双荧光素酶系统实验操作步骤及方法-.ppt课件.ppt

1、双荧光素酶报告系统报告基因报告基因 (reporter gene):(reporter gene):是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。 一般的，把报告基因的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控。u在动物基因表达调控的研究中，报告基因被广泛应用。如绿色荧光蛋白(GFP）和荧光素酶。一、概述荧光素酶（荧光素酶（LuciferaseLuciferase）：是能够催化不同底物氧化发光的一类酶的统称，哺乳细胞无内源性荧光素酶。荧光素酶报告基因的优点荧光素酶报告基因的优点u蛋白

2、不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性。u在所有的化学发光反应中，它的光产物具有最高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光。u检测快速，每个样品只需几秒钟。 构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。二、实验原理 利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因（firefly luciferase）的上游，LUC 启动子细胞内目的基因的转录被激活未处理对照刺激物处理启动子-L

3、uc转染细胞启动子-Luc的启动子被激活Luc的转录Luc表达量测得的荧光值同时，为了减少内在的变化因素（如：培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）对实验准确性的影响，将带有海肾荧光素酶基因（Rinilla luciferase）的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共转染细胞，提供转录活力的内对照，使测试结果不受实验条件变化的干扰。在测量过程中，当加入荧光素酶检测试剂II (LARII)时产生萤火虫荧光信号，这样先测量萤火虫荧光素酶报告基因。定量萤火虫荧光强度之后，再在同一样品中加入Stop & Glo 试剂，将上述反应淬灭，并同时启动海肾荧光素酶反应，同时进行第二

4、次测量。A检测前相关试剂配制检测前相关试剂配制 1. 1X PLB裂解缓冲液配制：将4体积水或PBS加入1体积5X PLB裂解缓冲液。（使用前在室温平衡1X 缓冲液，平衡需2-3 min）。 2. Luciferase Assay Reagent II (LAR II) 配制：将Luciferase Assay Buffer II加入Luciferase Assay Substrate充分混合后，分装，置于-20避光保存。（一次配好，分装成小管，避免反复冻融），使用前将配好的LAR II从-20拿出，并平衡至室温（需20-30min）。三、操作程序与结果判定 3. Stop & Glo Rea

5、gent配制：现用现配，先将Stop & Glo Buffer放在37度温箱中平衡至室温（15-30min），再将1倍体积的50X Stop & Glo Substrate加入49倍体积的将Stop & Glo Buffer中。B样品制备样品制备1. 仔细地将生长培养基从待检细胞孔中吸出。用1XPBS漂洗细胞2-3次。此过程必须仔细，并尽量将漂洗用PBS 吸尽（防止细胞掉落）防止细胞掉落）。2. 24 孔板每孔加入100-150l 1X 裂解缓冲液PLB以覆盖细胞。然后将24孔板置摇床振摇20-30min以保证裂解缓冲液完全裂解细胞。C C双荧光素酶检测（双荧光素酶检测（Promega GLO

6、MAXPromega GLOMAX） ( (注：系统运行时请勿触摸操作屏注：系统运行时请勿触摸操作屏) )1. 重新设定系统：Tools Settings Reset2. 双荧光素酶检测程序的设定： Protocols Run Promega Protocol DLR-O-INJ OK3.将50l LAR II加入1.5ml EP管中（专用的进口EP管），取10l 细胞裂解液加入装有LAR II的1.5ml EP管中，吹打2-3次混匀（尽量不要吹出气泡），置于检测仪，点击“Measure” 开始读数（为萤火虫荧光素酶反应强度）。（使用前LAR II要混匀，并平衡到室温）4. 测量结束后，取出E

7、P管，再加入50l Stop & Glo Reagent，吹打2-3次混匀（尽量不要吹出气泡），再次置于检测仪，点击“Measure” 开始读数（为内参海肾荧光素酶反应强度）。（Stop & Glo Reagent 现配现用，不能保存）5. 记录读数: 每个样品会有3个数值：RLU1萤火虫荧光素酶反应强度, RLU2内参海肾荧光素酶反应强度, RatioRLU1/ RLU2。一般记录Ratio 值即可，但RLU1 和RLU2为实际荧光强度值，可以反映细胞的转染效率，也可根据实际荧光强度来调整报告质粒与内参的比例。6. 测量完毕后，请将最后检测的EP管取出后，关闭仪器。7. 实验结果的处理与分析

