带正或时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为负电荷。例如某蛋白质等电点为7.07.0,当溶液,当溶液pHpH为为4.04.0时,分子则带有正电荷。由于具有该性质,利时,分子则带有正电荷。由于具有该性质,利用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电用带电性质进行分离是极其有效的方法。利用电学性质进行分离的方法有学性质进行分离的方法有离子交换
11、柱层析法离子交换柱层析法(ion-exchange chromatography)、)、电泳法电泳法(electrophoresis)、)、等电聚焦法等电聚焦法(isoelectric focusing)等。)等。(4 4)亲和层析法()亲和层析法(affinity chromatography)大部分生物活性物质都有其作用的靶物质,如酶与大部分生物活性物质都有其作用的靶物质,如酶与底物(或抑制剂)、抗原与抗体、激素与受体等,底物(或抑制剂)、抗原与抗体、激素与受体等,它们之间有特异的亲合作用,利用该性质设计的特它们之间有特异的亲合作用,利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。异层析分离
12、技术称为亲和层析。亲和层析亲和层析分离专一性强,操作简便,是当前应用很分离专一性强,操作简便,是当前应用很广泛的分离方法之一。广泛的分离方法之一。亲和色谱(亲和色谱(affinity chromatography) 1)基本概念()基本概念(basic concept)亲和层析亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基之间是利用待分离物质与其特异性配基之间特特异性的亲和力异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术。进行分离的一类特殊的层析技术。配基(配基(ligand) :被固定在基质上的分子称为配基,被固定在基质上的分子称为配基,配基和基质是以共价键结合的。配基和基质是以共价键结合的。基质(基质(
13、matrix):):亦称为载体(亦称为载体(vector),是构成固),是构成固定相的骨架定相的骨架 。2)亲和层析有如下特点)亲和层析有如下特点(Characteristics of Affinity Chromatography) 纯化纯化过程简单过程简单、迅速;、迅速; 分离分离效率效率高;高; 产物产物纯度纯度高;高; 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件。的层析条件。 因此应用范围受到一定的限制。因此应用范围受到一定的限制。3)亲和层析的基本原理)亲和层析的基本原理(Mechanism of Affinity Chroma
14、tography)亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为载体相连作为固定相吸附剂固定相吸附剂。当含有混合组份的样品(流动相)通过此固定相当含有混合组份的样品(流动相)通过此固定相时,只有和固定相分子有特异亲和力的物质,才能被时,只有和固定相分子有特异亲和力的物质,才能被固定相吸附结合,其它没有亲和力的无关组份就随流固定相吸附结合,其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出。动相流出。然后改变流动相成份,将结合的亲和物洗脱下来。然后改变流动相成份,将结合的亲和物洗脱下来。(见(见Fig1、Fig2)。( Fig1. Mechanism of
15、AC)(Fig2. Mechanism of AC)抗原专一抗体基质具有特异性亲和作用的生物分子具有特异性亲和作用的生物分子4)配基的种类)配基的种类 (sorts of ligand)抗原与抗体。抗原与抗体。DNA与互补与互补DNA或或RNA(cDNA、mRNA)。酶与其底物。酶与其底物。激素与其受体。激素与其受体。维生素与结合蛋白。维生素与结合蛋白。糖蛋白与植物凝集素。糖蛋白与植物凝集素。5)亲和层析载体的性质与选择)亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的选择亲和层析载体的选择(selection of vectors)多孔的立体网状结构,能使被亲和吸附的大分多孔的立体网状结构,能使被亲和
16、吸附的大分子自由通过。子自由通过。颗粒均匀,具有良好的流速。颗粒均匀,具有良好的流速。具有惰性,尽量减少非专一性吸附。具有惰性,尽量减少非专一性吸附。在温和的条件下在温和的条件下 能与配基共价偶联。能与配基共价偶联。6)常用的亲和层析载体)常用的亲和层析载体 (Vectors of Affinity Chromatography)纤维素(纤维素(cellulose)葡聚糖凝胶(葡聚糖凝胶(Sephadex)琼脂糖凝胶(琼脂糖凝胶(Sepharose)聚丙烯酰胺凝胶(聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel)多孔玻璃珠(多孔玻璃珠(Bio-Glass)其它新型载体(其它新型载体(Other gels)7)
17、亲和层析配基的选择亲和层析配基的选择(Selection of ligand)1.纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力。纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力。2.但亲和力太高也是有害的,因为在解离配但亲和力太高也是有害的,因为在解离配 基复合物时所基复合物时所 需的条件就要强烈,这样可能需的条件就要强烈,这样可能使生物分子变性。使生物分子变性。3.配基必须具有适当的化学基团,可用于和配基必须具有适当的化学基团,可用于和载体相连,同时又不影响配基与生物分子之载体相连,同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力。间的亲和力。8)载体、配基、目的物的连接)载体、配基、目的物的连接(Conjunction
