皮肤科细胞培养及临床应用-ppt课件共79页.ppt

1、 贴附于不起化学作用的物质(玻璃、或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和维持。 细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖。 原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。 连续传代 连续传代 连续细胞系 有限细胞系 (已建成的细胞系) 由具有某些特性与标志的细胞选择或克隆化而派生的亚系。 细胞前一次分裂结束开始至本次分裂结束所经历的时相过程。 4个时期：S期：DNA合成期 M期：有丝分裂期 G1期：有丝分裂完成至DNA合成开始的间隙期 G2期：DNA复制结束至有丝分裂开始的间隙期 G0期：某种原因导致细胞不再沿周期进行，进入 休眠状态 单个细胞两次连续分裂的时间间隔。 在对数生长期进行计算的细胞增加一倍

2、所 需要的时间。 单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体，它们的遗传特性相同。 体外培养条件下，经化学试剂、病毒或物理方法诱发，使不同体细胞融合成杂交细胞(Hybrid)。 器皿中培养的细胞彼此汇合形成单层。 从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的 培养。 细胞从一个培养器皿转移至另一个培养器皿 中培养。 单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养基 中的过程。 细胞接种到培养器皿内所形成的集落的百分率。 单个细胞 集落 克隆形成率(Cloningefficiency) 培养器皿内，每单位面积或体积中的细胞数(细 胞数/cm2)。 特定条件下，培养器皿中能达到的最高细胞数 (细胞数/cm2或细胞数/cm

3、3)。 天然培养基 合成培养基 基本培养基(通用培养基)(MEM ) 无血清培养基 无蛋白培养基 血清基本培养基(通用培养基) 完全培养基 四大类物质 无机盐 氨基酸 维生素 碳水化合物 pH指示剂 酚红 RPMI 1640 应用最广泛 DMEM 高糖型 4500g/L 葡萄糖， 低糖型 1000g/L葡萄糖 HamF12 无血清培养基常用的基础培养 基 199 培养细胞的首选培养基 常用培养基 根据细胞株特点、实验需要选择 用生长曲线、集落形成率等指标选择 严格按说明书要求添加必要成分 NaHCO3 谷氨酰胺 HEPES - 各成分顺序溶解 配制培养基用水、器皿 灭菌 分装、保存 培养基添加

4、成分培养基添加成分 NaHCO3 一般按说明书要求添加 封闭式培养用5.6%或7.4%液调节 谷氨酰胺 易降解，使用前添加 使用终浓度0.002mol/L HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸) 主要作用为防止培养基pH迅速变动 使用终浓度0.01- 0.015mol/L 小牛血清：取自出生1030天的小牛。 新生牛血清：取自出生24小时之内的新生牛。 胎牛血清：取自剖腹产的胎牛或心脏穿刺方 法获得。 提供细胞生长所需的基本营养物质。 (激素、生长因子、结合蛋白) 提供贴壁和扩展因子 (纤连蛋白,层粘连蛋白)。 对培养中的细胞提供保护作用。 抗蛋白酶成分对细胞释放的蛋白酶起中和作用 终止贴壁细胞消化

5、传代中所用胰蛋白酶的作用 血清蛋白的粘度保护悬浮培养搅拌时细胞所受的机 械损伤 改变细胞在体内的正常状态 促进某些细胞生长同时抑制另一类细胞生长。 所含物质对细胞生长的影响或毒性作用 批间成分的一致性 支原体、病毒的潜在污染性 质量鉴定报告质量鉴定报告 理化性质 微生物检测 促生长效果(培养细胞检测) 克隆形成率、贴壁率测定 连续传代培养 外观判断外观判断 透明清亮 土黄色或棕黄色 无沉淀或及少量沉淀 较粘稠 灭活处理: 56水浴, 30分钟(去除补体) 贮存条件: 分装 -20 长期贮存, 避免反复冻融 4 , 140 代)。 细胞在由葡聚糖制成的小球表面成单层生长,通过轻轻搅拌使细胞维持悬

6、浮状态。 不增加培养容器表面积或培养基容积的前提下 提高培养表面积。 省却了容器等的清洗和准备工作。 细胞与培养液的分离简单。 减少繁复的操作步骤,降低污染率。 提高产率。 葡聚糖 纤维素 聚乙烯和二氧化硅, 聚苯乙烯 明胶 单层的培养技术-皮肤组织获取和化妆品研发 培养黑素细胞-美白化妆品活性成分筛选 朗格罕细胞、和淋巴细胞共同培养 -体外筛选化妆品过敏作用 富含Merkel细胞的表皮细胞悬液培养 -局部应用药物的耐受机制研究 成纤维细胞的培养 -抗衰老化妆品活性成分开发中应用(筛选中 草药有效成分的抗衰老活性) -化妆品生理功效研究中应用 器官型培养器官型培养(气气-液体交界面培养液体交界

7、面培养) 分离、培养皮肤的,使其在体外扩增, 然后将其接种于真皮类似物上, 暴露于空气中, 使表皮正常分化, 形成类似天然表皮的复层组织(体外重建表皮)。 真皮类似物 去表皮真皮 胶原基质 惰性材料 应用应用 真皮类似物和重建表皮的组合形成具有表皮和真皮 的简化的人皮肤。 用成纤维细胞研究从表皮透过的化妆品活性物质的 生物学效应,了解表、真皮之间的相互作用。 将其他细胞(内皮细胞、白细胞)引入真皮类似层,扩大测试系统 的使用范围。皮肤器官培养皮肤器官培养 活体皮肤于体外培养，并使其保持其一定的结构和功能 。 培养方法培养方法 液体浸没的皮肤器官培养 气-液面交界的皮肤器官培养 应用应用 化妆品

