植物生物技术-植物遗传转化载体课件.pptx

1、第第十十章章 植植物遗物遗传传转化载转化载体体1遗遗传传转化转化常常用用的的选择选择标标记记基基因及因及及及无无选选择标择标记记基基因因转转化化第第一一节节 植植物物遗传遗传转转化化载载体的体的种种类类及及特特点点第第二二节节 农农杆杆菌质菌质粒粒系系统统的结的结构构、功功能和能和构构建建 第第三三节节 植植物物病毒病毒载载体体第第四四节节 叶叶绿绿体转体转化化载载体体 第第五五节节系系统统本章本章主主要内要内容容第第 10 章章 植物植物遗遗传传转转化化载载体体2本章教学目的与要求根癌根癌农农杆杆菌菌 TiTi 质粒质粒的的结构与功结构与功能能名词名词：一元载体一元载体、双元载体、双元载体、

2、卸卸甲载甲载体体叶绿叶绿体体转化的优转化的优势势与意与意义义遗传遗传转转化中常用化中常用的的选择标记基选择标记基因因、报告基、报告基因因3第第 10 章章 植物植物遗遗传传转转化化载载体体植物遗传转化的基植物遗传转化的基础础植物植物遗传转化化也也称为称为转转基基因因技技术术 (transgene technology)是是指将指将人人工工分分离和离和修修饰饰过过的外的外源源基基因因导入导入生生 物物体体的的基因基因组组中中，从而从而使使生生物物体的体的遗遗传传性性状发状发生生改改变变的的技技 术术植物植物转基因的基因的优越性越性对植对植物物基基因因型和型和表表现现型型的的改改变只变只作作用用于

3、于目标目标性性状状， 不涉不涉及及非目非目标标累累赘赘基基因，因，因因而而更更具有具有针针对对性性，可可加快加快育育种种进进程程；可克可克服服传传统统育种育种中中不不同同ThTh物物之间之间的的ThTh殖殖隔离隔离等等限限制制，扩，扩大大可利可利用用的的资资源源库（库（动动物物、植物植物、微微ThTh物物、人工人工合合成成基基因均因均可可利利用用）；）；可创可创造造出出自自然界然界所所没没有有的的新新种质种质；以转以转基基因因植植物为物为主主体体的的植植物物化工化工厂厂具具有有高效高效、低低污污染、染、可可再再ThTh的的优优点点。第一第一节节 植物遗传转植物遗传转化化载体的种类及特载体的种类

4、及特点点一、一、植植物遗传转物遗传转化化载体的特载体的特点点作为作为植植物物遗遗传转传转化化的的载载体，体，必必须须具具有两有两种种功功能能： 1.1. 能能作作为为媒媒介介将将外外源基源基因因导导入入植物植物细细胞胞中中去去2.2. 它它能能提供提供被被寄寄主主细胞细胞的的复复制制和转和转录录系系统统所识所识别别的的 DNADNA 序序列列，以，以保保证证导导入的入的外外源源基基因能因能在在受受体体植物植物细细胞胞中中正常正常复复制制和和表表达达质质 粒粒 载 体载 体R i质 粒 载 体质 粒 载 体共共 整 合 载 体 系 统整 合 载 体 系 统Ti质质 粒粒 载 体载 体双 元 载双

5、 元 载 体体 系系 统统二二、植物基因、植物基因工工程载体的程载体的种种类类病病 毒毒 载载 体体单单 链链 R N A 病 毒 载 体病 毒 载 体 单单 链链 D N A 病 毒 载 体病 毒 载 体 双双 链链 D N A 病 毒 载 体病 毒 载 体第二节 农杆菌质粒系统的结构、功能和构建农农杆杆菌菌是一是一类类革革兰兰氏阴氏阴性性土土壤壤杆菌杆菌（ G ），），活活在植在植物物根根的的表表 面面依依靠靠由根由根组组织织渗渗透出透出来来的的营营养物养物质质（冠冠瘿碱瘿碱）生生存存的一的一类类细细 菌菌。农农杆杆菌菌可分可分为为根根癌癌农杆农杆菌菌 Agrobacterium tume

6、faciems （含含 Ti 质质 粒粒）和和发发根根农杆农杆菌菌 Agrobacterium rhizogenes （含含 Ri 质质粒粒） ， 在在植植物物基因基因工工程程中中以根以根瘤瘤农农杆杆菌菌的的 Ti 质质粒粒介导介导的的遗遗传传转化转化最最多多。根癌根癌农杆杆 菌侵染植菌侵染植 物后物后产生生 冠冠瘿瘤瘤一、一、根根癌农杆癌农杆菌菌 TiTi 质质粒的结构与粒的结构与功功能能TiTi 质质粒粒 ( ( tumortumor inducedinduced Plasmid)Plasmid) 是是根根癌癌农农杆菌杆菌染染色色体体外外的的遗传遗传物物质质，为双为双股股共共价价闭合闭合的

