药用植物基因工程研究课件.pptx

1、植物基因工程的概念植物基因工程的概念 主要内容及相关的技术主要内容及相关的技术 药用植物基因工程研究药用植物基因工程研究 小结小结 所谓所谓植物基因工程植物基因工程，是指利用基因工程的普遍，是指利用基因工程的普遍原理和通用技术，将特定目的基因经克隆修饰后，原理和通用技术，将特定目的基因经克隆修饰后，与合适的表达元件和合适的转化载体进行重组，与合适的表达元件和合适的转化载体进行重组，进而转入植物细胞内，使之稳定整合在植物基因进而转入植物细胞内，使之稳定整合在植物基因组中正常的表达和遗传，最终改良植物的遗传性组中正常的表达和遗传，最终改良植物的遗传性状或获得有用的基因产品的方法状或获得有用的基因产

2、品的方法二、二、 分离有用目的基因的方法：分离有用目的基因的方法： PCR扩增技术、基因文库分离法、化学合成法等.mRNA差别显示技术、代表性差式分析（RDA）、和抑制性减法杂交（SSH）等是在PCR基础上建立的分离和克隆目的基因的新方法.DNA插入诱变法也称DNA 标签法是从野生型基因组DNA文库中克隆目的基因的方法，主要有两种类型：转座子标签法和T-DNA标签法，此外还有标签测序法，包括表达序列标签法和基因表达序列分析法 . 植物表达载体的构建，即对目的基因进行植物表达载体的构建，即对目的基因进行一些修饰，改造一些修饰，改造: : 5端加启动子，3端加终止子。目前最常用的启动子是从花椰菜花

3、叶病毒中分离出来的35S启动子，其次是胭脂碱和章鱼碱合成酶的NOS启动子和OCS启动子。目前最常用的终止子是胭脂碱合成酶的Nos终止子和Rubisco小亚基基因的3端区域。目的基因转入植物的方法目的基因转入植物的方法 : :一种是载体法:土壤农杆菌Ti 质粒和Ri质粒介导的遗传转化法。 例子，张荫麟等用发根农杆菌和根癌农杆菌感染丹参无菌苗，分别诱导出毛状根和冠瘿瘤，使其在无激素培养基及光照条件下分化出丹参再生植株，以发根农杆菌转化的再生植株具典型毛状根再生植物的特征，根癌农杆菌转化的再生植株株形高大，根系发达，丹参酮含量高于原植物。 另一种是直接转移法: 目前的技术有电击法、基因枪法、激光微束

4、穿孔法、显微注射法、直接注射法、脂质体介导法、细菌圆球体融和法、多聚物介导法、花粉管通道法、花粉介导法、超声波法、气枪法、涡流法等.转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定 1）遗传表型直接筛选 ：如共转化系统、位点特异性重组系统、转座子系统及MAT载体系统等.其中共转化系统中的双T-DNA载体系统是去除转基因植物中选择标记基因的一种简单有效的方法.2）依赖于重组子结构特征分析筛选3）核酸分子杂交分析为了区分转基因植物与非转基因植物，常借组报告基因，主要的报告基因有：胭脂碱合酶（NOS）、氯霉素乙酰转移酶（CAT）新霉素磷酸转移酶（NPT1）、荧光素酶（LUC）

5、和-葡萄糖甘酸酶（GUS）基因，绿色荧光蛋白（GFP）基因等.外源基因表达的检测主要是对特异性mRNA或表达蛋白的检测。 一是NPT1和GUS基因融合 二是Northern Blotting和Western Blotting分析 三是主要针对表达蛋白的检测 u转基因器官的培养转基因器官的培养 1.发状根培养发状根培养 发状根是植物受发根农杆菌感染后产生的。在感染过程中，发根农杆菌将其Ri 质粒的T-DNA上的基因转移并整合入植物基因组，这些基因表达后即产生发状根。特点： 生长速度快； 合成次生代谢产物的能力强； 可以向培养液中分泌一定的产物； 无需添加外源激素 Ri 质粒转化系统还具有如下优点

6、： 对单个的根尖培养系的研究结果表明，一个发状根是单个转化细胞的克隆体，即使它们含有多个独立的转化发状根，每个发状根的T-DNA 结构也是非常稳定的，并且单个根尖的分枝也常具有与亲本根系一样的T-DNA 组成。发状根的这种克隆性质有利于筛选和转化机制的研究。 利用Ri 质粒转移外源基因容易从发状根或愈伤组织上产生再生植株，不必除去象Ti 质粒内的一类致癌基因 应用：（1）许多有开发价值的次生代谢产物已从不同植物的发状根培养物中提取出来，有的化合物已通过发状根培养法得以工业化生产或中试生产，其中药用植物较高的有喹啉生物碱、吲哚生物碱等次生代谢产物都是重要的药用化合物。（2）发状根培养生产的次生代

7、谢产物不只限于那些正常植物的根中能够合成的物质，对于那些由植物绿色部分所合成的次生物质而言，绿色发状根更具有十分重要的意义。 2.2.冠瘿瘤和畸状茎培养冠瘿瘤和畸状茎培养 根癌农杆菌Ti 质粒的T-DNA 片段(含tms 基因、tm基因)通过根癌农杆菌感染植物，并整合进入植物细胞的基因组，诱导冠瘿瘤组织的发生。特点： 冠瘿瘤离体培养时，具有激素自主性、增殖速度较常规细胞培养快等特点，其次生代谢产物合成的稳定性与合成能力较强。 植物种类农杆菌/Ti质粒培养物代谢产物石刁柏(Asparagus officinalis Linn.)C58C1冠瘿瘤颠茄(Atropa belladonna Linn.

