血液代用品资料课件.ppt

1、生物产品工艺品生物产品工艺品第八章 血液代用品第八章 血液代用品8.1 概述概述8.2 全氟碳人工血液全氟碳人工血液8.3 血红蛋白类血液代用品血红蛋白类血液代用品8.4 血液代用品的发展前景血液代用品的发展前景8.1 概述v血液的结构血液的结构 由由细胞成分细胞成分和和非细胞成分非细胞成分组成。组成。 细胞成分细胞成分：红细胞、白细胞和血小板红细胞、白细胞和血小板 非细胞成分非细胞成分：称为血浆，其中又包括胶称为血浆，其中又包括胶体成分和晶体成分。体成分和晶体成分。 血液血液血细胞血细胞红细胞红细胞白细胞白细胞血小板血小板血浆血浆 (细胞间质细胞间质)水水血浆蛋白、糖、维生素、激血浆蛋白、糖

2、、维生素、激素、代谢产物及无机盐等素、代谢产物及无机盐等常规输血的忧患常规输血的忧患8.1 概述血液代用品v定义定义 指具有指具有携带氧扩容功能的溶液携带氧扩容功能的溶液，即除了可，即除了可用于失血补充和出血休克的复苏外，在临床上用于失血补充和出血休克的复苏外，在临床上还可用于血液稀释等。还可用于血液稀释等。8.1 概述人工血液代用品v特点特点（1 1）安全安全，应无毒、无致病原、无污染、无免疫原性；，应无毒、无致病原、无污染、无免疫原性；（2 2）适合各种血型适合各种血型；（3 3）与人血液所有组分具有良好）与人血液所有组分具有良好生物相容性生物相容性，最大限度的替，最大限度的替代人血的生理

3、功能代人血的生理功能, , （具备运输氧、二氧化碳的能力具备运输氧、二氧化碳的能力，提，提供缓冲和自由基淬灭能力，可起到血浆扩容作用并维持胶供缓冲和自由基淬灭能力，可起到血浆扩容作用并维持胶体渗透压体渗透压) )；（4 4）在血管内有满意的）在血管内有满意的保留时间保留时间，代谢产物无毒并能经正常，代谢产物无毒并能经正常渠道排出；渠道排出；（5 5）贮存时间贮存时间长而所需条件低。长而所需条件低。 8.2 血红蛋白的结构和功能血红蛋白的结构和功能Hb的组成与结构的组成与结构Hb4 4条珠蛋白链条珠蛋白链：1412；1462 （共（共574个个AA） 4 4分子血红素分子血红素每条多肽链结合一个

4、血红素分子构成一个每条多肽链结合一个血红素分子构成一个HbHb单位单位 HbHb是四聚体，在红细胞中占干重的是四聚体，在红细胞中占干重的9595HbHb的组成的组成8.2 血红蛋白v 结构结构 蛋白质部分为蛋白质部分为珠蛋白珠蛋白（globin）、辅基为）、辅基为亚亚铁血红素铁血红素( (heme) ) 珠蛋白是由珠蛋白是由4条肽链组成，包括条肽链组成，包括和和亚基，亚基，形成形成22四聚体；四聚体；血红素辅基血红素辅基位于表面孔穴内，位于表面孔穴内，每个亚基一个；在每个亚基一个；在4个亚基间有一中央孔穴个亚基间有一中央孔穴: : 2,3-二磷酸甘油酸（二磷酸甘油酸（ 2,3-DPG)位于其中

5、，稳定位于其中，稳定了脱氧血红蛋白的结构了脱氧血红蛋白的结构, , O2位于其中，稳定了氧合血红蛋白的结构位于其中，稳定了氧合血红蛋白的结构。每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子二一分子氧或一分子二氧化碳，氧化碳，血红蛋白因含有血红蛋白因含有血红素血红素而而呈呈红色。红色。血红蛋白功能 血红蛋白在红细胞内能血红蛋白在红细胞内能结合氧或释放氧结合氧或释放氧； 在肺部与氧结合形成氧和血红蛋白（在肺部与氧结合形成氧和血红蛋白（HbO2），），转运到全身各组织并释放出氧。转运到全身各组织并释放出氧。 将产生的二氧化碳以碳酸盐的形式从组