7、的环环状状 DNADNA 分子分子，其其分分子量子量为为95-15695-156 x x 10106 6D D ，约约有有 150-200kb150-200kb依依据据 TiTi 质质粒诱粒诱导导的的植植物冠物冠瘿瘿瘤瘤种种类的类的不不同同， TiTi 质质粒可粒可以以分分为为四种四种类类型型： 章章鱼鱼碱型碱型、胭胭脂脂碱型碱型、农农杆杆碱碱型型和和农农杆杆菌素菌素碱碱 型型（ agrocinoPineagrocinoPine ）或或琥琥珀珀碱碱型型（ succinamosuccinamo PinePine ）TiTi 质质粒粒结结构构T-DNA 区区CytokininAuxinOpine左

8、左边界边界右右边边界界Ti 质粒质粒travir 区区Con区区Ori区区T-DNA 区区Auxin左左边界边界CytokininOpineCon区区右右边边界界vir 区区Ori区区Ti 质粒质粒tra毒毒性性区区（ vir 区区）：）：激激活活 T DNA 的的 转转移移T DNA 区区： 侵侵染植染植物物时时， 从从 Ti 质质粒粒上上被被切割切割， 转移转移到到植植物物细胞细胞中中， 带带有有与与肿瘤肿瘤形形成有成有关关的的基基因因存存在与在与细细菌菌间间进行进行接接合合保保证证 Ti 质粒质粒进进行行自自我我接接合合转转移区移区： 有有关关的的基基因因复复制制起起始区始区： 复复制制

9、（一） T-DNA 的结构特点及功能编长长左左码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的 染色体上。度一般为 12-24kb ，是 Ti 质粒最重要 的部分。右边界分别为 25bP 的重复序列，其中 14bP 是核心，是完全保守的。右边界对于致瘤必不可少。（二（二） VirVir 区的结构和功能区的结构和功能：该该区区段段上编上编码码的的基基因能因能激激活活 T-T- DNADNA 转移转移， 使使农农杆菌杆菌表表现现出出毒毒性性，故，故也也称称作作 致致毒毒区区。 T-T- DNADNA 区区与与 VirVir 区在区在质质粒粒上上彼此彼此相相邻邻， 合合起起来约来约占占 TiTi 质质粒粒 DNA

10、DNA的的三三分分之之一一VirVir 区区段段总总长度长度大大约约 35kb35kb ，由由 6 6 个个互互补补群群组成组成， 分分别别命名命名为为VirAVirA 、 VirBVirB 、 VirCVirC 、 VirDVirD 、 VirEVirE 、和和 VirGVirG 。VirVir 区区中中各各个基个基因因之之间间都都是是相相互联互联系系相相互互影影响响的的，缺缺一一不不可可。当当 VirVir 基基因因与与 T-T- DNADNA 分分别别位位于于两个两个不不同同的的复复制制子子上上时时，即即 VirVir 区区与与 T-T- DNA DNA 区区分分割割开开来来以以后后，V

11、irVir 基基因因仍仍然然能能够够为为 T-T- DNADNA 提提供供转转移功移功能能毒毒性区性区中中各各个个位位点点的的表表达达情情况况可可以分以分为为两两种种组组成性成性表达表达：在在无无植物植物诱诱导导分分子子存在存在下下依依然然保持保持一一定定的的表表达达水水平平；VirAVirA 属属于组于组成成型型表表达达的的位位点点诱诱导性导性表达表达：即即这这些些基因基因的的表表达达必须必须在在土土壤壤农杆农杆菌菌感感染染植物植物受受伤伤组组织织 时时，植，植物物细胞细胞分分泌泌的的信信号号分分子子（ 乙酰乙酰丁丁香香酮酮及羟及羟基基乙乙酰酰丁丁香香酮酮）作作用用 下下才能才能启启动表动表

12、达达； VirBVirB 、 VirCVirC 、 VirDVirD 和和 VirEVirE 是属是属于于诱诱导导性表性表达达 的的位位点点virGvirG 既既为组为组成成型型表表达，达，也也具具有有诱诱导导表表达达的的特性特性， 在在信信号号分分子的子的诱诱导导 下下，表，表达达量量提提高高 1010 倍倍 V Virir 区区基基因因的的功功能能：VirVir A A 蛋蛋白白 帮帮助助植植物物细胞细胞接接受受植植物物信信号号分分子子； VirVir G G 蛋蛋白白 对毒对毒性性区区的的其其他他基基因因进进行行正正调调节节VirVir B B 蛋蛋白白 形形成成膜膜通通道道， 使使 T

13、-DNA 转转移到移到细细菌菌细细胞胞外外 VirVir D D 蛋蛋白白 VirDVirD 1 1 、VirDVirD 2 2 诱诱导导 T-DNAT-DNA 形形成成单单股股 DNADNA 片片段段， 并并形形成成复复合合物物（ T-T- DNA-DNA- VirVir D2D2 ）；VirVir E E 蛋蛋白白 与与单单链链 T-DNAT-DNA 结结合合（ 形形成成 T T 复复合合物物），），保保护护 T-T- DNADNA 不不被被胞胞外外核核酸酸酶降酶降解解转转入入植物植物细细胞胞， 整整合合到寄到寄主主基基因因组中组中； VirVir C C 蛋蛋白白 与与切切割割单单链链

