第一章-细胞培养的设施与基本条件分析课件.ppt

1、1.1 1.1 细胞工程实验室的设置细胞工程实验室的设置1.2 1.2 常用仪器与设备常用仪器与设备1.3 1.3 实验室的生物安全（自学）实验室的生物安全（自学）第一章第一章 细胞培养的设施与基本条件细胞培养的设施与基本条件 预防培养细胞受到污染是细胞培养成功预防培养细胞受到污染是细胞培养成功与否的关键与否的关键n 为什么？生物体内的细胞可以通过机体的代谢、调节和保为什么？生物体内的细胞可以通过机体的代谢、调节和保护等机制而使其营养、环境、生长条件、抵抗有害因子能护等机制而使其营养、环境、生长条件、抵抗有害因子能力等方面处于最佳状况。而体外培养的细胞由于失去了对力等方面处于最佳状况。而体外培

2、养的细胞由于失去了对整体的依赖性，对实验室细胞培养的设施条件和人员素质整体的依赖性，对实验室细胞培养的设施条件和人员素质提出了较高的要求。提出了较高的要求。n 为了最大限度的创造既适合于细胞生长又可防治污染的环为了最大限度的创造既适合于细胞生长又可防治污染的环境，在培养过程中对细胞培养的设施、操作规程和检测方境，在培养过程中对细胞培养的设施、操作规程和检测方法等制定了严格的规范要求。法等制定了严格的规范要求。n 细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别在细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别在于，要求保持严格无菌环境，避免微生物及其他于，要求保持严格无菌环境，避免微生物及其他有害因子的影响。

3、有害因子的影响。 一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。 一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、一般来讲，它应能进行六方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。各区最好培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。各区最好分别设置于相连的各个房间，特别是无菌操作室最好分别设置于相连的各个房间，特别是无菌操作室最好能单独设置。如安排在一大实验室内，则无菌操作区能单独设置。如安排在一大实验室内，则无菌操作区与清洗、消毒灭菌区应分别位于两端，而培养、制备与清洗

4、、消毒灭菌区应分别位于两端，而培养、制备和储藏区位于此两区之间。和储藏区位于此两区之间。动物细胞工程实验室的设置动物细胞工程实验室的设置1.1 细胞工程实验室的设置 有其特殊的设置，如具有光照条件的培有其特殊的设置，如具有光照条件的培养室，试管苗培育所需的温室和移植驯化室养室，试管苗培育所需的温室和移植驯化室等。等。植物细胞工程实验室的设置植物细胞工程实验室的设置基本实验室基本实验室1.1 清洗间清洗间 根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在3050 m2。在实。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿、用具和培养材验室的一侧设置专用的洗

5、涤水槽，用来清洗玻璃器皿、用具和培养材料等。中央实验台还应配置料等。中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备作量大，可以购置一台洗瓶机。准备12个洗液缸，专门用于洗涤对洁个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。净度要求很高的玻璃器皿。 还应配置落水架、干燥箱、超声波清洗器、纯水制备等。还应配置落水架、干燥箱、超声波清洗器、纯水制备等。 地面应耐湿并排水良好。地面应耐湿并排水良好。超超声声波波清清洗洗机机电电热热干干燥燥箱箱纯纯水水仪仪洗洗瓶瓶机机 主要用于有关培养用液体、培养基母液和培养基的配制等。主

6、要用于有关培养用液体、培养基母液和培养基的配制等。 面积面积60 m2左右，配备的主要仪器设备有：冰箱、实验台、药品柜、左右，配备的主要仪器设备有：冰箱、实验台、药品柜、器械柜、天平、微波炉、器械柜、天平、微波炉、pH计、玻璃棒、烧杯、磁力搅拌器、培养基计、玻璃棒、烧杯、磁力搅拌器、培养基分装器、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管（器）、分装器、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管（器）、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积180200 L为宜，用于储为宜，用于储存培养基母液、激素、维生素等贵重药品、彩色胶卷及保存植物材料。存培