8、：采用双样本等方差t检验进行处理，P0.05为差异显著，P0.01为差异极显著。四、注意事项四、注意事项由于温度对酶反应有影响，所以测定时样品和试剂均需达 到室温后再进行测定。Renilla荧光素酶检测工作液后需配制后立即使用，不可配制成工作液后长期保存。Luciferase Assay Reagent II (LAR II)不能反复冻融，保证每次用同一批次的LAR II。配好的LAR II在-20 度可稳定一个月，在-70度 可稳定一年。试剂保存和使用时都应避光。为取得最佳测定效果，测定时，样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制在相同时间内（1-2秒）。使用过程中切勿接触操作屏（程序会

9、被终止或取消）。平时尽量不要移动仪器，防止触摸屏走位。Thanks For Your Attention历史岳麓版第13课交通与通讯的变化资料精品课件欢迎使用自读教材自读教材填要点填要点 一、铁路，更多的铁路一、铁路，更多的铁路 1地位地位 铁路是铁路是 建设的重点，便于国计民生，成为国民经济建设的重点，便于国计民生，成为国民经济发展的动脉。发展的动脉。 2出现出现 1881年，中国自建的第一条铁路年，中国自建的第一条铁路唐山唐山 至胥各庄铁至胥各庄铁路建成通车。路建成通车。 1888年，年，宫廷宫廷专用铁路落成。专用铁路落成。交通运输交通运输开平开平 3发展发展 (1)原因：原因： 甲午战争

10、以后列强激烈争夺在华铁路的甲午战争以后列强激烈争夺在华铁路的 。 修路成为中国人修路成为中国人 的强烈愿望。的强烈愿望。 (2)成果：成果：1909年年 建成通车；民国以后，各条商路修筑建成通车；民国以后，各条商路修筑权收归国有。权收归国有。 4制约因素制约因素 政潮迭起，军阀混战，社会经济凋敝，铁路建设始终未入政潮迭起，军阀混战，社会经济凋敝，铁路建设始终未入正轨。正轨。修筑权修筑权救亡图存救亡图存京张铁路京张铁路 二、水运与航空二、水运与航空 1水运水运 (1)1872年年, 正式成立，标志着中国新式航运业的诞生。正式成立，标志着中国新式航运业的诞生。 (2)1900年前后，民间兴办的各种

11、轮船航运公司近百家，几乎都是年前后，民间兴办的各种轮船航运公司近百家，几乎都是在列强排挤中艰难求生。在列强排挤中艰难求生。 2航空航空 (1)起步：起步：1918年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始年，附设在福建马尾造船厂的海军飞机工程处开始研制研制 。 (2)发展：发展：1918年，北洋政府在交通部下设年，北洋政府在交通部下设“ ”；此后十年间，航空事业获得较快发展。；此后十年间，航空事业获得较快发展。轮船招商局轮船招商局水上飞机水上飞机筹办航空事宜筹办航空事宜处处 三、从驿传到邮政三、从驿传到邮政 1邮政邮政 (1)初办邮政：初办邮政： 1896年成立年成立“大清邮政局大清邮政局”

12、，此后又设，此后又设 ，邮传正式脱离海关。邮传正式脱离海关。 (2)进一步发展：进一步发展：1913年，北洋政府宣布裁撤全部驿站；年，北洋政府宣布裁撤全部驿站；1920年，中国首次参加年，中国首次参加 。邮传部邮传部万国邮联大会万国邮联大会 2电讯电讯 (1)开端：开端：1877年，福建巡抚在年，福建巡抚在 架设第一条电报线，成为中国自架设第一条电报线，成为中国自办电报的开端。办电报的开端。 (2)特点：进程曲折，发展缓慢，直到特点：进程曲折，发展缓慢，直到20世纪世纪30年代情况才发生变年代情况才发生变化。化。 3交通通讯变化的影响交通通讯变化的影响 (1)新式交通促进了经济发展，改变了人们

