蛋白质纯化方法课件.ppt

1、l在外加电场作用下，带电的蛋白质颗在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（粒在电场中移动的速度（v v）取决于）取决于电场强度电场强度(E)(E)，所带的净电荷，所带的净电荷(q)(q)，蛋，蛋白质的分子量、分子形状以及与介质白质的分子量、分子形状以及与介质的摩擦系数的摩擦系数(f)(f)。l纸电泳纸电泳l醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳l聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) (可分为圆盘电泳和垂直平板电泳）可分为圆盘电泳和垂直平板电泳）l琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳lSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳l等电聚焦等电聚焦(IEF)l双向电泳双向电泳l聚丙烯

2、酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)PAGE)是利用是利用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳法，聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳法，聚丙烯酰胺凝胶是由单体聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰胺丙稀酰胺和和交联剂交联剂甲叉双丙稀酰胺甲叉双丙稀酰胺交联而成的多交联而成的多孔网状凝胶。孔网状凝胶。l不连续不连续PAGEPAGE有分离胶、浓缩胶和样品有分离胶、浓缩胶和样品胶。胶。lPAGEPAGE分辨率很高。分辨率很高。电影电影电泳过程lSDSSDS（十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠）是一种阴离子）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约链中的氨基酸残基

3、按大约1 1 1.4 1.4比例比例结合。结合。l每一个蛋白质分子都因为结合了许多每一个蛋白质分子都因为结合了许多的的SDSSDS而带有大量的负电荷，而蛋白质而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。该法主分子原有的电荷则可以忽略。该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。离蛋白质。l用已知分子量的蛋白质作为标准，则用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。可以估算出不同蛋白质的分子量。蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法l将两性电解质将两性电解质(eg:pH3-9(eg:pH3-9，pH5-7)pH5-7)同同蛋白质样品一起加

4、入到已经灌好的蛋白质样品一起加入到已经灌好的凝胶中，在电场下，两性电解质首凝胶中，在电场下，两性电解质首先达到它的等电点而平衡，蛋白质先达到它的等电点而平衡，蛋白质样品根据它自身的等电点分别向两样品根据它自身的等电点分别向两极移动，最后也达到平衡。极移动，最后也达到平衡。l等电聚焦：这种按等电点的大小，生物等电聚焦：这种按等电点的大小，生物分子在分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称焦的行为称等电聚焦等电聚焦。l等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定

5、和鉴定的目的。 银染结果银染结果考马斯亮染色为蓝色考马斯亮染色为蓝色连续电泳柱层析柱层析蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法l此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。l离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素, ,如羧甲基纤维素如羧甲基纤维素( (CMCM纤维素纤维素）等，阴离子交）等，阴离子交换纤维素换纤维素, ,如二乙基氨基乙基纤维素（如二乙基氨基乙基纤维素（DEAEDEAE纤维素纤维素）等。）等。l带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而带正电荷多

6、的蛋白质与纤维素结合较强，而带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaClNaCl溶液进溶液进行梯度洗脱，通过行梯度洗脱，通过NaNa+ +的离子交换作用，可的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。离子交换层析法离子交换层析法离子交换层析法离子交换层析法l此法又称为此法又称为分子筛层析分子筛层析。凝胶过滤所。凝胶过滤所用的介质是由交联用的介质是由交联葡萄糖葡萄糖、琼脂糖琼脂糖或或聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔

7、的网状结构。内部是多孔的网状结构。lSephadex G10-G200(Sephadex G10-G200(葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶) )lSepharose2B,4B,6B(Sepharose2B,4B,6B(琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶) )lSephacryl S100,S200,S300,S400Sephacryl S100,S200,S300,S400 ( (聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶) )蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法l这是一种这是一种高效分离纯化高效分离纯化蛋白的方法。其原理蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基

8、具有不同的识别和结合能力。特殊配基具有不同的识别和结合能力。l选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可

9、以用适当的配体洗脱液洗脱。可以用适当的配体洗脱液洗脱。l 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。脂糖凝胶等。l纯度和分子量的测定纯度和分子量的测定：采用电泳采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳）、分子（如聚丙烯酰胺凝胶电泳）、分子筛层析、高速离心、高效液相色谱筛层析、高速离心、高效液相色谱等技术测定。等技术测定。l等电点的测定等电点的测定：利用等电点时溶解利用等电点时溶解度最低或等电聚焦方法测定。度最低或等电聚焦方法测定。l亚基个数的测定亚基个数的测定：采用采用SDSSDS聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。胺凝胶电泳方法测定。