8、对皮肤急性刺激毒性研究 在化妆品研发中的应用在化妆品研发中的应用 以皮肤和成纤维细胞为受试对象,寻找或筛 选具有抗衰老活性物质 ,确定该物质基本毒性情 况。 (观察对两种细胞增殖能力及活性的影响) 研究外界因素对皮肤的药理学或毒理学作用。 (如、药物及化妆品等) 将损伤作用作为模型进行化妆品的干预研究 将活的黑色素细胞引入重建真皮类似环境，作为体外皮肤美白剂的初筛模型。 光生物学研究, 如防晒剂的效果评价。 外来化学物的代谢及最初的刺激和过敏 反应。 化妆品的细胞毒性、有效性研究及局部 应用化合物(药用化妆品、表面活性剂、渗 透剂和杀菌剂等)效果评价。 以毛根鞘上皮细胞为对象, 进行护发活性物

9、质的筛选以及毛发用化妆品毒性测试研究。 皮肤三维培养皮肤三维培养(重建表皮、真皮类似物重建表皮、真皮类似物) -化妆品和洗护发产品对人体皮肤的刺激性化妆品和洗护发产品对人体皮肤的刺激性 研究研究 -重建表皮可用于研究表皮终末重建表皮可用于研究表皮终末分化以及研分化以及研 究表皮细胞分化调节物、表究表皮细胞分化调节物、表皮对刺激反应皮对刺激反应 机制；机制；化妆品经皮吸收和化妆品对屏障功 能的保护作用 -真皮类似物用来研究真皮层的组成及生理 功能 -重建表皮重建表皮+真皮类似物真皮类似物共培养系统用来研究 皮肤生理代谢、化合物的光毒性、效 应和防晒剂的作用 角质形成细胞 黑色素细胞 朗罕氏细胞

10、成纤维细胞 皮脂细胞 毒性 2,3-细胞培养 细胞形态, 细胞活性 (中性红MTT,LDH,PEG2) 美白 黑素细胞培养 黑素的生成 黑素细胞和 酪氨到酶活性 角朊细胞共培养 3-细胞培养 抗衰老 成纤维细胞培养 细胞增殖, 胶原蛋白, 角朊细胞培养 弹性蛋白, 3-细胞培养 粘多糖等的生成 以药物对特定依赖细胞的增殖或抑制、细 胞数目的增减为量效指标。 细胞增殖法 : 促进特定依赖细胞株增殖, 抑制增殖法: 抑制细胞增殖 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法(3H-TdR) 59Fe核素标记法 四氮唑盐法(MTT) 直接计数法 其他间接法 3H-胸腺嘧啶胸腺嘧啶- 3H-亮氨酸亮氨酸-培养基中掺入

11、3H-亮氨酸，根据 3H-亮 氨酸在细胞内含量测定细胞内蛋白质合 成情况 。 同位素法特点同位素法特点 揭示细胞分子水平的动态变化,是研究细胞代谢 状态的重要手段。 放射性损害。 需要特殊实验室和特殊设备。 乙酰乙酸荧光素法乙酰乙酸荧光素法 当细胞受到损伤时,细胞膜的选择通透性 屏障作用消失,利用乙酰乙酸荧光素和溴化 乙锭快速进出细胞膜受损的细胞特点。在 荧光显微镜下迅速区分受损细胞。 发光细胞活力测试发光细胞活力测试 采用一种独特的、稳定性荧光素酶来检测有活力 细胞。荧光素酶利用荧光素、氧和ATP作为反应底 物，产生氧化荧光 素，并以光的形式释放能量。由 于荧光素酶反应需要ATP，因而反应产

12、生光的总量 和反映有活力细胞数的ATP总量呈正比。产生的发 光信号和培养基中的有活力细胞数呈正比。 特点特点 适用于高通量应用，测试大批量样品可快速得到 结果。需要特殊的发光仪或CCD相机读取发光信号。 利用鞘流原理,使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单 列,按重力方向流动。细胞被激光照射后发射荧光,检测 器可逐个对细胞的荧光强度进行测定。 特点特点 对细胞测定能力为30-60万个细胞/分钟,同时可对细 胞的核酸,蛋白质酶、细胞周期分布等八种参数进行 测定。 整体动物水平 组织器官水平 细胞分子水平 细胞系的生物学特征较为一致，用于观察药物对细胞形态及生理特征的影响，判断药物疗效及其毒性。 材料用量少，药物作用机制较明确，实现大规模筛选，缩短新药筛选周期。大样本量的筛选(扩大筛选对象和范围)。 一药多筛(样品量少，珍贵药物多模型筛选， 扩大新药范围)。 计算机控制的自动化大规模筛选体系。基因工程药物 细胞工程药物 细胞的选择 敏感株 原代 细胞 性别系(株) 药物的溶解和保存 溶剂的选择 药物剂量 半效剂量(ID50) 选择合适指标粗略估算法 借用药物LD50精确计算 药物作用时间 接种后约第48小时(指数生长期) 时-效曲线 78谢谢！谢谢！79