13、的通讯手段和新式交通促进了经济发展，改变了人们的通讯手段和 ， 转变了人们的思想观念。转变了人们的思想观念。 (2)交通近代化使中国同世界的联系大大增强，使异地传输更为便交通近代化使中国同世界的联系大大增强，使异地传输更为便捷。捷。 (3)促进了中国的经济与社会发展，也使人们的生活促进了中国的经济与社会发展，也使人们的生活 。台湾台湾出行出行方式方式多姿多彩多姿多彩合作探究合作探究提认知提认知 电视剧电视剧闯关东闯关东讲述了济南章丘朱家峪人朱开山一家，讲述了济南章丘朱家峪人朱开山一家，从清末到九一八事变爆发闯关东的前尘往事。下图是朱开山从清末到九一八事变爆发闯关东的前尘往事。下图是朱开山一家从

14、山东辗转逃亡到东北途中可能用到的四种交通工具。一家从山东辗转逃亡到东北途中可能用到的四种交通工具。 依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。依据材料概括晚清中国交通方式的特点，并分析其成因。 提示：提示：特点：新旧交通工具并存特点：新旧交通工具并存(或：传统的帆船、独轮车，或：传统的帆船、独轮车， 近代的小火轮、火车同时使用近代的小火轮、火车同时使用)。 原因：近代西方列强的侵略加剧了中国的贫困，阻碍社会发原因：近代西方列强的侵略加剧了中国的贫困，阻碍社会发展；西方工业文明的冲击与示范；中国民族工业的兴起与发展；展；西方工业文明的冲击与示范；中国民族工业的兴起与发展；政府及各阶层人士

15、的提倡与推动。政府及各阶层人士的提倡与推动。串点成面串点成面握全局握全局 一、近代交通业发展的原因、特点及影响一、近代交通业发展的原因、特点及影响 1原因原因 (1)先进的中国人为救国救民，积极兴办近代交通业，促先进的中国人为救国救民，积极兴办近代交通业，促进中国社会发展。进中国社会发展。 (2)列强侵华的需要。为扩大在华利益，加强控制、镇压列强侵华的需要。为扩大在华利益，加强控制、镇压中国人民的反抗，控制和操纵中国交通建设。中国人民的反抗，控制和操纵中国交通建设。 (3)工业革命的成果传入中国，为近代交通业的发展提供工业革命的成果传入中国，为近代交通业的发展提供了物质条件。了物质条件。 2特

16、点特点 (1)近代中国交通业逐渐开始近代化的进程，铁路、水运和近代中国交通业逐渐开始近代化的进程，铁路、水运和航空都获得了一定程度的发展。航空都获得了一定程度的发展。 (2)近代中国交通业受到西方列强的控制和操纵。近代中国交通业受到西方列强的控制和操纵。 (3)地域之间的发展不平衡。地域之间的发展不平衡。 3影响影响 (1)积极影响：促进了经济发展，改变了人们的出行方式，积极影响：促进了经济发展，改变了人们的出行方式，一定程度上转变了人们的思想观念；加强了中国与世界各地的一定程度上转变了人们的思想观念；加强了中国与世界各地的联系，丰富了人们的生活。联系，丰富了人们的生活。 (2)消极影响：有利

17、于西方列强的政治侵略和经济掠夺。消极影响：有利于西方列强的政治侵略和经济掠夺。1李鸿章李鸿章1872年在上海创办轮船招商局，年在上海创办轮船招商局，“前前10年盈和，成年盈和，成为长江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立为长江上重要商局，招商局和英商太古、怡和三家呈鼎立之势之势”。这说明该企业的创办。这说明该企业的创办()A打破了外商对中国航运业的垄断打破了外商对中国航运业的垄断B阻止了外国对中国的经济侵略阻止了外国对中国的经济侵略C标志着中国近代化的起步标志着中国近代化的起步D使李鸿章转变为民族资本家使李鸿章转变为民族资本家解析：解析：李鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家；李

18、鸿章是地主阶级的代表，并未转化为民族资本家；洋务运动标志着中国近代化的开端，但不是具体以某个企业洋务运动标志着中国近代化的开端，但不是具体以某个企业的创办为标志；洋务运动中民用企业的创办在一定程度上抵的创办为标志；洋务运动中民用企业的创办在一定程度上抵制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故制了列强的经济侵略，但是并未能阻止其侵略。故B、C、D三项表述都有错误。三项表述都有错误。答案：答案：A 二、近代以来交通、通讯工具的进步对人们社会生活的影二、近代以来交通、通讯工具的进步对人们社会生活的影响响 (1)交通工具和交通事业的发展，不仅推动各地经济文化交交通工具和交通事业的发展，不仅推动各地