14、T-T- DNADNA 有有关关VirVir F F 蛋蛋白白 协协助助 T T- - DNADNA 转移转移到到宿宿主主植物植物细细胞胞中中 VirVir H H 蛋蛋白白对对植植物物产产ThTh的的杀杀菌菌或或抑抑菌菌物物进进行行解解读读二二、发、发根农杆根农杆菌菌 RiRi 质粒的结构和功质粒的结构和功能能RiRi 质质粒粒： 200kb-200kb- 800kb800kb ， 其其基基本本结结构构也也与与 TiTi 质粒质粒相相似似， 包包括括致致瘤瘤区区（ VirVir 区）区）、 T-DNAT-DNA 区区和复和复制制起起点点 OriOri 。根据根据其其合合成成的冠的冠瘿瘿碱碱种

15、种类类的的不同不同可可分分为为三类三类： 农杆农杆碱碱型型、甘甘露露碱碱型型和和黄黄 瓜瓜碱碱型型。农杆农杆碱碱型型 RiRi 质粒质粒有有两两段段 T-T- DNADNA ，即即 TLTL 和和 TRTR ， 可以可以分别分别插插入植入植物物基基因因 组组；甘甘露露碱碱型型和和黄黄瓜瓜碱碱型型 RiRi 质质粒粒只有只有单单一一 T-DNAT-DNA ， 甘甘露露碱碱型型和和黄黄瓜瓜碱碱型型 Ri Ri 质粒质粒的的单单一一 T T 区区除除其其 25bP25bP 边边界界重重复复序列序列外外，其其他他部部分分与与 TiTi 质质粒同粒同源源 性很性很低低，但但它们它们与与农农杆杆碱碱型型

16、RiRi 质粒质粒的的 TLTL 区区有有较较高高的同的同源源性性。三、 Ti 质粒载体的改造Ti 质粒作为质粒作为载载体的可能体的可能性性能够自发地整合到植物的染色体上。能转化多种植物。强启动子： T-DNA 的 oPine 合成酶基因上有一个强启动子，能启 动外源基因的表达。 天然 Ti 质粒载体的缺点分子分子量量太太大大（ 200kb ），）， 基基因因工程工程中中难难以以操操作作 ；限制限制性性酶酶切切位点位点太太多多， 难难以以找到找到单单一一的的限制限制性性位位点点 ；T-DNA 区区致瘤致瘤基基因因产产物使物使被被转化转化的的植植物物细胞细胞成成为为肿肿瘤，瘤，阻阻碍碍细细胞的胞

17、的分分化化 和植和植株株再再生生；在大在大肠肠杆杆菌菌中不中不能能复复制制；质粒质粒上上存存在在一些一些对对 T-DNA 转转移移不不起起作用的作用的基基因因2 2 、除除去去 T-T- DNADNA 上的上的有有机机碱碱ThTh物物合合成基成基因因（ tmttmt ）； 因因为为有有机机碱碱的的合合成成大大量量消消耗耗精氨精氨酸酸和和谷谷氨氨酸酸， 影影响响植植物物细细胞胞的的ThTh长长；3 3 、除除去去TiTi质质粒粒上上的的其它其它非非必必需需序列序列， 最最大大限限度度地地缩缩短短载体载体的的长度长度；4 4 、安安装装大大肠肠杆杆菌菌复复制制子子， 使其使其能能在在大大肠肠杆杆菌

18、菌中中复复制，制，以以利于利于克克隆隆操操作作；5 5、安安装装植植物细物细胞的胞的筛筛选标选标记记，如如neorneor基因基因， 使用使用植植物物基基因因的的启启动动子子和和 PolyPoly A A 化化信信号号序序列列；6 6 、安安装装多聚多聚人人工工接接头头以利以利于于外外源源基基因因的的克克隆隆。Ti 质粒质粒的的改改造造1 1 、除除去去 T T- - D DNANA 上上的的ThTh长长素素（ tmstms ）和）和分分裂裂素素（ tmrtmr ） ThTh物物合成合成基基因因， 因为因为大大量量的的ThTh长长素素和和分分裂裂素素会抑会抑止止细细胞胞再再ThTh长长为为整整

19、株株植植物物；（一）中（一）中间间载载体体中中间间载载体体： 带带有有重重组组 T-DNAT-DNA 的的大肠大肠杆杆菌菌质粒质粒的的衍衍ThTh载载体体目目的的： 解解决决体体外外操操作中作中农农杆杆菌菌不不能能直直接接导导入入目目的基的基因因的的困困难难具具有有 bombom 位位点点 , , 中间中间载载体体可可以在以在不不同同细细菌菌细细胞间胞间进进行行结结合合转转移移能能在在两两种不种不同同的的ThTh物中物中复复制制的的， 既既能能在在原原核核ThTh物中物中复复制制， 又又能能在在真真核核ThTh物物中中复复制制的载的载体体。具具有有细细菌质菌质粒粒的的复复制制原原点点及及选选择

