聚丙烯酰胺凝胶电泳(ppt)课件.ppt

1、聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳(ppt)（优选）聚丙烯酰胺凝胶电泳（优选）聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和交联）和交联剂剂N,NN,N- -亚甲基双丙烯酰胺（亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下）在催化剂作用下合成。合成。 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有电荷效应、分子筛效应。荷效应、分子筛效应。 电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的 大小形状不同所致）大小形状不同所致）3、

2、原理、原理v（1）丙烯酰胺结构式非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）（根据蛋白质的分子量、形状、电荷来分离蛋白质）（根据亚基分子量分离蛋白质）（根据亚基分子量分离蛋白质）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 概述概述v1967年由年由Shapiro建立。建立。v1969年由年由Weber和和Osborn进一步完善。进一步完善。 他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂（入离子去污剂（SDS）以后以后,蛋白

3、质亚基的电蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小,电荷电荷因素可以忽视。因素可以忽视。基本原理基本原理1.1.蛋白质分子的解聚蛋白质分子的解聚 (1)SDS (1)SDS（十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate, SDS)阴离子去污剂阴离子去污剂变性剂变性剂助溶性试剂助溶性试剂断裂分子内和分子间的氢键断裂分子内和分子间的氢键分子去折叠分子去折叠破坏蛋白质分子的二级和三级结构破坏蛋白质分子的二级和三级结构v(2)强还原剂强还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇（巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分

4、离出的使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。谱带即为蛋白质亚基。实验原理实验原理- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -SDSSDS和还原剂的作用：和还原剂的作用：（1）分子被解聚成组成它们的多肽链）分子被解聚成组成它们的多肽链（2）氨基酸侧链与）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的充分结合形成带负电荷的蛋白质蛋白质-SDS胶束；蛋白质胶束；蛋白质-SDS胶束所带的负电荷胶束所带的负电荷达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除

5、了不同达到超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。分子之间原有的电荷差异。蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束的特点：胶束的特点：（1）形状像一个长椭圆棒）形状像一个长椭圆棒（2）短轴对不同的蛋白质亚基）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相胶束基本上是相同的同的（3）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。 胶束在胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率主要取决于系统中的电泳迁移率主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。 2. 2.凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择 由于由

6、于SDSSDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后只取决于分子解聚后SDS-SDS-蛋白质复合物的大小，因蛋白质复合物的大小，因此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。此凝胶浓度的选择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。 蛋白质的分子量在蛋白质的分子量在15-200 kD之间时，电泳迁移率之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，因此与分子量的对数呈线性关系，因此SDS-PAGE不仅不仅可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测可以分离鉴定蛋白质，还可以根据迁移率的大小测

7、定蛋白质亚基的分子量。定蛋白质亚基的分子量。3、分类、分类电泳体系中所用的缓冲液电泳体系中所用的缓冲液成分、成分、pHpH、凝胶浓度相同、凝胶浓度相同缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、pHpH、凝胶、凝胶浓度及电位梯度呈不连续性浓度及电位梯度呈不连续性不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好，不连续的凝胶电泳体系对样品的分离效果好，分辨率高，是最常用的体系。分辨率高，是最常用的体系。电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应浓缩效应：不连续性所致浓缩效应：不连续性所致连续电泳连续电泳不连续电泳不连续电泳PAGE电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应不连续不连续SDS-PAGESDS-PAGE 1. 1.原

8、理原理凝胶的不连续性凝胶的不连续性缓冲离子的不连续性缓冲离子的不连续性 pH的不连续性的不连续性电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性分离胶分离胶pH8.9浓缩胶浓缩胶pH6.7 凝胶的不连续性：凝胶的不连续性： 浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。 分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的阻力大，迁移速度减慢。由于凝胶的不连续性

9、，在大孔胶和小孔移速度减慢。由于凝胶的不连续性，在大孔胶和小孔胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。胶界面处就会使样品浓缩，取带变窄。 缓冲离子的不连续性缓冲离子的不连续性 pHpH的不连续性的不连续性 电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性制胶缓冲液：制胶缓冲液：Tris-HCl 浓缩胶浓缩胶 pH6.7 分离胶分离胶pH8.9电泳缓冲液：电泳缓冲液：Tris-甘氨酸甘氨酸 在浓缩胶中，在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少，环境呈弱酸性，甘氨酸解离少，在电场作用下泳动效率低，而在电场作用下泳动效率低，而Cl却很高，两者却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者之间形成导电性较低的

