细胞凋亡检测技术课件.ppt
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1、细胞凋亡及检测技术细胞凋亡及检测技术第一节第一节概概 述述一、细胞凋亡的概念一、细胞凋亡的概念细胞凋亡细胞凋亡(apoptosis(apoptosis,这是,这是19721972年年KerrKerr等建等建议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的议用来描述伴随细胞死亡的一系列形态学上固定的变化形式的。变化形式的。细胞在一定的生理或病理条件下,遵细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程,最后细胞循自身的程序,自己结束其生命的过程,最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体脱落离体或裂解为若干凋亡小体(apoptotic (apoptotic bodiesbodies,而被
2、其他细胞吞噬。,而被其他细胞吞噬。“凋亡凋亡”一词来自一词来自希腊语,希腊语,apo意为意为“分离分离”,ptosis指花瓣或树叶指花瓣或树叶的脱落,的脱落,“凋亡凋亡”是由这两个词组合而成,意指细是由这两个词组合而成,意指细胞凋亡的形态类似胞凋亡的形态类似秋天秋天花瓣或树叶的凋落一样。花瓣或树叶的凋落一样。二、研究简史二、研究简史半个世纪前半个世纪前: :人们就观察到在生物的发生、人们就观察到在生物的发生、生长、发育以及衰老过程中,一直伴随着组织生长、发育以及衰老过程中,一直伴随着组织细胞的生理自发退化死亡现象细胞的生理自发退化死亡现象. .19651965年年: :发育生物学家发育生物学家
3、LockshinLockshin和和WilliamsWilliams首先提出了首先提出了PCDPCD(程序化死亡)一词,用于描(程序化死亡)一词,用于描述蛾的发育过程,认为随着成年蛾的出现,其述蛾的发育过程,认为随着成年蛾的出现,其幼虫死亡是一种发育调节性死亡。幼虫死亡是一种发育调节性死亡。 1972 1972年年:Kerr:Kerr等首次提出了细胞凋亡的概等首次提出了细胞凋亡的概念,从形态学角度描述细胞的生理死亡,并认念,从形态学角度描述细胞的生理死亡,并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象,可能具有十分重要的生物学意义。物学现象,可能具
4、有十分重要的生物学意义。19771977年年: :人们注意到在生理或病理性刺激人们注意到在生理或病理性刺激条件下,淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。并条件下,淋巴细胞发育过程中的凋亡现象。并认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本认为这是维持组织细胞动力学平衡的一种基本生物学现象,可能具有十分重要的生物学意义。生物学现象,可能具有十分重要的生物学意义。 19801980年年:Wyllie:Wyllie研究胸腺细胞在糖皮质激素作研究胸腺细胞在糖皮质激素作用下引致的细胞凋亡变化,总结并建立了细胞凋用下引致的细胞凋亡变化,总结并建立了细胞凋亡的共同形态学特征,包括核固缩和亡的共同形态学特征,包括核固缩和
5、DNADNA降解成降解成寡核苷酸片段等。寡核苷酸片段等。19891989年年: 0wen: 0wen及其研究小组在研究胸腺细胞阴及其研究小组在研究胸腺细胞阴性选择过程中,发现性选择过程中,发现T T细胞受体细胞受体(TCR)(TCR)与自身抗原与自身抗原相互作用与未成熟相互作用与未成熟T T细胞的细胞的PCDPCD发生有关,并在体发生有关,并在体外证实剌激外证实剌激CD3CD3分子可诱导未成熟分子可诱导未成熟T T细胞细胞PCDPCD的发的发生。证明了信号传递物质对生。证明了信号传递物质对PCDPCD的调控作用。的调控作用。 19911991年年:Ellis:Ellis首先发现了线虫首先发现了