6、织中运出，将产生的二氧化碳以碳酸盐的形式从组织中运出，从而完成肺和组织间从而完成肺和组织间O2和和CO2的交换。的交换。血红蛋白 对氧的亲和力v 氧解离曲线氧解离曲线 图图8-2 8-2 氧解离曲线氧解离曲线P50血红蛋白 对氧的亲和力v 机制机制Hb的变构效应的变构效应 波尔效应波尔效应 2，3-DPG的影响的影响 影响血氧亲和力的因素影响血氧亲和力的因素vH+和CO2浓度增加促进氧分子的释放(快速) Hb(H+ ) +4O2 Hb（O2）4+H+ Hb(CO2)n +4O2 Hb（O2）4+nCO2v 2，3-DPG作为别构效应物降低脱氧血红蛋白对氧的亲和力。（代谢生成，反应较慢） Hb-

7、2,3-DPG +4O2 Hb（O2）4+2,3-DPG都是通过改变血红蛋白的结构调节血氧亲和力。血红蛋白氧解离曲线血红蛋白氧解离曲线CO2pHDPG温度CO2pHDPG温度8.3 血液代用品的类型血液代用品的类型8.3.1 全氟碳人工血液v概念概念 是一种具有载氧功能的人造血，是是一种具有载氧功能的人造血，是将碳氢将碳氢化合物中的氢原子全部由氟原子代替化合物中的氢原子全部由氟原子代替，形成，形成的类环状或直链状有机化合物。的类环状或直链状有机化合物。v种类种类 全氟萘烷、全氟三丙胺、全氟三丁胺全氟萘烷、全氟三丙胺、全氟三丁胺v应用应用 用于急性贫血血液极端稀释时，以维持机用于急性贫血血液极端

8、稀释时，以维持机体组织的供氧，为输血争取时间。体组织的供氧，为输血争取时间。全氟碳化合物全氟碳化合物全氟萘烷全氟萘烷全氟碳人工血液v优点优点 无抗原性、无毒性；不依赖于过期或其它无抗原性、无毒性；不依赖于过期或其它动物的血液，易于大量生产；纯度易于控制。动物的血液，易于大量生产；纯度易于控制。 v缺点缺点（1 1）只是氧的溶解剂只是氧的溶解剂，使用时患者必须呼吸足，使用时患者必须呼吸足够的氧气才可保证氧气溶解量；够的氧气才可保证氧气溶解量；（2 2）循环时间短，高浓度使用可使血液粘度升）循环时间短，高浓度使用可使血液粘度升高；高；（3 3）存放需要合适的温度和条件；）存放需要合适的温度和条件；

9、（4 4）流感样症状。）流感样症状。 8.3.2血红蛋白类血液代用品血红蛋白类血液代用品天然血红蛋白（SFHS） v定义定义 是一种直接用是一种直接用红细胞溶解产物红细胞溶解产物来作为血液来作为血液代用品，用过期的血液来制造，去除了基质磷代用品，用过期的血液来制造，去除了基质磷脂，是一种非细胞携氧物质。脂，是一种非细胞携氧物质。 又称为又称为无基质血红蛋白无基质血红蛋白。 天然血红蛋白（SFHS）v优点优点 来源广泛、符合人体生理需要；来源广泛、符合人体生理需要； 无需进行交叉验血无需进行交叉验血、能去除病原、能去除病原、能长期储存。能长期储存。 比全氟碳化合物更符合人体生理需比全氟碳化合物更

10、符合人体生理需要，来源广泛；要，来源广泛；8.3.2血红蛋白类血液代用品血红蛋白类血液代用品样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定蛋白质提取和分离步骤蛋白质提取和分离步骤操作过程操作过程可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，分离纯化，洗涤次数不可过少。洗涤次数不可过少。1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）会使白细胞和淋巴

11、细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为的质量分数为0.90.9的氯化钠溶液洗涤。的氯化钠溶液洗涤。5 5、低速离心（低速、低速离心（低速短时间）短时间）6 6、重复、重复4 4、5 5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。表明洗涤干净。初次离心后的结果初次离心后的结果次洗涤后的结果次洗涤后的结果 加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置于置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1

