核苷酸类物质(精)课件.ppt

1、一、概况一、概况 核酸由众多的单体核苷酸通过核酸由众多的单体核苷酸通过3 3 , ,5 5 磷磷酸二酯键聚合而成。酸二酯键聚合而成。 核苷酸由碱基、核糖、磷酸组成。核苷酸由碱基、核糖、磷酸组成。 脱去磷酸后的碱基称为核苷。脱去磷酸后的碱基称为核苷。第二节第二节 核酸与核苷酸发酵核酸与核苷酸发酵（一）呈味核苷酸（一）呈味核苷酸 核苷酸类中的肌苷酸（核苷酸类中的肌苷酸（IMPIMP）、鸟苷酸（）、鸟苷酸（GMPGMP）、）、黄苷酸（黄苷酸（XMPXMP）呈强鲜味。如：肌苷酸钠比味精鲜）呈强鲜味。如：肌苷酸钠比味精鲜4040倍，倍，鸟苷酸钠比味精鲜鸟苷酸钠比味精鲜160160倍。倍。 5 5 鸟苷酸

2、鸟苷酸 5 5 肌苷酸肌苷酸 5 5 黄苷酸黄苷酸 （guanylic acidguanylic acid）（）（inosinic acidinosinic acid） （xanthylic acidxanthylic acid） 5 5 -GMP 5-GMP 5 -IMP 5-IMP 5 -XMP-XMP碱基碱基 鸟嘌呤鸟嘌呤 次黄嘌呤次黄嘌呤 黄嘌呤黄嘌呤AMPGMP鲜味剂的协同效应鲜味剂的协同效应 当核苷酸与氨基酸类物质混合使用时，当核苷酸与氨基酸类物质混合使用时，鲜味不是简单的叠加，而是成倍地提高。鲜味不是简单的叠加，而是成倍地提高。 增效：甜味、肉味增效：甜味、肉味 消除：咸、酸、苦

3、味、腥味、焦味消除：咸、酸、苦味、腥味、焦味 历史历史19601960年，日本科学家发现年，日本科学家发现5 5 -IMP-IMP具有强烈鲜味。具有强烈鲜味。6060年代后期，日本成为用发酵法生产核苷酸类物质年代后期，日本成为用发酵法生产核苷酸类物质的最大生产国。的最大生产国。市场上的市场上的“强力味精强力味精”、“加鲜味精加鲜味精”是在普通的是在普通的味精中加少量肌苷酸钠组成。味精中加少量肌苷酸钠组成。7070年代以后，核酸类物质及其衍生物以其具有抗病年代以后，核酸类物质及其衍生物以其具有抗病毒和抗肿瘤的作用，受到医药界的普遍重视毒和抗肿瘤的作用，受到医药界的普遍重视。（二）（二） 生产方法

4、生产方法1. 1. 发酵法发酵法（1 1）一步法：直接发酵法）一步法：直接发酵法（2 2）二步法（发酵转化法）二步法（发酵转化法） 发酵法发酵法 核苷核苷 核苷酸核苷酸2. 2. 酶解法酶解法 酵母酵母 核糖核酸核糖核酸 核苷酸核苷酸提取提取酶解酶解 磷酸化磷酸化二、核苷酸的生物合成途径及其代谢调控二、核苷酸的生物合成途径及其代谢调控（一）（一） 生物合成途径生物合成途径l从头合成途径：从头合成途径： 利用氨基酸等作为原料合成。利用氨基酸等作为原料合成。l补救合成途径：利用体内游离的碱基或核苷合成。补救合成途径：利用体内游离的碱基或核苷合成。1.1.从头合成途径（从头合成途径（denovode

5、novo synthesis synthesis） 由氨基酸、磷酸戊糖、由氨基酸、磷酸戊糖、COCO2 2和和NHNH3 3合成核苷酸。合成核苷酸。嘌呤核苷酸：直接生成次黄嘌呤核苷酸（嘌呤核苷酸：直接生成次黄嘌呤核苷酸（IMPIMP）, ,然后转然后转 变为其它嘌呤核苷酸。变为其它嘌呤核苷酸。 葡萄糖葡萄糖 HMPHMP 5 5磷酸核糖磷酸核糖 磷酸核糖焦磷酸（磷酸核糖焦磷酸（PRPPPRPP） PRPPPRPP转酰胺酶转酰胺酶 5 5 -IMP-IMP AMP SAMP XMP GMP AMP SAMP XMP GMP腺苷酸代琥珀酸合成酶腺苷酸代琥珀酸合成酶 IMP脱氢酶脱氢酶腺苷酸代琥珀酸