6、线虫(C.elegans(C.elegans) )体内体内Ced-3Ced-3、4 4两个基因与两个基因与PCDPCD的发生密切相关,的发生密切相关,随后逐渐发现了多种参与随后逐渐发现了多种参与PCDPCD的正相调节基因和的正相调节基因和负相调节基因,前者包括负相调节基因,前者包括Ced-2Ced-2、p53p53、cmyccmyc、FasFas、糖皮质激素受体及白细胞介素、糖皮质激素受体及白细胞介素11转化转化(ICE(ICE等基因,后者则有等基因,后者则有Ced-9Ced-9、bcl-2bcl-2、p53p53等等基因基因. .三、细胞凋亡的特征三、细胞凋亡的特征n细胞凋亡与细胞坏死虽然都
7、是细胞死亡,细胞凋亡与细胞坏死虽然都是细胞死亡,但细胞凋亡的形态及生化特征与坏死性但细胞凋亡的形态及生化特征与坏死性细胞死亡的特点则不同细胞死亡的特点则不同(一)细胞凋亡的形态学改变:(一)细胞凋亡的形态学改变: 组织内单个细胞或小团细胞的死亡组织内单个细胞或小团细胞的死亡 不引发细胞自溶,也不引起炎症反应不引发细胞自溶,也不引起炎症反应电镜下可见:凋亡细胞固缩电镜下可见:凋亡细胞固缩 胞浆致密,细胞器密集、退变胞浆致密,细胞器密集、退变 核染色质致密,聚集于核膜处核染色质致密,聚集于核膜处 胞核裂解,胞浆形成多发性芽突胞核裂解,胞浆形成多发性芽突 凋亡小体形成凋亡小体形成光镜下:凋亡小体外被
8、以胞膜,圆形或卵圆形,胞光镜下:凋亡小体外被以胞膜,圆形或卵圆形,胞浆浓缩,强嗜酸性,可有可无固缩深染的核碎片。浆浓缩,强嗜酸性,可有可无固缩深染的核碎片。细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别细胞凋亡与细胞坏死在形态学上的差别 细胞凋亡细胞凋亡 细胞坏死细胞坏死 单细胞丢失单细胞丢失细胞膜发泡但仍完整细胞膜发泡但仍完整,细胞膜内细胞膜内陷将细胞分割成凋亡小体陷将细胞分割成凋亡小体不发生炎症反应不发生炎症反应被临近正常细胞或吞噬细胞吞被临近正常细胞或吞噬细胞吞噬噬溶酶体完整溶酶体完整染色质均一凝集染色质均一凝集 细胞成群丢失细胞成群丢失细胞膜不完整细胞膜不完整,细胞细胞肿胀、溶解肿胀、溶解发生严重
9、炎症反应发生严重炎症反应被巨噬细胞吞噬被巨噬细胞吞噬溶酶体裂解溶酶体裂解染色质凝集成块、染色质凝集成块、不均一不均一 细胞坏死时核的变化细胞坏死时核的变化细胞坏死时的细胞坏死时的炎症反应炎症反应(二二)细胞凋亡的生化改变:凋亡过程中出现的生化细胞凋亡的生化改变:凋亡过程中出现的生化改变以改变以DNA的片段化及蛋白质的降解最为重要。的片段化及蛋白质的降解最为重要。1)DNA的片段化的片段化 组成染色质的组成染色质的DNA链被激活的核链被激活的核酸内切酶切割,可形成酸内切酶切割,可形成180200bp或其整倍数的或其整倍数的片段,电泳中呈特征灶的片段,电泳中呈特征灶的“梯梯”状条带状条带,这是判断
10、,这是判断凋亡发生的客凋亡发生的客 观指标之一。观指标之一。2)蛋白质的降解蛋白质的降解 凋亡蛋白酶激活,水解细胞的蛋白质结构,导致细凋亡蛋白酶激活,水解细胞的蛋白质结构,导致细胞解体并形成胞解体并形成凋亡小体凋亡小体、水解相关活性蛋白,从而、水解相关活性蛋白,从而使该蛋白获得或丧失某种生物学功能。使该蛋白获得或丧失某种生物学功能。细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别细胞凋亡与细胞坏死在生物化学上的区别 细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死生理因素诱导生理因素诱导非生理因素造成的意非生理因素造成的意外损伤外损伤受大分子合成和激活过程的严受大分子合成和激活过程的严格调控格调控离子稳态调节丧失离子稳态
11、调节丧失需要能量需要能量不需要能量不需要能量需要大分子合成需要大分子合成不需要核酸和蛋白质不需要核酸和蛋白质的合成的合成有新基因从头转录有新基因从头转录没有新基因转录没有新基因转录染色质非随机降解为染色质非随机降解为DNA“梯带梯带” 染色质染色质DNA随机降随机降解解四、细胞凋亡的过程与调控四、细胞凋亡的过程与调控 凋亡信号转导凋亡信号转导凋亡基因激活凋亡基因激活细胞凋亡的执行细胞凋亡的执行凋亡细胞的清除凋亡细胞的清除(一一)凋亡的四个阶段:凋亡的四个阶段: 凋亡诱导因素凋亡诱导因素+ 受体受体cAMPCa2+神经酰胺神经酰胺死亡信号死亡信号凋亡基因激活凋亡基因激活DNase激活激活Casp