7、养基母液、激素、维生素等贵重药品、彩色胶卷及保存植物材料。天平应有不同感量。天平应有不同感量。1.2 制备室制备室pH计计天平天平移液器移液器 用于培养细胞所用器械、培养基的消毒与灭菌。用于培养细胞所用器械、培养基的消毒与灭菌。 配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干燥箱、配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干燥箱、消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选

8、用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。卧式灭菌锅。 如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求设如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。防滑。1.3 消毒间消毒间 无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的常由里

9、外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或实验台、鞋帽架、柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。 室内应配有超净工作台、紫外灯、酒精灯、解剖镜、各种接种器室内应配

10、有超净工作台、紫外灯、酒精灯、解剖镜、各种接种器械等。械等。 1.4 无菌操作室无菌操作室超净工作台超净工作台离心机离心机 为了控制培养室的为了控制培养室的温度温度和和光照光照，培养室的房间不要窗户，但应当，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，留一个通气窗，并安上排气扇。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。室内温度由空调控制，光照培养室。培养室外应有一预备间或走廊。室内温度由空调控制，光照时间

11、及其强度由日光灯和自动定时开关控制。时间及其强度由日光灯和自动定时开关控制。 培养室应配有若干培养架，上面固定日光灯、转床、摇床、光照培养室应配有若干培养架，上面固定日光灯、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。培养箱、生化培养箱、自动控时器等。1.5 培养室培养室2、辅助实验室、辅助实验室 2.1 鉴定室鉴定室l细胞学鉴定室细胞学鉴定室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 应配置各种显微镜、照相系统等应配置各种显微镜、照相系

12、统等l生化分析室生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的实验室中，应建立相应的生化分在以培养细胞产物为主要目的实验室中，应建立相应的生化分析实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。析实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 离心机、酶联免疫检测仪、天平、离心机、酶联免疫检测仪、天平、PCR仪等仪等PCR酶标仪酶标仪显微镜显微镜为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。2.2 温室温室1.2 常用仪器与设备常用仪器与设备n基本设备：水纯化装置、基本设备：水纯化装置、 冰箱、天平、酸度计、电炉、培养基分冰箱、天平、酸度计、电炉、培养基分装器、搅拌器、

13、离心机及离心管、移液器（管）、吸管等。装器、搅拌器、离心机及离心管、移液器（管）、吸管等。n灭菌设备：灭菌设备： 蒸汽压力灭菌锅、电热干燥箱、过滤除菌装置、喷雾蒸汽压力灭菌锅、电热干燥箱、过滤除菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。消毒器、紫外灯。n无菌操作设备：无菌操作设备： 超净工作台超净工作台n光温控制设备：光温控制设备： 时间程序控制器、空调及温度感应器。时间程序控制器、空调及温度感应器。n细胞培养设备：细胞培养设备： 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。摇床、生物反应器等。n细胞学鉴定设备：细胞学鉴定设备： 光学显微镜、实体显

14、微镜、倒置显微镜等。光学显微镜、实体显微镜、倒置显微镜等。n除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。化分析设备等。n培养器皿及实验用具：玻璃器皿、新型材料器皿及金属材质用培养器皿及实验用具：玻璃器皿、新型材料器皿及金属材质用具具超超净净工工作作台台p 基本原理：将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，基本原理：将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的、均匀再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的、均匀的断面风速通过无菌区，形成无尘无菌的高

15、洁净度工作环境。的断面风速通过无菌区，形成无尘无菌的高洁净度工作环境。p 侧流式（或垂直式）超净工作台：净化后的空气气流由左侧（或侧流式（或垂直式）超净工作台：净化后的空气气流由左侧（或右侧）通过工作台面流向对侧，也有从上向下（或从下向上）流右侧）通过工作台面流向对侧，也有从上向下（或从下向上）流向对侧，形成气流屏障以保持工作区无菌；在净化气流和外边气向对侧，形成气流屏障以保持工作区无菌；在净化气流和外边气体交界处可因气流的流动出现负压，使少许未净化气体混入，有体交界处可因气流的流动出现负压，使少许未净化气体混入，有发生污染的可能性发生污染的可能性p 外流式（或水平层流式）超净工作台：使净化后