8、)PGV2215 (aux)畸状茎天仙子胺到茛胺的生物转化鬼针草(Bidens sp.)Ti plasmid冠瘿瘤多炔类欧洲红豆杉(Taxus baccata Linn.)B0542、C58冠瘿瘤紫杉醇及其类似物短叶红豆杉(Taxus brevifolia Nutt. )B0542、C58冠瘿瘤紫杉醇及其类似物长春花Catharanthus roseus (Linn.) G. DonTi plasmid冠瘿瘤细胞系生物碱金鸡纳树Cinchona ledgeriana (Howard)Moens ex Trim.A6冠瘿瘤细胞系丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)C58冠瘿

9、瘤醌啉生物碱辣薄荷(Mentha piperita Linn.)PTiT37畸状茎丹参酮柠檬留兰香(Mentha citrata Ehrh.)PTiT37畸状茎薄荷油三萜毛地黄(Digitalis purpurea Linn.) PTiC58、pTiB6S3冠瘿瘤薄荷油三萜羽扇豆(Lupinus micranthus Guss.) DSM30151冠瘿瘤细胞系强心甾表1 Ti 质粒转化药用植物形成的冠瘿瘤和畸状茎u 药用植物模式基因工程药用植物模式基因工程 植物基因工程的最终目的是把有用的基因转移到受体基因组，并在受体中能稳定表达和遗传。研究遗传转化技术体系及外源目的基因的表达和调控机制，需要

10、一类具有选择标记的基因，称为模式基因(model gene)或报道基因(reporter gene)。 模式基因大致可分抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶的基因2类。前者常用的有新霉素磷酸转移酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因、潮酶素磷酸转移酶基因，以及草胺膦乙酰转移酶基因等；后者有葡萄糖苷酶、萤火虫荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。应用见表。植物种类 模式基因载体 代谢产物 植株再生黄花蒿(Artemisia annua Linn.)Pnos-kanRi (pRiA46)青蒿素石刁柏(Asparagus officinalis Linn.)Nos-APHTi未确定颠茄(Atropa bel

11、ladonna Linn.)TR1-kan、TR2-gus (pGSGluc1)Ri (pRi15834)莨菪烷生物碱甜菜(Beta vulgaris Linn.)Pnos-kan (pBin19)、Pnos-hyg (pAGS125)Ri (pRi1855)Betalain pigments洋地黄(Digitalis lanata Linn.)Pnos-kan 35S-gus (pBI121)Ti (pGV2260)未确定毛地黄(D. purpurea Linn.)TR1-kan、TR2-gus (pGSGluc1)Pnos-kan、35S-gus (pBI121)Ri (pRi15834)

12、强心甾洋甘草(Glycyrrhiza glabra Linn.)Pnos-kan 35S-gus (pBI121)Ri (pRi15834)甘草甜素甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.) TR1-kan、TR2-gus (pGSGluc1)Ri (pRi15834)甘草甜素中宁枸杞(Lycium barbarum Linn.) Pnos-kanTi (pGV3850、neo1103)未确定黄花烟草(Nicotiana rustica Linn.) Pnos-kan (pBin19)、Pnos-hyg (pAGS125)Ri (pRi1855)烟碱生物碱甾枳壳Ponci

13、rus trifolliata (Linn.) Raf. Pnos-kan 35S-gusTi (pGA482GG)未确定黄岑(Scutellaria baicalensis Georgi) Ri (pRi15834)黄酮类表2 利用模式基因转化的药用植物u 通过转基因改良药用植物的遗传特性通过转基因改良药用植物的遗传特性 将一些有用的目的基因导入药用植物中，可望在短时间内实现药用植物某些遗传特性的定向改良。 1.提高抗性 通过遗传转化,将这些基因导入宿主植物以增强其抗性，这方面的研究工作已经取得了很大的进展. 2.代谢途径 在掌握次生产物代谢途径的分子机制的基础上,借助转基因技术来调节基因的

14、表达和酶的合成,可以提高目标产物的含量. (例：紫杉醇 ） 3.其它基因相关工程 在进行外源基因的植物次生代谢产物的遗传操作中，许多研究者对细胞色素P-450 基因的研究兴趣与日俱增. （绞股蓝 和烟草）u原生质体培养原生质体培养 20 世纪80 年代开始，原生质体培养已成为一个研究热点，尤其是药用植物的原生质体培养。药用植物的原生质体培养包括夹竹桃科(Apocynaceae)、五加科(Araliaceae)、紫草科(Boraginaceae)等以及单子叶植物的天南星科(Araceae)和百合科(Liliaceae)的数十种植物，我国学者在该领域也进行了较为深入的研究。 总之，基因工程这一新技

15、术在药类植物方面应总之，基因工程这一新技术在药类植物方面应用的前途是无限广阔的。用的前途是无限广阔的。 通过杂交、诱变、多倍体、试管受精、原生质融 合、花药培养等生物技术获得优质的新品种。 重组DNA技术可将植物及微生物的基因相互转移， 从而使用药用植物资源再生。 发根农杆菌感染双子叶植物形成毛状根的培养系 统 也成熟起来。因为毛状根生长迅速，遗传性稳 定， 生化特性不易改变，这对于传统药材而言更 重要。利用植物作为一个生物反应器而使外源基因表达，为传统药用植物次生代谢产物的生产提供了一条有效的新途径。随着表达效率的提高和受体植物范围的不断扩大，必定会给传统药材加入新的活力。 利用转基因技术将某些优良性状基因导入本不具备 这些性状的植物体内，可达到改良植物品种的目的， 在不久的将来有更多转基因药用植物新品种在生产 次生代谢产物方面，随着研究的不断发展，植物细 胞大规模培养即将成为一种成熟的工业化生产方式。