12、ase激活激活巨噬细胞吞噬巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞分解凋亡细胞(二)细胞凋亡的调控(二)细胞凋亡的调控1 . 细胞凋亡的相关因素细胞凋亡的相关因素(1) 诱导性因素诱导性因素激素和生长因子失衡:缺乏(激素和生长因子失衡:缺乏(IL-2,淋巴细胞凋,淋巴细胞凋亡)或过多(糖皮质激素亡)或过多(糖皮质激素,淋巴细胞凋亡),淋巴细胞凋亡) 理化因素:射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌理化因素:射线、高温、强酸、强碱、乙醇、抗癌药物等药物等 免疫性因素:如,免疫性因素:如,CTL分泌粒酶分泌粒酶靶细胞凋亡靶细胞凋亡微生物因素:细菌、病毒及毒素。(微生物因素:细菌、病毒及毒素。(HIV) (2)抑制性因
13、素:)抑制性因素: 细胞因子:细胞因子:IL-2、神经营养因子、神经营养因子激素:激素:ACTH、睾丸酮、雌激素等、睾丸酮、雌激素等二价金属阳离子:二价金属阳离子:Zn2+药物:苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性药物:苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、中性氨基酸氨基酸病毒:病毒:EB病毒、牛痘病毒病毒、牛痘病毒CrmA2 .细胞凋亡信号转导细胞凋亡信号转导凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。凋亡信号转导系统的特点:凋亡信号转导系统的特点:多样性:不同种类细胞有不同系统多
14、样性:不同种类细胞有不同系统耦联性:凋亡与增殖分化系统在某些环节交、耦联,耦联性:凋亡与增殖分化系统在某些环节交、耦联,同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一因素既可引起凋亡也可引起增殖同一性:不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统同一性:不同凋亡诱导因素可通过同一信号转导系统多途性:同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统多途性:同一凋亡诱导因素可通过不同信号转导系统研究较多的系统:研究较多的系统:依据:依据:细胞凋亡时胞内游离细胞凋亡时胞内游离Ca2+浓度显著上升浓度显著上升用用Ca2+载体载体A23187人为升高人为升高B淋巴细胞淋巴细胞Ca2+水水平,平,B淋巴细胞凋亡淋巴细胞凋亡用用Ca
15、2+络合剂降低胞内络合剂降低胞内Ca2+水平,阻止细胞凋亡水平,阻止细胞凋亡 激活激活Ca2+依赖谷氨酰胺转移酶依赖谷氨酰胺转移酶Ca2+ 活化核转录因子活化核转录因子1胞内胞内Ca2+信号系统(信号系统(Ca2+为第二信使)为第二信使)2cAMP/PKA信号系统(信号系统(cAMP为第二信使)为第二信使)依据:依据:双丁酰双丁酰cAMP可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺可引起培养的髓样白血病细胞及胸腺细胞凋亡细胞凋亡糖皮质激素使糖皮质激素使cAMP上升上升cAMP激活激活PKA使靶蛋白某些氨基酸(苏、丝使靶蛋白某些氨基酸(苏、丝AA)残基磷酸化)残基磷酸化改变蛋白质功能改变蛋白质功能3Fas蛋
16、白蛋白/Fas配体信号系统配体信号系统Fas蛋白:细胞膜跨膜蛋白蛋白:细胞膜跨膜蛋白Fas蛋白蛋白+Fas配体(抗配体(抗Fas)细胞凋亡细胞凋亡机制:机制:Fas蛋白蛋白+Fas配体(抗配体(抗Fas)神经鞘磷脂酶活性神经鞘磷脂酶活性产生神酰胺产生神酰胺蛋白激酶激活蛋白激酶激活细胞凋亡细胞凋亡Fas蛋白蛋白+抗抗Fas、TNF 激活激活ICE样样caspase 降降解解H1组蛋白组蛋白染色体松驰染色体松驰DNA暴露内切酶位点暴露内切酶位点通过通过Ca2+信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡信号系统传递死亡信息引起细胞凋亡4神经酰胺信号系统神经酰胺信号系统神经酰胺:神经鞘磷脂(神经酰胺:神经鞘磷脂