16、的空气面向操作外流式（或水平层流式）超净工作台：使净化后的空气面向操作者流动，外方气流不致混入操作区；不能进行有害物质实验操作；者流动，外方气流不致混入操作区；不能进行有害物质实验操作；因多为开放式，没有防护挡板，操作和拿取物品方便，但可能受因多为开放式，没有防护挡板，操作和拿取物品方便，但可能受外界气流流动的影响而引起不洁空气混入。外界气流流动的影响而引起不洁空气混入。p 用于细胞培养中的有些器械、器皿烘干使用、玻璃器皿干燥消毒用于细胞培养中的有些器械、器皿烘干使用、玻璃器皿干燥消毒p 温度范围：温度范围：50300p 实验室常用：鼓风式电热干燥箱实验室常用：鼓风式电热干燥箱优点：温度均匀、

17、效果较好；优点：温度均匀、效果较好；缺点：升温过程较慢缺点：升温过程较慢p 注意事项：注意事项：1、升温时不能先升温后鼓风，应鼓风与升温同时开始，至、升温时不能先升温后鼓风，应鼓风与升温同时开始，至100时时停止鼓风停止鼓风2、消毒后，不能立即打开箱门以免骤冷而致玻璃器皿损坏，应等、消毒后，不能立即打开箱门以免骤冷而致玻璃器皿损坏，应等温度自然下降至温度自然下降至100以下时方可开门以下时方可开门3、温度过高可致包裹玻璃器皿的纸或棉花烧焦，烧焦碎屑影响细、温度过高可致包裹玻璃器皿的纸或棉花烧焦，烧焦碎屑影响细胞的生长胞的生长电电热热干干燥燥箱箱水纯化装置水纯化装置 所有与培养细胞接触的液体均需

18、用纯水配制；三次蒸馏水所有与培养细胞接触的液体均需用纯水配制；三次蒸馏水冰箱冰箱p储存各种溶液和短期保存组织标本等；储存各种溶液和短期保存组织标本等；p-20储存需冷冻保持生物活性及较长时期存放的制剂，酶、血清、储存需冷冻保持生物活性及较长时期存放的制剂，酶、血清、抗生素、谷氨酰胺等抗生素、谷氨酰胺等p专属专用，不存放挥发、易燃等对细胞有害的物质专属专用，不存放挥发、易燃等对细胞有害的物质p保持清洁保持清洁压力蒸汽消毒器压力蒸汽消毒器p直接或间接与细胞接触的物品均须消毒灭菌处理直接或间接与细胞接触的物品均须消毒灭菌处理p内热源侵入式电加热压力蒸汽消毒器内热源侵入式电加热压力蒸汽消毒器p注意事项

19、：严格按照操作说明执行注意事项：严格按照操作说明执行细胞计数板细胞计数板 也称血细胞计数板，进行培养细胞计数和活性细胞的观察也称血细胞计数板，进行培养细胞计数和活性细胞的观察电子细胞计数仪电子细胞计数仪 自动计数细胞悬液中的细胞数，尤其适用于进行细胞生长曲自动计数细胞悬液中的细胞数，尤其适用于进行细胞生长曲线实验线实验过滤除菌装置过滤除菌装置p适用对象：含维生素、蛋白质、多肽、生长因子等物质的人工合适用对象：含维生素、蛋白质、多肽、生长因子等物质的人工合成培养液、血清、胰蛋白酶等，高温或射线照射下易发生变性或失成培养液、血清、胰蛋白酶等，高温或射线照射下易发生变性或失活活pZeiss滤器滤器金