12、010分钟分钟（加速细胞破裂加速细胞破裂）, ,细胞破裂释放出细胞破裂释放出血红蛋白血红蛋白。将搅拌好混合液转移到离将搅拌好混合液转移到离心管内，以心管内，以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 10 minmin。第第1 1层（最上层（最上层）：甲苯层（层）：甲苯层（无色透明无色透明）；第）；第2 2层层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色白色薄层固体薄层固体）；第）；第3 3层（中下层）：血红层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（蛋白的水溶液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉淀层（层（最下层）：杂质沉淀层（暗红暗

13、红色色）。）。用滤纸过滤，除去脂溶用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的分出下层的红色透明液体红色透明液体。 取取1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pH为为7.0），透析），透析12小时。小时。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质。利用透析袋透析利用透析袋透析装配好的凝胶柱装配好的凝胶柱正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶

14、面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的蛋白收集得到的纯化后的蛋白因SFH在血浆中很快从四聚体分解为二聚体或单体，易于通过肾脏，故其半衰期过短，仅2h-4h左右；2)SHF失去了2，3-DPG类物质的变构作用，其氧亲和力明显升高(氧离曲线P50下降)，故不利于向组织细胞释放氧；v3)因SFH可滤过至肾小管管腔，而高浓度的蛋白类物质可引起管腔堵塞，导致肾功能受损；v4)SFH具有胶体性质，在血浆中可产生胶体渗透压(COP)，在其血浆浓度与全血相同时，COP可达全血的2倍，故在常规应用时，其浓度最高只能在7 g；v (5)H

15、b易氧化成高铁Hb(MetHb)，失去携氧能力并产生自由基。血红蛋白类血液代用品血红蛋白类血液代用品图图8-3 血红蛋白的修饰方法血红蛋白的修饰方法8.3.3 化学修饰血红蛋白（第二代血液代用品）v 方法方法交联血红蛋白交联血红蛋白 聚合血红蛋白聚合血红蛋白 共轭连接血红蛋白共轭连接血红蛋白分子内交联血红蛋白分子内交联血红蛋白分子内交联分子内交联v磷酸吡哆醛(PLP)是2，3-DPG的结构类似物，可使Hb 亚基的氨基端Val吡哆醛化；v与Hb 亚基的2,3-DPG结合位点形成共价键可以降低氧亲和力；v但由此形成的四聚体不稳定。为了克服PLP的缺点。人们后来合成了含有2个吡哆醛的双醛基衍生物，降

16、低天然Hb的氧亲合力并阻止其解聚。双阿司匹林交联（双阿司匹林交联（DCL-Hb)v3，5-二溴水杨酸在与琥珀酸或延胡索酸连接后形成双阿司匹林(DBBF)，成为血红蛋白赖氨酸的氨基共价交联的碳桥。vDBBF对脱氧血红蛋白修饰效果较好，为-交联，可产生一种稳定的、高协同性和低氧亲和力的双阿司匹林交联Hb(DCL-Hb)，其功能特征与人血液很相似，多聚血红蛋白多聚血红蛋白多聚血红蛋白v采用采用戊二醛多聚化牛戊二醛多聚化牛Hb,Hb,产品：美国产品：美国BiopureBiopure公司公司的的Hemopure,Hemopure,被许可用于临床。被许可用于临床。orthfield Laboratorie

17、sorthfield Laboratories公司生产的公司生产的PolyhemePolyheme；v戊二醛聚合人血红蛋白，戊二醛聚合人血红蛋白，在制备过程中去除了大部分在制备过程中去除了大部分未聚合血红蛋白，消除了大部分不良反应；未聚合血红蛋白，消除了大部分不良反应；v缺点：原材料匮乏。缺点：原材料匮乏。共轭连接血红蛋白v将将Hb四聚体与四聚体与生物兼容性良好、能在血液循环系生物兼容性良好、能在血液循环系统中长时间停留的大分子相互连接统中长时间停留的大分子相互连接; ;v加大加大Hb的分子量，稳定四聚体的结构。的分子量，稳定四聚体的结构。v采用的采用的共轭物共轭物有聚氧乙烯有聚氧乙烯（POE