20、择标标记基记基因因， 还还有真有真核核ThTh物物的的自自主主复制复制序序列列( ( ARS)ARS) 以以及选及选择择标标记记性性状状 具具有有多多克克隆隆位位点点。卸卸甲载甲载体体由由于于影影响响植植株株再再ThTh的的直直接接原原因因是是 T-DNAT-DNA 中中的的 OncOnc 基基因因的的致致瘤作瘤作用用，因此因此，切切除除其致其致瘤瘤基基因因，使，使成成为为无无毒的毒的质质粒粒， 即即“卸卸甲甲” 其其“ “ 武武装装”的的 TiTi 载载体体，称，称为为“卸卸甲载甲载体体”。卸卸甲载甲载体：体：构构建无建无毒毒的的 TiTi 质质粒粒载载体体例例： PGV3850:PGV38

21、50: 是是从从胭胭脂脂碱碱 TiTi 质质粒粒 PTiC58PTiC58 衍衍ThTh而而来来的的 PGV2250:PGV2250: 是是从章从章鱼鱼碱碱 TiTi 质质粒粒 PTiB6S3PTiB6S3 衍衍ThTh而而来来的的（二）中间表达载体中中间间表达表达载载体体： 是是由由中中间间载体载体（含含选选择择标标记记）加加上上能在能在植植物物细细胞中胞中表表达达的的启动启动子子及及目目的基的基因因构构成成，也也就就是是嵌嵌合基合基因因插插入入中间中间载体载体后后构成构成。嵌嵌合合基基因因（ chimericchimeric genegene ）外外源源基基因因和植和植物物表表达达元元件件

22、（启启动动子、子、终终止止子子、 55 和和 3UTR3UTR 内内含含子子、信号信号肽肽等等）连连接接在在一一起起构成构成基基因因。启动启动子子TiTi 质质粒粒NosNos （ 胭胭脂脂碱碱合合成成酶酶基基因因）、 OcsOcs （章章鱼鱼碱碱合合成成酶酶基基因因）等）等基基因因具有具有与与真真核核ThTh物物启启动子动子类类似似的的 TATATATA 盒盒和和 CAATCAAT 盒盒，均均能能在在植物植物细细 胞胞中表中表达达， 并并且且无无组组织特织特异异性性。因此因此， 它们它们成成为为早早期期构构建嵌建嵌合合基基因因 的的启动启动子子。CaCa MVMV 的的 35s35s 启启动

23、动子子花花椰菜椰菜花花叶叶病病毒毒 DNADNA 的的的的 35s35s 启启动子动子能能使使嵌嵌合的合的外外源源基基因在因在植植 物物细胞细胞中中表达表达。（三 ) 植物遗传转化载体系统一元载体转化系统（共整合载体）转化载体系统双元载体转化系统1.1.一一元载体元载体（ 共共整整合）合）系系统统：有有 2 2 个个独独立立的的质质粒，粒，农农杆杆 菌菌 TiTi 质质粒粒和大和大肠肠杆杆菌菌中中间间 载载体体将将外外源源基因基因装装载载到到小小质质粒粒 上上， 然然后后把把载载有有外外源源基基因因 的的小小质质粒粒通通过过同同源源重重组组的的 方方法法导导入入农杆农杆菌菌的的 TiTi 质质

24、粒粒。Ti 质粒的其他部分PBR322 （含 AMPr ）胭脂合成酶基因（ Nos)右边界（ RB ）左边界（ LB ）PBR322vector目的基因 重组载体卸甲载体外源基因插入 PGV3850 的过程中间载体共整合载体2 2. .双双元元载载体体系系统统是指是指由由两两个个分分别别含含 T-DNAT-DNA 和和 VirVir 区区的的相相容容性性突突变变 TiTi 质质粒构粒构成成的的双双质粒质粒系系 统统 , , 又又因因为为其其 T-DNAT-DNA 与与 VirVir 基基因在因在两个两个独独立立的的质质粒上粒上， 通通过过反反式激式激活活 T-T-DNADNA 转转移移 , ,

25、 故故称之称之为为反反式式载体载体（ transtrans vectervecter ）。穿穿梭梭载载体体（中（中间间载载体体）主主要要包包括括两两个个载载体体（ TiTi 质质粒粒）卸卸甲甲载载体体（ TiTi 质质粒粒）目的基因目的基因T-DNA 区区左边左边界界右右边边界界OriA植植物选物选择择 标标记基记基因因细细菌选菌选择择 标标记基记基因因OriE中间载体vir 区区细菌选择 标记基因Ori 区区卸甲卸甲载载体体帮助质粒农杆菌农杆菌感染植物接接合转合转移移进入植物细胞核 整合，表达VirE.coli穿梭载体左右外源基因Vir左右外源基因左右外源基因双元载体系统转化过程RiRi 质