20、属，直径金属，直径142 mm和和293mm抽滤式（负压）：进液口与一盛液瓶相连，缓慢使气体回流，在抽抽滤式（负压）：进液口与一盛液瓶相连，缓慢使气体回流，在抽滤瓶与真空抽气泵之间连一个负压瓶滤瓶与真空抽气泵之间连一个负压瓶加压式（正压）：连一正压泵或蠕动泵的密闭滤器，通加压式（正压）：连一正压泵或蠕动泵的密闭滤器，通N2气体以造气体以造成容器内压力，使滤液滤过，调整成容器内压力，使滤液滤过，调整N2压力不超过压力不超过19.6 kPa；压力比较；压力比较恒定，滤过效果好，蛋白质不易变性恒定，滤过效果好，蛋白质不易变性p 玻璃漏斗式滤器玻璃漏斗式滤器滤板与玻璃漏斗为一体，根据滤板的孔径可分为滤

21、板与玻璃漏斗为一体，根据滤板的孔径可分为G1G6几种几种规格，仅规格，仅G5和和G6能达到滤过除菌的要求能达到滤过除菌的要求适用于各种培养液的过滤除菌，不宜过滤血清等粘稠液体；适用于各种培养液的过滤除菌，不宜过滤血清等粘稠液体；仅抽滤式，用后清洗麻烦仅抽滤式，用后清洗麻烦p 微孔滤膜滤器微孔滤膜滤器换膜式滤器和一次性滤器换膜式滤器和一次性滤器微孔滤膜，孔径微孔滤膜，孔径0.1m（可去除支原体）、（可去除支原体）、0.22 m（除菌效（除菌效果较保险）、果较保险）、0.45 m和和0.8 m离心机离心机p分离细胞、调整细胞浓度、洗涤、收集细胞等分离细胞、调整细胞浓度、洗涤、收集细胞等p低速；高速

22、（低速；高速（DNA、RNA提取）、大容量、控温离心机提取）、大容量、控温离心机（神经细胞）（神经细胞）移液管：移液管：玻璃、塑料材质；玻璃、塑料材质；1、2、5、10、20ml吸管吸管移液器：移液器：微量移液器、多通道可调式微量移液器、电动移微量移液器、多通道可调式微量移液器、电动移液器液器离心管：离心管：塑料和玻璃材质塑料和玻璃材质天平天平 动物细胞工程实验室的常用仪器设备有：动物细胞工程实验室的常用仪器设备有：p培养箱：恒温培养箱、培养箱：恒温培养箱、CO2培养箱（适合开放式或半开放式细胞培养箱（适合开放式或半开放式细胞培养，恒定提供定量培养，恒定提供定量CO2，通常使用条件为，通常使用

23、条件为37、5%CO2）p显微操作仪：细胞核移植、染色体操作、显微注射、胚胎切割等显微操作仪：细胞核移植、染色体操作、显微注射、胚胎切割等p细胞融合仪：细胞融合细胞融合仪：细胞融合p细胞冷冻储存器：程序化冷冻仪、液氮容器（液氮温度低达细胞冷冻储存器：程序化冷冻仪、液氮容器（液氮温度低达-196，防止冻伤；液氮挥发，定期观察，补充），防止冻伤；液氮挥发，定期观察，补充）p培养用器皿培养用器皿p手术器械：解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件手术器械：解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件p培养用器皿培养用器皿透明度好、无毒的中性硬质玻璃：多数细胞可生长，易于清洗、透明度好、无毒的中性硬质玻璃：多数细

24、胞可生长，易于清洗、消毒，可反复使用，透明便于观察；易碎、清洗时费人力消毒，可反复使用，透明便于观察；易碎、清洗时费人力无毒、透明光滑的特制塑料：一次性使用，方便；费用较高无毒、透明光滑的特制塑料：一次性使用，方便；费用较高1）培养皿：玻璃或塑料制成，盛取、分离、处理组织或作细胞毒性、）培养皿：玻璃或塑料制成，盛取、分离、处理组织或作细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验，常用规集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验，常用规格格3.5 cm、6 cm、9 cm、10 cm等等2）培养瓶：培养细胞种类要求不同，形态各异；细胞传代：瓶壁厚）培养瓶：培养细胞种类要求不同