18、）、单甲氧聚氧、单甲氧聚氧乙烯乙烯(MPOE)、葡聚糖多聚糖类似物、葡聚糖多聚糖类似物、聚乙二醇聚乙二醇(PEG)等。等。v大分子聚合物大分子聚合物包裹在包裹在HbHb周围的高分子链覆盖了抗周围的高分子链覆盖了抗原位点，起到了降低免疫原性。原位点，起到了降低免疫原性。化学修饰存在的问题化学修饰存在的问题8.3.4 脂质体包封血红蛋白（第三代红细胞代用品）v思路：仿造天然红细胞，制作思路：仿造天然红细胞，制作“人工红细胞人工红细胞”v将高浓度的将高浓度的Hb包在脂质体内包在脂质体内, ,包裹于膜内的包裹于膜内的Hb的四的四聚体不易解聚，因而聚体不易解聚，因而载氧能力大，循环半衰期长，载氧能力大，

19、循环半衰期长，副作用小副作用小。v采用采用磷脂磷脂制成双分子层膜，加入制成双分子层膜，加入胆固醇胆固醇增加膜的韧增加膜的韧性和稳定性，加入性和稳定性，加入2，3-DPG降低降低Hb的氧亲和力，的氧亲和力，加入加入VE防止防止Hb的氧化。的氧化。 脂质体包封血红蛋白脂质体包封血红蛋白脂质体包封血红蛋白工艺的发展脂质体包封血红蛋白工艺的发展脂质体包封血红蛋脂质体包封血红蛋基因重组血红蛋白（基因重组血红蛋白（rHb)血液代用品发展现状（一）血液代用品发展现状（一）产品名称生产商采用技术研究进展PHP共轭物美国Apex Bioscience公司吡哆醛修饰聚氧乙烯共扼人血红蛋白I期临床HemAssist

20、美国BAXTER公司双阿司匹林交联人血红蛋白III期临床Opero美国SOMATOGEN公司基因工程交联人血红蛋白III期临床PEG-Hb美国ENZON公司PEG表面修饰牛血红蛋白II期临床Polyheme美国Northfield Lab公司戊二醛聚合人血红蛋白III期临床Hemopure美国Biopure公司戊二醛聚合牛血红蛋白已在南非上市；在美国已批准用于动物治疗；III期临床结束，已申报生产许可Hemolink加拿大HEMOSOL公司棉籽糖聚合人血红蛋白III期临床Neo red cell日本Terumo公司微囊包埋人血红蛋白III期临床血液代用品发展现状（二）血液代用品发展现状（二）P

21、176血红蛋白的制备血红蛋白的制备8.4 血液代用品的发展前景 血液代用品有广阔的应用价值和前景血液代用品有广阔的应用价值和前景v创伤治疗创伤治疗v手术期血液稀释手术期血液稀释v替代全血替代全血v作为体外循环起始循环液作为体外循环起始循环液v肿瘤治疗肿瘤治疗v用于离体器官、移植器官的保存用于离体器官、移植器官的保存v贫血的治疗贫血的治疗开环的棉籽糖交联开环的棉籽糖交联v棉子糖（三糖）经高碘酸氧化为含6个醛基的开环化合物；v进行交联。v王雁峰等报道。小结v内容内容1 1、血红蛋白的结构和功能、血红蛋白的结构和功能 2 2、全氟碳化合物、全氟碳化合物 3 3、天然血红蛋白、天然血红蛋白 4 4、血

22、红蛋白类血液代用品、血红蛋白类血液代用品v要求要求 明确血红蛋白的结构和功能；理解全氟碳明确血红蛋白的结构和功能；理解全氟碳化合物和天然血红蛋白；掌握血红蛋白类血液化合物和天然血红蛋白；掌握血红蛋白类血液代用品的制备方法及化学修饰；了解人血液代代用品的制备方法及化学修饰；了解人血液代用品的应用前景。用品的应用前景。v重点重点 血红蛋白类血液代用品的制备方法血红蛋白类血液代用品的制备方法 思考题：思考题： 血红蛋白的修饰方法有哪些？各有什血红蛋白的修饰方法有哪些？各有什么优缺点？么优缺点？ 参考文献参考文献1 1、生物技术药物生物技术药物 马大龙马大龙 科学出版社科学出版社2 2、基因工程药物基因工程药物 李元李元 化学工业出版社化学工业出版社