亲和色谱精讲课件.ppt
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- 亲和 色谱 讲课
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1、4.3 4.3 亲和色谱亲和色谱( (层析层析) ) Affinity Chromatography, ACAffinity Chromatography, AC 第一节 概述原理 利用生物体中许多高分子化合物具有和某些相对应的分子可逆结合的特性建立的色谱法。一、特点 高效、高收率、有浓缩效应,使用局限性 二、应用高效从复杂混合物中得某一种物质;基于生物功能可把有活性与无活性分开三、基本过程 须找配基(它与底物专一可逆结合如下图)亲和层析过程演示亲和层析过程演示z亲和吸附剂的构成 载体(基质)、配体、连接臂说明:1.偶联用Gel(须是活化偶联介质)2.亲和吸附剂 高度专一亲和吸附剂 类专一亲和
2、吸附剂3.按相互作用力划分:次级键亲和色谱配位键螯合色谱共价键共价色谱疏水键疏水色谱亲和层析的必要条件:z 合适的配体(配基、ligand)z 合适的载体(Matrix)z 合适的吸附和洗脱条件第二节 亲和色谱配基 (ligand L) 作为配体的条件 亲和力大;具有解离平衡;与载体偶联不失活常用系统酶: 底物或类似物、辅助因子、可逆抑制剂、效应物核酸: 互补顺序、组蛋白、结合蛋白、核酸多聚物激素: 受体、运载蛋白抗体: 抗原、病毒、细胞外源凝集素: 多糖、糖蛋白、细胞亲和层析常用配体配体目标分子配体目标分子5-AMPNAD依赖性脱氢酶、ATP依赖性激酶Poly(U)真核mRNA、Poly(U
3、)结合蛋白ATPATP依赖性激酶凝集素糖蛋白NADNAD依赖性脱氢酶蛋白质A/蛋白质GIgG或IgG对应抗原NADPNADP依赖性脱氢酶苯基硼酸盐糖蛋白钙调蛋白钙依赖性酶Cibacron Blue F3G-ANAD(P)依赖性脱氢酶、激酶、磷酸酶、白蛋白、干扰素肝素某些凝固蛋白、血浆蛋白、脂蛋白、核酸相关酶、受体等Procion Red HE-3BNAD(P)依赖性脱氢酶、干扰素、抑制蛋白、纤溶酶原单克隆抗体特定抗原赖氨酸纤溶酶、纤溶酶原、纤溶酶原激活剂过渡金属离子含组氨酸的多肽或蛋白质 配体的浓度z 一般使用较高的固定化配体浓度一般使用较高的固定化配体浓度z 配体亲和力高,且本身带电则浓度须
4、降低配体亲和力高,且本身带电则浓度须降低z 配体浓度过高引起色谱畸变。配体浓度过高引起色谱畸变。 (与很多物质发生非特异性结合与很多物质发生非特异性结合) 配体的选择配体的选择 1. 考虑亲和势L + S LSKl= LS/LS要求Kl在10-410-8mol/L之间 2. 与L的偶联不破坏L与S的结合 3. 需了解L-S的作用机制 如 z例:酶例:酶 有单底物反应、双底物反应有单底物反应、双底物反应z单单 A P E E EA EP 底物A、产物P或它们的类似物都可以双底物依次双底物依次z A B P Q E E EA EAB EPQ EQ 须选择A、若选B则吸附时须加A双底物随机双底物随机
5、z A(B) B(A) P(Q) Q(P) E E EA EA(B) EPQ A、B都可选择 对A、B的选择仅取决于它们亲和势的大小和固定化的难易程度。第三节第三节 亲和层析载体亲和层析载体一、作为载体的条件一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好二、载体的选择二、载体的选择 1.琼脂糖凝胶: 亲水性强,理化性质稳定 (商品名:Sepharose) 2.聚丙烯酰胺凝胶: 理化性质稳定,耐有机溶剂及去污剂, 抗微生物能力强, 特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。3.葡聚糖凝胶: 有良好的化学及物理性质,孔径小。 4.纤维素: 非特异吸附严重,廉价
6、,易得。 5.多孔玻璃 :物理性能好,有非特异性吸附。 三、手臂(Spacer arm) 在载体和配基间引入适当长度的“手臂”,减少载体的空间阻碍,增加配基的活动度。示意图如下: z连接臂往往为由烃链组成的疏水性手臂疏水性手臂(其长短对吸附的影响大)或具氨基、羧基的亲水性手臂亲水性手臂(其长短对吸附的影响不大);z疏水性手臂具体选择应考虑: 分离物质分子量大小 亲和势大小 过长手臂易弯曲、折叠等;z最常用的连接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和3,3-二氨基二丙胺。 接有连接臂的亲和层析用载体接有连接臂的亲和层析用载体载体连接臂供应商琼脂糖3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基Bio-Rad3,3-二氨
7、基丙基和琥珀酰二氨基丙基Bio-Rad1,2-二氨基乙烷, 1-二氨基己烷, 3,3-二氨基二丙胺ICN1,6-己二胺, 6-氨基己酸Pharmacia3,3-二氨基丙基胺, 对苯甲酰基-3,3-二氨基丙基胺Serva氨基烷基(2,4,6,8,10)Miles聚丙烯酰胺-琼脂糖1,6-己二胺, 6-氨基己酸IBF多孔玻璃氨基丙基, 氨基己基Merck 第四节第四节 亲和吸附剂的制备亲和吸附剂的制备 一、要求 . L与基质结合,对L-S结合无干扰; . L为小分子有的需“手臂”,使L-S结 合更有效; . 非专一吸附不大,以免吸附杂质; L与基质结合稳定(吸附、洗脱、再生)。 二、二、 偶联用偶