26、质粒粒的的 T-DNAT-DNA 上上的基的基因不影因不影响植响植株株的的再再ThTh，野野ThTh的的 RiRi 质质 粒粒直直接接可可以以用作用作转转化化载载体体。RiRi 转化转化载载体体也也有两有两种种构构建建策策略略 : :共共整整合载合载体体：与与 TiTi 质质粒粒的的共共整合整合载载体体的的不同不同之之处处是是可可直直 接接利利用野用野ThTh型型的的 RiRi 质质粒粒。双双元元载体载体：与与 TiTi 质粒质粒相相同同，其其原原理理主主要要是是 RiRi 质粒质粒的的 Vir Vir 基基因因反反式式作作用用驱驱动动 T-DNAT-DNA 转转移移。4. Ri 转转化化载体

27、的载体的改改造造第三第三节节 植物病毒载植物病毒载体体病病毒转毒转化化载载体体抗抗原原 展展 示示 型型体体载互互性性体体补载插插入入 型型体体载置置型型体体换载双双链链D DN NA A病病毒毒 转转 化化 载载 体体单单链链R RN NA A病病毒毒 转转 化化 载载 体体单单双双 链链DNDNA A病病毒毒 转转 化化 载载 体体一、双链 DNA 病毒转化载体花花椰椰菜菜花花叶病叶病毒毒（ CaMVCaMV ）：）：8kb ， 环环状状 ds-DNA ， 8 个个 ORF ， 最多最多可可容容纳纳 250bP 外外源源 DNA ， 只只能能用用于短于短暂暂表表达达 (transient

28、exPression)感感染范染范围围窄窄；不不整合整合到到染色染色体体中中； 外外源基源基因因表表达达水水平平高高； 表表达时达时间间较短较短；二、单链 RNA 病毒转化载体TMV （烟草花叶病烟草花叶病毒毒）载）载体体优优点点： 转转化化频频率率高高 ;宿宿主主范范围围广广 ;高高拷拷贝贝，外源，外源基基因因高高效效表表达达。 可可构构建抗原展建抗原展示示载载体体三、单链 DNA 病毒转化载体双生病毒双生病毒： 2.5-3kb ，环，环状状 ss-DNA ，可，可感感染单子染单子叶叶 植物植物。整合到染整合到染色色体中体中；无无致病性致病性；免疫免疫原原性性弱弱；可可长长期期表表达达外源基

29、因外源基因；四、病毒转化载体的构建1 1 、置置换换型型载体载体： 外外源源基基因因置置换换病病毒基毒基因因组组的的外外壳壳蛋蛋白白等等基基因因2 2 、插插入入型载型载体体：外外源基源基因因插插入入到到病病毒毒本身本身启启动动子子下下游游3 3 、基基因因互补互补载载体体： 外源外源基基因因插插入入到到有功有功能能缺缺陷陷型病型病毒毒组组分分或或亚亚组组分分内内，可可采采用用 2 2 种种交交替替突突变的变的病病毒毒， 可可同同时时在在宿宿主主中中存存在在4 4、抗抗原原展展示型示型载载体体：在：在病病毒毒外外壳壳蛋蛋白白基基因因内内选选择择性性插插入外入外源源基基因因， 将将外外源源基基因

30、展因展示示在在病毒病毒粒粒子子的的表表面面五、五、病病毒载体与毒载体与质质粒载体粒载体的的比比较较优优点点植植物病物病毒毒或或其其侵侵染染性性的的基基因组因组是是以以一一定定的的传传播播途途径径侵侵入寄主入寄主植植物物， 由由其其 构构建的建的载载体体能能把把外外源源基基因因直直接接导导入入植植物物细细胞胞，复复杂杂的的装配装配过过程由程由细细胞胞完完 成成，而而 TiTi 质粒质粒载载体体是是通过通过侵侵染转染转化化等等复复杂杂的的转转移移过过程程而而完完成成TiTi 质质粒粒载载体体转转化化时时将将外外源源基基因因整合整合到到植植物物核基核基因因组组上上，而，而病病毒毒载载体体感感染染植植

31、物物后后，一一般般不不整整合合到到植物植物细细胞胞核核 DNADNA 上上，从，从而而防防止止无无限限传传代扩代扩散散， 故故比较比较安安全全可可靠靠病毒病毒载体载体感感染植染植物物细细胞胞以后以后只是只是利利用用寄寄主细主细胞胞的功的功能能在在细细胞质胞质进进行行复复制制 和表和表达达；同同时时又又由由于于病病毒毒具具有高有高效效自自我我复制复制能能力力，故故在在转转化植化植物物中中可可得得 到到高高拷拷贝贝外外源基源基因因，从从而而十十分有利分有利于外于外源基源基因因的表的表达达和和功功能能的的实实现现病毒病毒能能系系统统地地侵侵染染整整株株植植物物，避避免免了了单单细胞细胞、原原ThTh