6、裂解酶腺苷酸代琥珀酸裂解酶 GMP合成酶合成酶由由IMPIMP合成合成AMPAMP及及GMPGMP AMP-S AMPIMP XMP GMP AspGlnNAD+AMPADPATPADPATP激酶激酶ADPATP激酶激酶GMPGDPGTPADPATP激酶激酶ADPATP激酶激酶IMPIMP合成途径的代谢调控合成途径的代谢调控主要通过产物的负反馈调节主要通过产物的负反馈调节调节包括调节包括: 2: 2个长反馈和个长反馈和2 2个短反馈个短反馈ATPGTPR-5-PATPPRPP合成酶合成酶PRPP酰胺酰胺转移酶转移酶PRAIMPAMPSAMPADPXMPGMPGDP2个长反馈2个短反馈IMPAM

7、PSXMPAMPADPGMPGDPGTPATPATPGTP2.2.补救合成途径（补救合成途径（salvage synthesissalvage synthesis） 微生物从培养基中取得完整的嘌呤、戊糖、微生物从培养基中取得完整的嘌呤、戊糖、磷酸，直接合成单核苷酸。磷酸，直接合成单核苷酸。 当全生物合成途径受阻时，微生物可通过当全生物合成途径受阻时，微生物可通过此途径合成核苷酸。此途径合成核苷酸。 有两条合成途径：有两条合成途径：（1 1）嘌呤碱与）嘌呤碱与PRPPPRPP直接合成嘌呤核苷酸直接合成嘌呤核苷酸次黄嘌呤次黄嘌呤次黄嘌呤核苷酸鸟嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤核苷酸次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(

8、HGPRT)PRPPPRPPPPiPPi腺嘌呤腺嘌呤腺嘌呤核苷酸腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APRT）HGPRT活性高APRT活性低90%90%嘌呤碱嘌呤碱腺嘌呤腺嘌呤+1-+1-磷酸核糖磷酸核糖腺苷腺苷+Pi+Pi核苷磷酸化酶核苷磷酸化酶（2 2）腺嘌呤与）腺嘌呤与1-1-磷酸核糖生成腺苷磷酸核糖生成腺苷, , 再生成腺嘌再生成腺嘌呤核苷酸。呤核苷酸。腺苷腺苷+ATP+ATP腺苷激酶腺苷激酶腺苷酸腺苷酸+ADP+ADP三、肌苷酸的生产三、肌苷酸的生产（一）一步法（一）一步法 1.1.肌苷酸生产菌选育肌苷酸生产菌选育（1 1）解除微生物自身的反馈调节）解除微生物自身的反馈调节a.a.解除解除AMPA

9、MP、GMPGMP对对PRPPPRPP转酰胺酶的反馈抑制。转酰胺酶的反馈抑制。b.b.切断切断5 5 -IMP-IMP继续代谢生成继续代谢生成GMPGMP和和AMPAMP的途径。的途径。 因此，选择可能产生核苷酸的产氨短杆菌因此，选择可能产生核苷酸的产氨短杆菌（Brevibacterium ammoniageneBrevibacterium ammoniagene）为出发菌株，）为出发菌株，诱变为腺嘌呤缺陷型突变株，再诱变为鸟嘌呤诱变为腺嘌呤缺陷型突变株，再诱变为鸟嘌呤缺陷型突变株。缺陷型突变株。 IMPIMP的阻遏如何解决？的阻遏如何解决？ （2 2）改变核苷酸对细胞膜的渗透性）改变核苷酸对

10、细胞膜的渗透性 核苷或碱基容易透过细胞膜，而核苷酸难于透过核苷或碱基容易透过细胞膜，而核苷酸难于透过细胞膜。细胞膜。 日本科学家发现，日本科学家发现，MnMn2+2+对于产氨短杆菌核苷酸的对于产氨短杆菌核苷酸的膜透性起着关键作用，膜透性起着关键作用， MnMn2+2+限量的情况下，菌体产生限量的情况下，菌体产生膨胀异常现象，细胞膜允许膨胀异常现象，细胞膜允许IMPIMP渗透到胞外，积累渗透到胞外，积累IMPIMP。 MnMn2+2+限量与生物素亚适量结果相同，但机制不同。限量与生物素亚适量结果相同，但机制不同。MnMn2+2+亚适量：亚适量：培养后期，细胞形态异常（伸长、膨胀、培养后期，细胞形

11、态异常（伸长、膨胀、不规则）不规则）生物素亚适量：生物素亚适量：为乙酰为乙酰CoACoA羧化酶的辅基，影响脂肪酸羧化酶的辅基，影响脂肪酸生物合成，间接影响细胞膜磷脂合成，从而影响细胞膜生物合成，间接影响细胞膜磷脂合成，从而影响细胞膜透性。透性。2.2.培养条件培养条件（1 1）因所用菌株为腺嘌呤缺陷型，）因所用菌株为腺嘌呤缺陷型，所以添加适量腺嘌所以添加适量腺嘌呤（呤（加加0.5%0.5%酵母膏或酵母水解液酵母膏或酵母水解液）。）。（2 2）MnMn2+2+亚适量亚适量 工业原料和工业用水含较多的工业原料和工业用水含较多的MnMn2+2+，难于控制，难于控制MnMn2+2+亚适量亚适量, ,有