19、经济文化交流和发展，而且也促进信息的传播，开阔人们的视野，加快流和发展，而且也促进信息的传播，开阔人们的视野，加快生活的节奏，对人们的社会生活产生了深刻影响。生活的节奏，对人们的社会生活产生了深刻影响。 (2)通讯工具的变迁和电讯事业的发展，使信息的传递变得通讯工具的变迁和电讯事业的发展，使信息的传递变得快捷简便，深刻地改变着人们的思想观念，影响着人们的社快捷简便，深刻地改变着人们的思想观念，影响着人们的社会生活。会生活。2清朝黄遵宪曾作诗曰：清朝黄遵宪曾作诗曰：“钟声一及时，顷刻不少留。虽钟声一及时，顷刻不少留。虽有万钧柁，动如绕指柔。有万钧柁，动如绕指柔。”这是在描写这是在描写 ()A电话

20、电话 B汽车汽车C电报电报 D火车火车解析：解析：从从“万钧柁万钧柁”“动如绕指柔动如绕指柔”可推断为火车。可推断为火车。答案：答案：D典题例析典题例析 例例1上海世博会曾吸引了大批海内外人士利用各种上海世博会曾吸引了大批海内外人士利用各种交通工具前往参观。然而在交通工具前往参观。然而在19世纪七十年代，江苏沿江世纪七十年代，江苏沿江居民到上海，最有可能乘坐的交通工具是居民到上海，最有可能乘坐的交通工具是 () A江南制造总局的汽车江南制造总局的汽车 B洋人发明的火车洋人发明的火车 C轮船招商局的轮船轮船招商局的轮船 D福州船政局的军舰福州船政局的军舰 解析解析由材料信息由材料信息“19世纪七

21、十年代，由江苏沿江居民世纪七十年代，由江苏沿江居民到上海到上海”可判断最有可能是轮船招商局的轮船。可判断最有可能是轮船招商局的轮船。 答案答案C题组冲关题组冲关1中国近代史上首次打破列强垄断局面的交通行业是中国近代史上首次打破列强垄断局面的交通行业是 ()A公路运输公路运输 B铁路运输铁路运输C轮船运输轮船运输 D航空运输航空运输解析：解析：根据所学根据所学1872年李鸿章创办轮船招商局，这是洋务年李鸿章创办轮船招商局，这是洋务运动中由军工企业转向兼办民用企业、由官办转向官督商运动中由军工企业转向兼办民用企业、由官办转向官督商办的第一个企业。具有打破外轮垄断中国航运业的积极意办的第一个企业。具

22、有打破外轮垄断中国航运业的积极意义，这在一定程度上保护了中国的权利。据此本题选义，这在一定程度上保护了中国的权利。据此本题选C项。项。答案：答案：C2. 右图是右图是1909年年民呼日报民呼日报上登载的上登载的一幅漫画，其要表达的主题是一幅漫画，其要表达的主题是( )A帝国主义掠夺中国铁路权益帝国主义掠夺中国铁路权益B西方国家学习中国文化西方国家学习中国文化C西方列强掀起瓜分中国狂潮西方列强掀起瓜分中国狂潮D西方八国组成联军侵略中国西方八国组成联军侵略中国解析：解析：从图片中可以了解到各国举的灯笼是火车形状，从图片中可以了解到各国举的灯笼是火车形状，20世纪初的这一幅漫画正反映了帝国主义掠夺中

23、国铁路世纪初的这一幅漫画正反映了帝国主义掠夺中国铁路权益。权益。B项说法错误，项说法错误，C项不能反映漫画的主题，项不能反映漫画的主题，D项时项时间上不一致。间上不一致。答案：答案：A典题例析典题例析 例例2(2010福建高考福建高考)上海是近代中国茶叶的一个外销上海是近代中国茶叶的一个外销中心。中心。1884年，福建茶叶市场出现了茶叶收购价格与上海出年，福建茶叶市场出现了茶叶收购价格与上海出口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事业是口价格同步变动的现象。与这一现象直接相关的近代事业是 () A电报业电报业 B大众报业大众报业 C铁路交通业铁路交通业 D轮船航运业轮船航运业 解析解析