32、质质体体或或组织组织、器器官官的的转化转化和和再再ThTh培培养养， 能能较较快快地地获获得得转转基基因因植植物物植物植物病病毒毒的的寄寄主主范范围围较广较广， 因而因而由由某某种种病毒病毒基基因组因组构构建建的的载体载体可可用用于于多多种不种不同同植植物物的遗的遗传传操操作作存存在在的的问题：1 、安、安全全性性2 、靶、靶向向性性3 、有、有效效性性细胞毒性胞毒性 染染色体色体毒毒性性 免免疫毒性疫毒性转导靶向性靶向性转 录靶向性转导效率效率靶向性基因表达水平和持基因表达水平和持续时间表表 达的可达的可调控性控性第四节 叶绿体转化载体一、叶绿体基因组的特点高高等等植植物物的的叶叶绿绿体体基

33、基因因组组：. 多多数数高等高等植植物物的的 ct DNA 大大约约为为 150kbP ：烟草 ct DNA 为 155 844bP 、水稻 ct DNA 为 134 525bP 。.ctDNA 约约能能编编码码 126 个个蛋蛋白质白质：12% 序列是专为叶绿体的组成进行编码；. 叶叶绿绿体体的的半半自自主主性性：有一套完整的复制、转录和翻译系统，但又与核基因组紧密联系。 如 , 叶绿体中 RuBP 羧化酶的生物合成 8 个个大大亚亚基基( 由叶叶绿绿体体基基因因组组编码 )+ 8 个个小小亚亚基基 ( 由核核基基因因组组编码 )二、 叶绿体转化的发展三、叶绿体转化载体的结构左侧左侧质质体体

34、同同原原序序列列启动子5UTR 增强区3UTR 终止子目的基因启动子3UTR 终止子目的基因5UTR 增强区右右侧侧质质体体同同原原序序列列外源基因整合的靶位点： trnV 和 3rPsl2 间 ,trnG 和trnfM 间， trn1 和 trnA 间四四、表表达达调调控控元元件件（一（一） NEP 和和 PEP 型型启启动动子子调控元调控元件件 16SRNA 操操纵纵子子的的启启动动子子 Prrn光光调调控控的的 psbA 启启动动子子（二（二） 5UTR 的的核核糖糖体体结结合位合位点点噬噬菌菌体体 T7 基基因因 10 表表达达序序列列 T7g10人工人工合合成成的的 18bp 包包含

35、含核核糖糖体结体结合合位位点点的的 rbcL5UTR（三（三） 诱诱导导型启型启动动子子（四（四） 3UTR 终终止止子子： TrbcL,TpsbA, Trbs16,TrrnB（五（五） 多多基基因表因表达达元元件件50bp 的的多多顺顺反反子子间间基基因因表表达达元元件件烟烟草叶草叶绿绿体体转转 化化外外源源基因基因定定点点整整合合多多个个基基因可因可以以同时同时表表达达原原核核基基因因无无需需修饰修饰改造改造就就能直能直接接表表达达蛋蛋白白表表达水达水平平高高母母系系遗遗传，传，环环境风境风险险小小易易于于保保持纯持纯系系、后后代代不不分分离离导导入入的的外源外源基基因性因性状状稳稳定定性

36、性高高叶叶绿绿体体基因基因组组转化转化的的外外源源基因基因表表达达具具有组有组织织特特异异性性四四、 叶叶绿绿体体转转化化相相对对于于核核转转化化的的优优势势五、叶绿五、叶绿体体基基因因工程工程的的应应用用生生物物反反应应器器农作农作物物遗遗传传育育种种，改改良农艺良农艺性性状状理论理论研研究究1. 叶绿叶绿体生体生物物反应器研反应器研究究将将植植物物叶叶绿绿体体作作为生为生物物反反应应器器进进行行生生物制物制药药、 表表达达药药用用蛋蛋白白和和疫疫苗苗， 具有具有许许多多独独特的特的优优势势。它它可可以以大大大大 降降低低生生产产和和运运输输成成本本、外外源源蛋蛋白稳白稳定定性性高高、易、易

37、于于纯纯化化等等。 这这些些独独特的特的优优势势使使叶绿叶绿体体基基因因组成组成为为生生产产食用食用蛋蛋白白和和人人类类 药药用用蛋蛋白的白的理理想想平平台台。2. 应应用于农作物遗用于农作物遗传传育育种种提提高高作作物物抗抗性性抗旱基因、抗病原体蛋白基因、抗虫基因、抗除草抗旱基因、抗病原体蛋白基因、抗虫基因、抗除草剂基因、耐基因、耐盐基因等一些重要的与抗基因等一些重要的与抗 逆相关的基因已逆相关的基因已经实现叶叶绿体中的高表达体中的高表达提提高高作物作物的的营营养养价价值值叶叶绿体参与了体参与了许多代多代谢反反应 , 如氨基酸、脂肪酸、淀粉等物如氨基酸、脂肪酸、淀粉等物质的生物合成。因此的生