25、，形态各异；细胞传代：瓶壁厚薄均匀，瓶口大小一致，口径一般不小于薄均匀，瓶口大小一致，口径一般不小于1 cm；规格有；规格有10 ml、25 ml、50 ml、100 ml、200 ml等；外周血培养常用等；外周血培养常用10 ml普通原瓶普通原瓶3）培养板：细胞培养、细胞克隆及各种检测；常用规格有）培养板：细胞培养、细胞克隆及各种检测；常用规格有4孔、孔、6孔、孔、12孔、孔、24孔、孔、96孔等孔等4）旋转培养器：用于某些特殊细胞或需要收获大量细胞的培养）旋转培养器：用于某些特殊细胞或需要收获大量细胞的培养p手术器械：解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件；手术刀柄、手术器械：解剖、取材、剪

26、切组织及操作时持取物件；手术刀柄、手术剪、镊子、止血钳、持针器；各种器械至少配备两套，使用后手术剪、镊子、止血钳、持针器；各种器械至少配备两套，使用后及时清洗，做防锈处理；高压蒸汽消毒或及时清洗，做防锈处理；高压蒸汽消毒或75%酒精浸泡消毒酒精浸泡消毒植物细胞工程实验室的常用仪器设备有：植物细胞工程实验室的常用仪器设备有：p光照培养箱：植物材料少量培养；光照、暗箱；调湿与不可调光照培养箱：植物材料少量培养；光照、暗箱；调湿与不可调湿；人工气候箱（全自动调温、调湿、控光）湿；人工气候箱（全自动调温、调湿、控光）p人工气候室：模拟自然界的各种气象条件，精确控制室内的温人工气候室：模拟自然界的各种气

27、象条件，精确控制室内的温度、光照、湿度、度、光照、湿度、CO2等，在种子发芽、植物培养、组培、植保等，在种子发芽、植物培养、组培、植保等领域应用广泛等领域应用广泛p摇床：细胞悬浮培养，常用振荡速度摇床：细胞悬浮培养，常用振荡速度100 r/minp培养瓶：玻璃三角瓶、试管、光口玻璃瓶；硼硅酸盐玻璃器皿培养瓶：玻璃三角瓶、试管、光口玻璃瓶；硼硅酸盐玻璃器皿2.1 动物细胞工程实验室的常用仪器设备有：动物细胞工程实验室的常用仪器设备有： 培养箱（恒温培养箱和培养箱（恒温培养箱和CO2培养箱）、显微操作仪、培养箱）、显微操作仪、细胞融合仪、细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮细胞融合仪、细胞冷冻储存器

28、（程序化冷冻仪和液氮容器）、培养用器皿、手术器械容器）、培养用器皿、手术器械2.2 植物细胞工程实验室的常用仪器设备有：植物细胞工程实验室的常用仪器设备有： 光照培养箱、人工气候箱、摇床和培养瓶光照培养箱、人工气候箱、摇床和培养瓶第第2章章 清洗与消毒清洗与消毒 离体培养的细胞对任何有害物质都十分敏感，微生物、离体培养的细胞对任何有害物质都十分敏感，微生物、细胞碎片以及非营养性化学成分都可能影响细胞的生长，细胞碎片以及非营养性化学成分都可能影响细胞的生长，对培养器皿清洗与消毒的要求极为苛刻。因此，清洗和消对培养器皿清洗与消毒的要求极为苛刻。因此，清洗和消毒是否彻底直接关系到细胞培养的成败。掌握

29、清洗、消毒毒是否彻底直接关系到细胞培养的成败。掌握清洗、消毒知识，学会清洗、消毒方法是细胞培养工作的基本功。知识，学会清洗、消毒方法是细胞培养工作的基本功。 洗涤液的配制洗涤液的配制一、清洗一、清洗p 玻璃器皿：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗玻璃器皿：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗清洗后的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹，且无任何残留物质清洗后的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹，且无任何残留物质u新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用0.5的去的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在12盐酸溶液中过夜盐酸溶液中过夜（