24、材料主要反映了信息交流的快捷，故选材料主要反映了信息交流的快捷，故选A。 答案答案A题组冲关题组冲关3假如某爱国实业家在假如某爱国实业家在20世纪初需要了解全国各地商业信世纪初需要了解全国各地商业信息，可采用的最快捷的方式是息，可采用的最快捷的方式是 ()A乘坐飞机赴各地了解乘坐飞机赴各地了解 B通过无线电报输送讯息通过无线电报输送讯息C通过互联网通过互联网 D乘坐火车赴各地了解乘坐火车赴各地了解解析：解析：本题考查中国近代物质生活的变迁。注意题干信本题考查中国近代物质生活的变迁。注意题干信息息“20世纪初世纪初”“最快捷的方式最快捷的方式”，因此应选，因此应选B，火车速度，火车速度远不及电报

25、快。远不及电报快。20世纪世纪30年代民航飞机才在中国出现，年代民航飞机才在中国出现，互联网出现在互联网出现在20世纪世纪90年代。年代。答案：答案：B4下列不属于通讯工具变迁和电讯事业发展影响的是下列不属于通讯工具变迁和电讯事业发展影响的是()A信息传递快捷简便信息传递快捷简便B改变着人们的思想观念改变着人们的思想观念C阻碍了人们的感情交流阻碍了人们的感情交流D影响着人们的社会生活影响着人们的社会生活解析：解析：新式通讯工具方便快捷，便于人们感情的沟通和交流。新式通讯工具方便快捷，便于人们感情的沟通和交流。答案：答案：C关键词关键词交通和通讯不断进步、辛亥革命和国民大革命顺应交通和通讯不断进

26、步、辛亥革命和国民大革命顺应 时代潮流时代潮流图说历史图说历史主旨句归纳主旨句归纳(1)近代交通由传统的人力工具逐渐演变为近代交通由传统的人力工具逐渐演变为 机械动力牵引的新式交通工具，火车、机械动力牵引的新式交通工具，火车、 汽车、电车、轮船、飞机先后出现。汽车、电车、轮船、飞机先后出现。(2)通讯工具由传统的邮政通信发展为先进通讯工具由传统的邮政通信发展为先进 的电讯工具，有线电报、电话、无线电的电讯工具，有线电报、电话、无线电 报先后发明。报先后发明。(3)近代以来，交通、通讯工具的进步，推近代以来，交通、通讯工具的进步，推 动了经济与社会的发展。动了经济与社会的发展。关键词关键词交通和

27、通讯不断进步、辛亥革命和国民大革命顺应交通和通讯不断进步、辛亥革命和国民大革命顺应时时 代潮流代潮流图说历史图说历史主旨句归纳主旨句归纳(1)1911年，革命党人发动武昌起义，辛亥年，革命党人发动武昌起义，辛亥革命革命 爆发，随后建立了中华民国，颁布了爆发，随后建立了中华民国，颁布了中中华华 民国临时约法民国临时约法；辛亥革命是中国近代化；辛亥革命是中国近代化进进 程的里程碑。程的里程碑。(2)1924年国民党年国民党“一大一大”召开，标志着第召开，标志着第 一一次次 国共国共 合作正式实现，国民大革命兴起。合作正式实现，国民大革命兴起。(3)1926年国民革命军出师北伐，连克武昌、年国民革命

28、军出师北伐，连克武昌、九九 江，直捣南京、上海，取得巨大成功。江，直捣南京、上海，取得巨大成功。关键词关键词交通和通讯不断进步、辛亥革命和国民大革命顺应交通和通讯不断进步、辛亥革命和国民大革命顺应时时 代潮流代潮流图说历史图说历史主旨句归纳主旨句归纳(1)20世纪初，孙中山提出世纪初，孙中山提出“民族、民权、民族、民权、 民生民生”三民主义，成为以后辛亥革命三民主义，成为以后辛亥革命的的 指导思想。指导思想。(2)三民主义没有明确提出反帝要求，也三民主义没有明确提出反帝要求，也没没 有提出废除封建土地制度，是一个不有提出废除封建土地制度，是一个不彻彻 底的资产阶级革命纲领。底的资产阶级革命纲领。(3)1924年，孙中山将三民主义发展为新年，孙中山将三民主义发展为新三三 民主义，明确提出了反帝要求，它成民主义，明确提出了反帝要求，它成为为 第一次国共合作的政治基础和国民大第一次国共合作的政治基础和国民大革革 命的旗帜。命的旗帜。