38、物合成。因此 , , 通通过 叶叶绿体体遗传工程工程技技术 , , 改造控制改造控制这些反些反应的的酶系系统 , , 或者直接将有意或者直接将有意义的外源基因的外源基因导入叶入叶绿体体 , , 将将有有 可能可能实现叶叶绿体中高表达人类必需的氨基酸、脂肪酸、蛋体中高表达人类必需的氨基酸、脂肪酸、蛋白白质等等营养养物物质 , , 从而提高作物的从而提高作物的营养养价价值。提提高高作物作物产产量量叶叶绿体能够把光能体能够把光能转换成成对作物有用的化学能作物有用的化学能 , , 而化学能是作物生物而化学能是作物生物产量形成的基量形成的基础能能 量来源。所以量来源。所以 , , 通通过改善叶改善叶绿体

39、的光合性能体的光合性能 , , 比如比如对光合作用关光合作用关键酶 RubiscoRubisco 进行改造行改造 , , 能够提高光能够提高光 合效率合效率 , , 进而增而增加加农作作物物产量。量。3. 促促进进基基础理论础理论研研究究叶叶绿绿体体基基因表因表达达调调控控机机制制；核核质基质基因的因的互互作作机机制制；光光合作合作用的用的机机理理；叶叶绿绿体体基基因因的的功功能能鉴鉴定定和和叶叶绿绿体体进进化化等等；第五节 遗传转化常用的选择标记基因及及无选择 标记基因转化系统在转化过程中，仅仅只有极少数植物受体细胞能获得外源基因，而 其中目的基因被整合到受体植物基因组并实现表达的细胞就更少

40、因此，需要尽早对转化细胞进行选择，常用的且最简便的方法是使 用特异性选择标记基因一、选择标记基因选选择标记基择标记基因因的的特特性性：不存在不存在于于靶靶标植物细标植物细胞胞中中的的蛋蛋白白质质或或酶酶基基因小，因小，易易于分于分子子克克隆隆可可以利以利用用表表达达元元件件在在植植物物中中充充分表分表达达检检测容易测容易，并并且且能能够够定定量量分分析析抗抗T Th h素素选择标选择标记记基基因因 除草剂选择标除草剂选择标记记基基因因 安安全全选选择标记基择标记基因因二、报告基二、报告基因因报报告基告基因因系系指指其编其编码码产产物物能够能够被被快快速速测测定定、常常用来用来判判断断外外源源基

41、基 因因是否是否成成功功地地导入导入受受体体细细胞胞（器器官官或或组织组织）并并检检测测其其表表达达活活性性 的的一类一类特特殊殊用用途途的的基基因因理理想想的的报报告告基基因的因的最最基基本本要求要求：1 1 ）受受体体细胞细胞中中不存不存在在相相应应的的内内源源等等位位基基因因的活的活性性2 2 ）它它的产的产物物是是唯唯一的一的，且且不不会会损损害害受受体体细细胞胞3 3 ）具具有快有快速速、廉廉价价、灵灵敏敏、定定量量和和可可重重复复性性的的检检测测特特性性常用报告基因 - - 葡萄葡萄糖糖醛醛酸酸糖糖苷苷酶酶（ GUSGUS ）萤萤光光素素酶酶基因基因（ LucLuc ）绿绿色色荧荧

42、光光蛋蛋白白（ GFPGFP ）基）基因因 - - 葡萄葡萄糖醛糖醛酸酸糖糖苷酶苷酶（ GUSGUS ） : :编编码酶码酶的的作作用底用底物是物是无无色色的的 X-X- 葡萄葡萄糖苷糖苷酸酸（ X- X- glucuronide),glucuronide),将它将它变成变成深深蓝蓝色色的的 5-5- 溴溴 -4-4- 氯氯 靛靛蓝蓝在在一定一定条条件件下与底下与底物物 X-GlucX-Gluc 发发ThTh作作用用， 产产ThTh兰兰 色色沉沉淀淀反反应，既应，既可用可用分分光光光度计光度计测测定定又又可可以以直直接接 观观察察植植物物组组织织形形成成的的兰兰色斑色斑点点当当加加入入 4-4

43、- 甲甲基基伞伞形酮基形酮基葡葡萄萄糖糖苷苷酸酸（ MUGMUG ） 底底 物时，物时，产产ThTh 4-4- 甲甲基基伞伞形酮，形酮，发发荧荧光光。因因而可而可以以 用用荧光荧光光谱光谱法测法测定定荧荧光光素素酶酶 L Lucuc 基基因因 : :最最常常用用的是的是来来自自萤萤火火虫虫的的 萤萤光光素素酶酶基基因因 , , 在在有氧有氧的的 条条件件下下，萤萤光光素素酶酶就就会会催催 化化萤萤光光素进素进行行氧氧化化反反应应， 产产ThTh AMPAMP 、 CO2CO2 和和黄黄绿绿色色 萤萤光光绿色荧光蛋白基因（ GFP ） :V Vi it to or ri ia a来源来源于于发发