30、不可少于（不可少于4 h），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100120烘箱内烘干备用。烘箱内烘干备用。u使用过玻璃器皿：先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去使用过玻璃器皿：先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.5的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，用（计量仪器不可烘干）

31、。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。重新清洗。p 胶塞清洗胶塞清洗 新购置的瓶塞带有滑石粉及杂质。新购置的瓶塞带有滑石粉及杂质。方法：先用自来水冲洗；每次用后立即置入水中浸泡，用方法：先用自来水冲洗；每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH（洗衣粉）煮沸（洗衣粉）煮沸1020min；自来水冲洗后，；自来水冲洗后，1%稀盐酸浸泡稀盐酸浸泡30min，或蒸馏水冲洗后再煮沸或蒸馏水冲洗后再煮沸1020min，晾干备用。，晾干备用。 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，

32、无毒、特殊包装优点在生聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，无毒、特殊包装优点在生物学实验中应用越来越广泛。第一次使用塑料器皿时，可先用物学实验中应用越来越广泛。第一次使用塑料器皿时，可先用8mol/L尿素（用浓盐酸调尿素（用浓盐酸调pH = 1）清洗，接着依次用无离子水、）清洗，接着依次用无离子水、1 mol/L KOH和无离子水清洗，然后用和无离子水清洗，然后用10-3 mol/L EDTA 除去金属离子除去金属离子的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。的去污剂清洗，然后用自

33、来水和无离子水洗净即可。 使用过程中，注意：防止划痕；用后及时浸泡使用过程中，注意：防止划痕；用后及时浸泡p 塑料器皿的清洗塑料器皿的清洗 金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 p 金属用品洗涤金属用品洗涤p 除菌过滤器洗涤除菌过滤器洗涤 用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。洗，晾干备用。p 包装包装 便于消毒、储存，防止落入灰尘及消毒后再

34、次被污染便于消毒、储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染 灭菌工作是极其重要的。对于初学者来说，灭菌工作是极其重要的。对于初学者来说， 首先应建首先应建立有菌和无菌的概念立有菌和无菌的概念有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台台面，未处理的工具和手等。物的表面、超净工作台台面，未处理的工具和手等。 无菌的范畴：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）无菌的范畴：高压高温处理（工具、器皿、培养基等） 物理或化学处理；火烤后的物体；物理或化学处理；火烤后的物体； 健康的动植物不与外部表面接触的组织内

35、部可能是无菌的健康的动植物不与外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）二、消毒二、消毒消毒方法消毒方法p 物理灭菌法：紫外线、电离辐射、湿热、干热、过滤等物理灭菌法：紫外线、电离辐射、湿热、干热、过滤等p 化学消毒法：使用灭菌剂或抗生素，如酒精、次氯酸钠、升汞、化学消毒法：使用灭菌剂或抗生素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等1、紫外线消毒紫外线消毒 适用于实验室空气、操作台面和一些不能用于湿热、干热灭菌的适用于实验室空气、操作台面和一些不能用于湿

36、热、干热灭菌的培养器皿的消毒，如塑料培养皿和培养板培养器皿的消毒，如塑料培养皿和培养板 破坏微生物的核酸和蛋白质使其失活；臭氧杀死微生物破坏微生物的核酸和蛋白质使其失活；臭氧杀死微生物 主要是利用紫外灯进行照射，培养室灯距地面不超过主要是利用紫外灯进行照射，培养室灯距地面不超过2.5m，离工，离工作台面不超过作台面不超过1.5m，物品不互相遮挡。灭菌时间，物品不互相遮挡。灭菌时间2030min。注意：关灯注意：关灯5 min后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。2、电离辐射消毒电离辐射消毒 使用放射性核素产生的使用放射性核素产生的X线和加速器等发出的辐射进