8、联用GelGel的选择的选择 需考虑: . L上可供偶联的基团 . “手臂” . L的稳定pH 三、三、 由由CNBr活化型活化型Sep.4B制备制备 商品名:CNBr-Sepharose一般步骤:一般步骤:冻干粉 溶胀洗涤 混合反应 掩蔽 溶解L 洗去L(未结合) 成品 . 溶胀和洗涤 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子 . 偶联条件注意: 前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH. 掩蔽 偶联后有部分氰酸酯未偶联上L,常利用含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理,将其掩蔽。. 洗去未结合L用高-低交叉pH来洗(45次) 亲和吸附剂的制备过程 封闭未反应的活化基团z 载体上活化基团浓度
9、525mol/ml z 偶联上的配体浓度 110mol/mlz 封闭试剂 pH8.0,1mol/L乙醇胺 甘氨酸 巯基乙醇 室温反应1h配体浓度评估配体浓度评估z 差示分析法 z 直接测定法 z 放射分析法 z 水解法 连接臂的连接连接臂的连接z 连接臂先接配体后偶联至载体z 连接臂先偶联至载体后接配体 四、四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备Sep-(CH2)6-NH2 L-COOH AH-SepSep-(CH2)6-COOH L-NH2 CH-Sep碳二亚胺法(配基偶联的一种方法): 琼脂糖等多糖类载体z溴化氰法 最常使用,简单温和,活化效率高,速度快;反应可逆,剧毒,可能带上电荷z双环
10、氧法(p140-145) 产生亲水连接臂,不带电荷,稳定,偶联配体数量少于溴化氰法z二乙烯砜法反应性能强,适合于偶联羟基配体;剧毒,昂贵zN,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯法 稳定,不带电荷z有机磺酰氯法 对甲苯磺酰氯、三氟代乙磺酰氯 可释放生色基团,可用于监测偶联反应z碳化二亚胺交联法其他方法z羰基二咪唑(CDI)法z高碘酸盐法z磺化氟甲基吡啶鎓法zN-羟基琥珀酰亚胺法其他亲和吸附剂z聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固定到其活化基团上;z硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载体引入氨基或环氧基团.z戊二醛法 OHC(CH2)
11、3CHO 与载体酰胺基团结合,并与配体氨基结合 简单、便宜、稳定,引入连接臂,有中等毒性z肼解法 -CONH2 CONHNH2 CON3 CONH-LNH2NH2NaNO2L-NH2 类专一性亲和吸附剂 . 固定化凝集素(本质是蛋白质)可用来分离糖、糖蛋白 如 . 固定化多聚核苷酸可用来分离NA、核蛋白 如 . 染料亲和吸附剂以染料为配基,用来分离酶类、干扰素等 第五节第五节 一般实验方法一般实验方法是否有类专一吸附剂 有 溶胀Gel 无 选L 选偶联Gel 偶联L 装柱安装仪器安装仪器 平衡(平衡(23Vt) 加样吸附加样吸附 洗去非吸附物洗去非吸附物亲和柱亲和柱 洗脱液洗脱液 再生再生 脱
12、盐脱盐 一、亲和吸附柱的预备 . 亲和吸附剂选择或制备 效能小试:据资料等先选择始缓冲液种类、I、pH、t . 用10Vt始缓洗,若目的物未流出,说明吸附性能好,0.9 . 不断加样到目的物流出,确定吸附容量 . 柱 H/D 高度专一 短 类专一 长 平衡 一般23Vt始缓 二、二、 加样吸附 . 样品平衡(透析或SephadexG-25). 样品体积Vs(一般5%) 若结合紧密,Vs可较大;不紧,Vs要小. 洗去非吸附物(10Vt始缓洗) 三、洗脱(以S不变性为前提) 类专一:选择性洗脱、有分级分离要求、梯度或阶式洗脱。 样品准备 加样前样品应当澄清,不含颗粒状物质,有适当的pH值、离子强度
13、以利于目标分子的结合z离心(10000rpm)或过滤(0.45或0.22m滤膜)除去不溶物z对复杂样品如组织细胞、植物材料、发酵产物,应预处理,如超声破碎、溶解、均质、抽提、过滤、离心等z盐析、离子交换层析z透析或凝胶过滤完成脱盐、缓冲液交换加样吸附z目标分子与配体形成复合物而吸附在层析柱上z起始缓冲液的选择:配体-目标分子作用类型 疏水键,提高离子强度,不要采用低温操作;离子键,降低离子强度z流速:低压亲和层析,流速50cm/h;高效液相亲和层析,流速50125cm/h。若结合力弱,应降低流速z加样量:不超过亲和吸附剂的吸附容量洗去杂蛋白z5倍床体积的起始缓冲液洗去未吸附物质,直至紫外纪录曲
14、线回到基线z亲和柱上存在较多的非特异性吸附,而目标分子结合牢固,可选用介于起始缓冲液和洗脱缓冲液之间的条件洗杂蛋白z例:起始缓冲液 0.05mol/L磷酸缓冲液 洗脱缓冲液 含1mol/L NaCl的磷酸缓冲液可用含0.5 1mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗去杂蛋白洗脱z专一性洗脱和非专一性洗脱非专一性洗脱z改变缓冲液的离子强度 配体与目标分子间如果是 离子作用:升高离子强度 疏水作用:降低离子强度 离子强度变化方式:阶段式、梯度式z改变缓冲液的pH值 改变表面带电基团的电性和电量,从而破坏离子键 阶段式为主 z改变缓冲液的极性 配体和目标分子依靠较强的疏水作用结合时,可以往洗脱液中添加一定
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