44、光光ThTh物物水水母母（ AequoreaAequorea）体体内内的的一一种发种发光光蛋蛋白白在水在水母母体体内内，水，水母母蛋蛋（ aequorinaequorin ） 与与C Ca a2 2+ + 结结合合时时会会自发自发蓝蓝光光， G GF FP P受受此此蓝蓝光光激激发而发而发发出出绿绿色色荧荧光光在实在实验验室室条条件件下下， 用用标标准准的的长波长波长长紫紫外外光光 或或者者蓝蓝光光照射照射时时， GFPGFP 受受激发激发也也能能发发出出绿绿 色色荧荧光光Movie 2三无选择标记基因转化系统（一）位点特异性重组（二）同源重组（三）共转化系统（四）转座子系统（一（一） 位位点

45、点特特异性异性重重组组系系统统位位点点特特异异性性重重组组系系统统是是指指通通过重过重组组酶酶作作用用于于两两个个特特定定 DNADNA 序序列列实实 现现重重组组。该该系系统统由重由重组组酶酶及其及其识识别别位位点点组成组成，当当两两个个识识别别位位点点正正 向向排排列列时时，重重组组酶酶可可专专一一性性地催地催化化切切除除两个两个识识别别位位点之点之间间的的序序列列。FLR FRTS 重组系统Cre LoxP 系统R RS 系统FRT 是重组酶 FLP 的特异作用位点， LoxP 位点是重组酶 Cre 的特 异作用位点， RS 是 R 的识别位点。来来源源于于 P1 噬噬菌体菌体的的 Cr

46、e 重重组组酶酶为为 34.1KDa ， 由由 4 个个亚亚基基组组成成（ 2 个个大大的的 C端端亚亚基基和和 2 个小个小的的 N 端端亚亚基基）。C 端端亚亚基基的的结构结构与与噬噬菌菌体来体来源源的的整整合酶合酶结结构构相相似似，也也具有具有催催化化位位点点。Cre 可可以以识识别别 LoxP 的的 2 个个 13bp 的的反反向向重复重复序序列列和和 8bp 的的间隔间隔区区域域专专一一识识别别位位 34bp 的的 LoxP 位点位点， 从从而而介介导导个个 LoxP 位位点点的的重重组组， LoxP 位位点的点的双双连连接接酶酶重重连，连，实实现现 的的Cre 重重组酶组酶能能介介

47、Cre 重重组酶组酶可可以以链链 被被 Cre 蛋蛋白白剪剪切切后后再再通过通过 剪剪切切和和倒倒位位。在在同同一一染色染色体体上上的的两两个个 LoxP 位位点点如如果是果是反反向向重重复复序序列列， 导导个个 LoxP 位位点点间间的的序列序列倒倒位位； 如如果果是是同同向向重重复复序序列列， 有有效效切切除除个个 LoxP 位位点间点间的的序序列列；如如果果 个个 LoxP 位位点点分分别别位位于于条条不同不同的的 链链或或染染色体色体上上，Cre 酶酶则则介介导导条条 链链的的交交换换或染或染色体色体易易位位。C Cre/LoxPre/LoxP 诱诱导型表达导型表达载载体体的的策策略略

48、： crecre 基因基因的的表表 达受达受诱导诱导型型启动子启动子的的严严格调格调控控，筛筛选基因的选基因的上上下下游游 带带有两有两个个同同向向重重复复的的 LoxPLoxP 位点，位点，当当标记基标记基因完因完成成 筛选筛选任任务务不不再再需需要要时时，通通过过一定一定的的化化学学或或生生理理条条件件 诱诱导导 CreCre 基因的表基因的表达达，从而，从而只只需需一次一次转转化就化就能能高高效效 地地剔剔除除标标记记基基因因获得仅含目的基因获得仅含目的基因的的转基因植转基因植株株。（二（二） 同同源源重组重组法法同源重组法是在没有重组酶 活性的情况下，将标记基因 置于重复序列之间，通过

49、两 个重复序列发生重组作用， 从而将标记基因切除。65（三（三）转转座子座子系系统统转座子系统普遍存在于植物界，而且通常一种植物转座子系统 在异源植物中也能自由转座。当前应用较多的仍是最早发现的 玉米 Ac/Ds 转座子系统，在此体系中， Ac 能够自发转座，而 Ds 则只有当 Ac 存在时，才能够转座。利用这些特性，可将目 的基因置于 Ds 之间或者将标记基因插于 Ac 中间，转基因完成 后，目的基因和标记基因将随着转座作用而发生分离，从而获 得无标记基因的转基因植物。（四（四）共共转转化化法法本章小结与思考题：1. Ti 质质粒粒的的结构结构与与功功能能2. Ti 质质粒粒的改的改造造：一一元元载载体体和和双双元元载载体体系系统统3.3. 叶绿叶绿体体转转化化相相对对于于核核基基因转因转化的优化的优势势4.4. 叶叶绿绿体体基基因工因工程程的应的应用用4.常常用用的的选选择标择标记记基基因因与与报报告告基基因因6.几几种无种无选选择择标标记基记基因因转转化化系系统统的的应应用用方方案案谢谢大家