10、区带，蛋白分子介于二者之间泳动。之间泳动。 由于导电性与电场强度成反比，这一区带形由于导电性与电场强度成反比，这一区带形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。一起，浓缩为一狭窄的区带。 样品进入分离胶（样品进入分离胶（pH8.9pH8.9）后，由于胶中）后，由于胶中pHpH的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随接紧随Cl-Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。之后，样品不再受离子界面的影响。实验过程实验过程凝胶制备凝胶制备样品处理与加样样品处理与加样电泳电泳剥胶与固定剥胶与固定染

11、色与脱色染色与脱色安装电泳槽安装电泳槽实验步骤实验步骤一、制胶一、制胶 1.1.配胶配胶 配胶应根据所测蛋配胶应根据所测蛋 白质相对分子质量范白质相对分子质量范 围选择适宜的分离胶围选择适宜的分离胶 浓度。由于浓度。由于SDS-PAGESDS-PAGE 有连续体系和不连续有连续体系和不连续 体系两种，两者各有体系两种，两者各有 不同缓冲体系，因而不同缓冲体系，因而 有不同的配制方法有不同的配制方法。（以不连续体系为例）。（以不连续体系为例）蛋白质的相对分子量蛋白质的相对分子量的范围的范围分离胶的浓分离胶的浓度度10420%30%1104410415%20%4104110510%15%11055

12、1055%10%51052%5%试剂名称试剂名称配制配制20ml20ml不同浓度分离胶不同浓度分离胶所需各种试剂用量所需各种试剂用量/ml/ml配制配制10ml10ml浓缩胶浓缩胶所需试剂用量所需试剂用量5%5%7.5%7.5%10%10%15%15%3%3%分离胶贮液分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis)30%Acr-0.8%Bis)3.333.335.005.006.666.6610.0010.00- -分离胶缓冲液分离胶缓冲液（pH8.8Tris-HClpH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.502.502.502.502.50- -浓缩胶贮液浓缩胶贮液（10%Acr

13、-0.5%Bis10%Acr-0.5%Bis）- - - - -3.03.0浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液（pH6.8Tris-HClpH6.8Tris-HCl）- - - - -1.251.2510% SDS 10% SDS 0.200.200.200.200.200.200.200.200.100.101%TEMED 1%TEMED 2.002.002.002.002.002.002.002.002.002.00重蒸馏水重蒸馏水 11.8711.8710.2010.208.548.545.205.204.604.60混匀后，置真空干燥器中，抽气混匀后，置真空干燥器中，抽气10min10min10

14、%AP10%AP0.100.100.100.100.100.100.100.100.050.052.2.分离胶的制备分离胶的制备 胶灌至距梳子齿下端胶灌至距梳子齿下端1 1cmcm灌毕灌毕封上一层水加速封上一层水加速 聚合聚合当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。3.3.浓缩胶的制备浓缩胶的制备 用滤纸吸干水用滤纸吸干水倒入倒入 浓缩胶浓缩胶插入梳子插入梳子静置，聚合。静置，聚合。样品处理与加样样品处理与加样 1.1.样品处理样品处理上下槽上下槽 注入电极缓冲液注入电极缓冲液 用用 微量进样器点样微量进样器点样 接上电泳仪，上槽为负极，下槽为正极。打开接上电泳仪，

15、上槽为负极，下槽为正极。打开 开关，保持恒压进行电泳。开关，保持恒压进行电泳。 加样加样样品样品迁移迁移方向方向 电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。 不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子流程图流程图结果分析结果分析1.1.相对迁移率的计算相对迁移率的计算 相对迁移率相对迁移率mR =mR =蛋白质样

16、品距加样端迁移距离蛋白质样品距加样端迁移距离(cm)(cm)溴酚蓝区带中心距加样端距离溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)(cm)标准蛋白在标准蛋白在SDS-SDS-凝胶上的示意图凝胶上的示意图 2.2.标准曲线的绘制标准曲线的绘制 以每条以每条MarkerMarker带的相对迁移率为横坐标，相应分带的相对迁移率为横坐标，相应分 子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。如图子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。如图 分子量分子量相对迁移率相对迁移率3.3.未知蛋白质样品分子量的测算未知蛋白质样品分子量的测算 计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标准曲线计算未知蛋白质样品的相对迁移率，在标准曲线上找到对应的纵坐标，即可得该样品的分子量。上找到对应的纵坐标，即可得该样品的分子量。如图如图在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽过标准曲线求未知多肽链分子量链分子量。标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白 相对迁移率相对迁移率SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量示意图测定蛋白质分子量示意图