18、 of vector、ligand and target material)载体(载体(Vectors or Matrix) +配基(配基(Ligand) +目的物(目的物(target material)Fig AC relies upon a reversible highly specific binding reaction.Fig Spacer arm principle A spacer is sometimes used to ensure full accessibility of the affinity ligand.Fig Principle of preparing A
19、C media9 9)亲和层析的基本操作方法:)亲和层析的基本操作方法:n平衡(平衡( Equilibration) 用平衡用平衡Buffer冲洗柱体,至基线平稳冲洗柱体,至基线平稳.样品上柱和冲洗样品上柱和冲洗(Sample application and wash) 样品中的目的物与层析介质选择样品中的目的物与层析介质选择性的吸附,杂质不被吸附。用上样性的吸附,杂质不被吸附。用上样Buffer冲洗柱体,杂质被冲洗下来。冲洗柱体,杂质被冲洗下来。形成杂质峰(见下图)。形成杂质峰(见下图)。洗脱(洗脱(Elution) 选择适当的条件,将吸附在亲和介质上的目选择适当的条件,将吸附在亲和介质上的
20、目的物解吸下来(见下图)。的物解吸下来(见下图)。四、核酸类制品的分离纯化方法四、核酸类制品的分离纯化方法(Isolation and depuration of nucleic acid )核酸类药物生产方法主要有核酸类药物生产方法主要有提取法和发酵法提取法和发酵法。提取法提取法生产生产DNADNA和和RNARNA,先提取核酸和蛋白质,先提取核酸和蛋白质复合物,再解离核酸与蛋白质,然后分离复合物,再解离核酸与蛋白质,然后分离RNARNA与与DNADNA。发酵法发酵法主要用于生产单核苷酸主要用于生产单核苷酸。高RNA含量酵母摇瓶发酵种子培养物连续发酵发酵液过滤酵母菌体NaOH20搅拌破壁氨水处
21、理离心上清液沉淀蛋白三氯乙酸酸调pH核酸粗品乙醇洗涤干燥RNA干品五、糖类制品的分离纯化方法五、糖类制品的分离纯化方法( Isolation and depuration of sugar ) 由于各种糖类制品的性质和原料来由于各种糖类制品的性质和原料来源不同,没有统一规范的提取和纯化工源不同,没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍艺。这里只介绍多糖和粘多糖多糖和粘多糖的一般分的一般分离纯化方法。离纯化方法。 (1)提取方法)提取方法 (extraction) 非降解法非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖,提取采用的溶剂是水或盐溶液提取粘多糖,提
22、取采用的溶剂是水或盐溶液。 降解法降解法(degradation)适用于从组织中提取结)适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖(合比较牢固的粘多糖(mucoitin)。如从软骨中分)。如从软骨中分离提取硫酸软骨素(离提取硫酸软骨素(chondroitin sulfate),就是),就是用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋用碱处理进行降解。又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖白质结合的多糖。 (2)分离方法)分离方法 (isolation) 常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。常用的分离方法是沉淀法和离子交换层析法。 乙醇沉淀法乙醇沉淀法(alcohol precipitation)
23、:是从提):是从提取液中沉淀多糖的最简易方法,也适用于分级取液中沉淀多糖的最简易方法,也适用于分级分离分离。4-54-5倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘的粘多糖完全沉淀。用季铵化合物也可沉淀粘多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面多糖。粘多糖的聚阴离子能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐,如十六烷基三甲活性剂结合成不溶于水的盐,如十六烷基三甲基铵(基铵(CTACTA)等)等。 离子交换层析法离子交换层析法(ion exchange chromatagraphy):粘多糖的聚阴离子能:粘多糖的聚阴离子能够很好地被阴离
24、子交换剂吸附和分离,如够很好地被阴离子交换剂吸附和分离,如Dowex I-XDowex I-X2 2(商品名)离子交换树脂、(商品名)离子交换树脂、DEAE-DEAE-离子交换纤维素(二乙胺乙基)等。离子交换纤维素(二乙胺乙基)等。洗脱可用洗脱可用NaC1NaC1溶液进行梯度洗脱。溶液进行梯度洗脱。六、脂类制品的分离纯化方法六、脂类制品的分离纯化方法 (isolation and depuration of lipoid)(1 1)提取方法()提取方法(extraction extraction ) 脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极脂类自然状态下是以结合形式存在的。非极性脂是与其他脂质分
25、子或蛋白质分子的疏水区相性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的。结合的。提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏提取脂质就是要选择适当的溶剂来破坏这种结合键,将脂质溶解出来这种结合键,将脂质溶解出来。常用的溶剂有组常用的溶剂有组合溶剂,醇是其中的主要成分,此外还有氯仿、合溶剂,醇是其中的主要成分,此外还有氯仿、甲醇、水等。甲醇、水等。 (2)纯化方法()纯化方法(depuration) 沉淀法沉淀法(precipitation) :由于不同脂质在丙:由于不同脂质在丙酮中溶解度不同,故常用它进行沉淀。酮中溶解度不同,故常用它进行沉淀。吸附层析法吸附层析法(adsorption chromat
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