17、(SM)在神经鞘磷脂酶的)在神经鞘磷脂酶的作用下产生的一类新型第二信使物质。作用下产生的一类新型第二信使物质。介导细胞凋亡的依据:用天然神经酰胺处理介导细胞凋亡的依据:用天然神经酰胺处理u937白血病细胞,诱导细胞凋亡白血病细胞,诱导细胞凋亡神经酰胺途径相关诱因:电离辐射、神经酰胺途径相关诱因:电离辐射、TNF-、Fas抗原、糖皮质激素抗原、糖皮质激素 5二酰甘油二酰甘油/蛋白激酶蛋白激酶C(PKC)信号系统)信号系统二酰甘油:磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶二酰甘油:磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱在磷脂酶C催催化下产生的一种第二信使物质。化下产生的一种第二信使物质。依据:依据:活化的活化的PKC1可诱
18、导可诱导u937白血病细胞凋亡白血病细胞凋亡抑制抑制PKC活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺活性可抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞凋亡细胞凋亡PKC激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡(糖激动剂佛波脂可抑制某些类型细胞凋亡(糖皮质激素、皮质激素、T细胞受体激活、细胞受体激活、IL-2撤除)撤除)6酪氨酸蛋白激酶系统酪氨酸蛋白激酶系统生长因子或细胞因子生长因子或细胞因子激活酪氨酸蛋白激酶激活酪氨酸蛋白激酶靶靶蛋白酪氨酸磷酸化蛋白酪氨酸磷酸化Ras蛋白激活蛋白激活通过通过Raf-1、MAPKK、MAPK蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化细胞分化细胞分化生长因子或细胞因子撤除生长因子或细胞因子撤除不能激活酪氨酸
19、蛋白不能激活酪氨酸蛋白激酶系统激酶系统细胞凋亡细胞凋亡3.凋亡相关基因凋亡相关基因三类:三类:抑制凋亡基因:抑制凋亡基因:Bcl-2、EIB、IAP促进凋亡基因:促进凋亡基因:P53、Bax、ICE双向调节基因:双向调节基因:c-myc、Bclx(B细胞淋巴瘤细胞淋巴瘤/白血病白血病-2B cell lymphoma / leukemia-2基因的缩写) Bcl-2蛋白:蛋白:229个氨基酸(人)、个氨基酸(人)、236个氨基酸(小鼠)个氨基酸(小鼠)分布:线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜分布:线粒体内膜、细胞膜内膜、内质网、核膜作用:作用:Bcl-2高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细
20、高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引起的细胞凋亡胞凋亡依据:依据:导入导入Bcl-2基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因基因质粒可防止神经细胞因撤除神经生长因子所诱导的凋亡子所诱导的凋亡淋巴细胞有淋巴细胞有20%呈呈Bcl-2阳性时,预后不佳(耐受放射阳性时,预后不佳(耐受放射线、抗癌药物)线、抗癌药物)1.Bcl-2 直接的抗氧化作用直接的抗氧化作用 抑制线粒体释放促凋亡蛋白质(细胞色素抑制线粒体释放促凋亡蛋白质(细胞色素C、AIF) 抑制促凋亡性调节蛋白质抑制促凋亡性调节蛋白质Bax、Bak的细胞毒作用的细胞毒作用 抑制凋亡蛋白酶(抑制凋亡蛋白酶(caspases)的激活)的激活 维持细胞钙