37、行灭菌消毒线和加速器等发出的辐射进行灭菌消毒适用于消毒量大和不适于做高压或滤过等培养用品，如培养瓶、适用于消毒量大和不适于做高压或滤过等培养用品，如培养瓶、培养皿、培养板、注射器、移液器枪头、离心管等培养皿、培养板、注射器、移液器枪头、离心管等优点：灭菌时物品不会升温，可直接对密封包装物品进行灭菌优点：灭菌时物品不会升温，可直接对密封包装物品进行灭菌缺点：诱变作用很强，不适合消毒活的生物材料缺点：诱变作用很强，不适合消毒活的生物材料3、湿热消毒湿热消毒即高压蒸汽消毒，使用最广泛、效果最好的消毒方法即高压蒸汽消毒，使用最广泛、效果最好的消毒方法常用物品消毒压力及时间：培养液和橡胶制品常用物品消毒

38、压力及时间：培养液和橡胶制品115、10min；布；布类、玻璃制品及金属器械为类、玻璃制品及金属器械为121.3、20min。4、干热消毒法干热消毒法电热烤箱温度至电热烤箱温度至160以上，保持以上，保持90120min，杀死细菌和芽孢，杀死细菌和芽孢适用于玻璃器皿消毒适用于玻璃器皿消毒消毒完毕后不可马上将烤箱门打开消毒完毕后不可马上将烤箱门打开优点：消毒后的器皿干燥、易储存优点：消毒后的器皿干燥、易储存缺点：热传导慢；缺点：热传导慢；橡胶、塑料制品不能使用此法橡胶、塑料制品不能使用此法灼烧：酒精灯火焰对金属器具及瓶口灼烧，如灼烧：酒精灯火焰对金属器具及瓶口灼烧，如接种环、涂布棒接种环、涂布棒

39、5、过滤除菌过滤除菌将液体或气体用微孔滤膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗将液体或气体用微孔滤膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留在滤膜上达到除菌目的粒阻留在滤膜上达到除菌目的适用于遇热易发生变性而失效的试剂或培养用液，抗生素、蛋适用于遇热易发生变性而失效的试剂或培养用液，抗生素、蛋白质、维生素等白质、维生素等正压过滤较负压过滤具流速高、过滤快，不易污染，避免蛋白正压过滤较负压过滤具流速高、过滤快，不易污染，避免蛋白质产生气泡等质产生气泡等6、化学消毒法化学消毒法 适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。消消 毒毒 剂剂使用浓度使用浓度(%)消毒时间

40、消毒时间(min)效效 果果残液去除残液去除难易难易乙醇乙醇70-750.13好好易易新洁尔灭新洁尔灭1020530好好易易氯化汞氯化汞0.11215最好最好最难最难过氧化氢过氧化氢1012515较好较好最易最易抗菌素抗菌素450mg/l3060较好较好较难较难次氯酸钙次氯酸钙/钠钠9 10530好好易易 几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较（1）实验器皿、操作表面、皮肤一般用）实验器皿、操作表面、皮肤一般用7075%酒精；酒精；（2）升汞为剧毒药品，使用时注意别溅到皮肤上，使用后要进行处）升汞为剧毒药品，使用时注意别溅到皮肤上，使用后要进行处理，不能直接导入下水道。理，不能直接导

41、入下水道。 升汞处理方法：升汞处理方法： 升汞升汞Na2S絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）FeSO4（中和过多的（中和过多的Na2S ） 注注 意意 方法方法：甲醛、高锰酸钾熏蒸。：甲醛、高锰酸钾熏蒸。 甲醛的用量通常按甲醛的用量通常按26 ml/m3计算，高锰酸钾的用量是甲醛的计算，高锰酸钾的用量是甲醛的1/2。室内准备。室内准备妥当后，把高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内（最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利妥当后，把高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内（最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗），然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即清洗），然后将甲醛也倒入碗

42、或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。生的热可使其余的甲醛挥发为气体。 甲醛熏蒸接种室应至少在使用前甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24 h进行，熏蒸后密闭保持进行，熏蒸后密闭保持4 h以上再进入以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前作前2 h进行。进行。 对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸。对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸。长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸 录像录像1、2 作业与思考作业与思考： 课本P21 2、5