21、稳态维持细胞钙稳态Bcl-2抗凋亡作用机制:抗凋亡作用机制:作用:作用:野生型(野生型(wtP53):):DNA结合蛋白,诱导细胞凋亡结合蛋白,诱导细胞凋亡(“分子警察分子警察”)突变型:抑制细胞凋亡突变型:抑制细胞凋亡野生型野生型P53的作用机制:的作用机制:P53蛋白蛋白细胞周期细胞周期G1期检期检查染色体查染色体DNA损伤(检查点功能)损伤(检查点功能)发现发现DNA损伤损伤剌激剌激CIP的表达的表达阻止细胞进入下一周期,启动阻止细胞进入下一周期,启动DNA修复机制修复机制修复失败修复失败启动细胞凋亡机制启动细胞凋亡机制细胞凋亡细胞凋亡2.P53c-myc: 一种癌基因,它能诱导增殖,也
22、能诱导细胞凋亡,具有一种癌基因,它能诱导增殖,也能诱导细胞凋亡,具有双向调节作用。双向调节作用。作用机制:作用机制:c-myc蛋白为重要的转录调节因子,既可介蛋白为重要的转录调节因子,既可介导细胞增殖的基因,也可激活介导细胞凋亡的基因,其导细胞增殖的基因,也可激活介导细胞凋亡的基因,其作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境(有生作用取决于细胞接受何种信号及细胞的生长环境(有生长因子长因子增殖,无生长因子增殖,无生长因子凋亡)。凋亡)。Bcl-x:能翻译:能翻译Bcl-XL和和Bcl-Xs两种蛋白,两种蛋白,Bcl-XL蛋蛋白抑制细胞凋亡,白抑制细胞凋亡,Bcl-Xs蛋白促进细胞凋亡(合成以
23、蛋白促进细胞凋亡(合成以谁为主)谁为主) 3.c-myc,Bcl-x五、五、 细胞凋亡的发生机制细胞凋亡的发生机制(一)氧化损伤(一)氧化损伤氧化损伤的后果之一:细胞凋亡氧化损伤的后果之一:细胞凋亡依据:依据:各种氧化剂(各种氧化剂(H2O2)可直接诱导细胞凋亡)可直接诱导细胞凋亡抑制超氧化物歧化酶(抑制超氧化物歧化酶(SOD)活性可诱导细胞凋亡)活性可诱导细胞凋亡抗氧化剂(抗氧化剂(VitE、胡萝卜素等)可阻断有氧化应激背、胡萝卜素等)可阻断有氧化应激背景的各种凋亡诱导因素(景的各种凋亡诱导因素(TNF-、电离辐射)引起的细、电离辐射)引起的细胞凋亡胞凋亡引起引起DNA损伤,激活损伤,激活P
24、53基因基因引起引起DNA损伤,活化多聚损伤,活化多聚ADP核糖合成酶,耗竭核糖合成酶,耗竭NAD,消耗大量消耗大量ATP攻击细胞膜不饱和脂肪酸,脂质过氧化,细胞膜损伤或攻击细胞膜不饱和脂肪酸,脂质过氧化,细胞膜损伤或产生过氧羟基产生过氧羟基24碳四烯酸碳四烯酸激活激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶依赖的核酸内切酶细胞膜损伤,细胞膜损伤,Ca2+内流增多及损伤线粒体,通透性增内流增多及损伤线粒体,通透性增加膜电位改变加膜电位改变活化核转录因子活化核转录因子NF-B、AP-1,加速凋亡相关基因表达,加速凋亡相关基因表达氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制:氧化损伤引起细胞凋亡的可能机制:(二)钙稳
25、态失衡(二)钙稳态失衡细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一细胞钙稳态失衡是细胞凋亡的重要机机制之一依据:依据:各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程各种凋亡刺激所引起的凋亡是钙依赖过程凋亡发生时胞浆凋亡发生时胞浆Ca2+浓度显著上升,并在随后的浓度显著上升,并在随后的一系列凋亡改变中起关键性作用(核酸内切酶激活、一系列凋亡改变中起关键性作用(核酸内切酶激活、需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活,细需钙蛋白酶、磷脂酶、谷氨酰胺转移酶的激活,细胞膜的空泡化)胞膜的空泡化)钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病(神经钙稳态失衡参与多种凋亡相关疾病的发病(神经退行性疾病)退行性疾病)激活激活Ca2
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