12、两条途径：有两条途径： a.a.筛选对筛选对MnMn2+2+不敏感的突变株不敏感的突变株 b.b.加抗生素或表面活性剂以解除过量加抗生素或表面活性剂以解除过量MnMn2+2+的影响。的影响。（3 3）添加较高浓度的磷盐。）添加较高浓度的磷盐。（二）二步法（肌苷酸生产主要方法）（二）二步法（肌苷酸生产主要方法） 发酵法发酵法 肌苷肌苷 肌苷酸肌苷酸 原因：原因：IMPIMP对细胞膜的透性很差。对细胞膜的透性很差。微生物中普遍存在使微生物中普遍存在使IMPIMP脱磷酸化的酶类。脱磷酸化的酶类。 磷酸化磷酸化1.1.肌苷生产菌的选育肌苷生产菌的选育 常用：常用：枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（Bacil

13、lus Bacillus subtilissubtilis）的腺嘌）的腺嘌呤缺陷型。呤缺陷型。 原因：原因： 该菌磷酸酯酶活性强，有利于将该菌磷酸酯酶活性强，有利于将IMPIMP脱磷酸化脱磷酸化形成肌苷，分泌至胞外，而产氨短杆菌的磷酸酯酶形成肌苷，分泌至胞外，而产氨短杆菌的磷酸酯酶活性较弱。活性较弱。 因此，对因此，对B. B. subtilissubtilis 进行菌种改良，可大量进行菌种改良，可大量积累肌苷。积累肌苷。2.2.培养条件培养条件（1 1）培养基：）培养基：碳源碳源：淀粉水解糖或糖蜜淀粉水解糖或糖蜜氮源氮源：要充分（因肌苷含氮量高，要充分（因肌苷含氮量高，20.920.9）无机

14、盐无机盐：可溶性磷盐有抑制作用（胞外磷酸化）可溶性磷盐有抑制作用（胞外磷酸化）生长因子生长因子：加适量含腺嘌呤的物质，如酵母膏。加适量含腺嘌呤的物质，如酵母膏。 腺嘌呤的最适浓度：腺嘌呤的最适浓度： 不影响菌体生长不影响菌体生长 使肌苷大量积累使肌苷大量积累（2 2）发酵条件）发酵条件 通气搅拌通气搅拌：供氧充足，促进肌苷生成，并可减少：供氧充足，促进肌苷生成，并可减少COCO2 2对肌苷生成的抑制。对肌苷生成的抑制。（3 3）肌苷的提取）肌苷的提取 先过阳离子交换柱，再过活性炭柱（吸附），结晶。先过阳离子交换柱，再过活性炭柱（吸附），结晶。3.3.肌苷的磷酸化肌苷的磷酸化（1 1）酶法：）酶

15、法： 酶：核苷磷酸化酶酶：核苷磷酸化酶（三叶草假单胞菌）（三叶草假单胞菌） 磷酸的供体：对硝基苯磷酸磷酸的供体：对硝基苯磷酸难点：除难点：除5 5 磷酸化产物外，还有磷酸化产物外，还有3 3 - -、2 2 - -位异位异构体，收率构体，收率8585。（2 2）化学法：）化学法：用不同的磷酸化试剂用不同的磷酸化试剂。4.4.肌苷酸的提取肌苷酸的提取 离子交换法离子交换法 除菌体除菌体 除对硝基酚除对硝基酚 柱层析柱层析（过滤、离心）（过滤、离心） 活性炭吸附活性炭吸附加乙醇沉淀加乙醇沉淀 精制（结晶）精制（结晶） 粗制品粗制品 肌苷酸肌苷酸四、鸟苷酸的生产四、鸟苷酸的生产鸟苷酸由鸟嘌呤、核糖和

16、磷酸三部分组成。鸟苷酸由鸟嘌呤、核糖和磷酸三部分组成。19601960年，日本科学家发现年，日本科学家发现5 5鸟苷酸钠具有强烈的鸟苷酸钠具有强烈的鲜味。鲜味。19611961年又证实了香味极浓的著名菇类香菇含年又证实了香味极浓的著名菇类香菇含有大量的鸟苷酸，从此开始研究有大量的鸟苷酸，从此开始研究GMPGMP的生产方法。的生产方法。鸟苷酸的生产方法：鸟苷酸的生产方法：（1 1）由酵母细胞提取出核酸，再以酶法降解；）由酵母细胞提取出核酸，再以酶法降解；（2 2）直接发酵法生产鸟苷酸；）直接发酵法生产鸟苷酸；（3 3）以化学法磷酸化发酵生产的鸟苷；）以化学法磷酸化发酵生产的鸟苷；（4 4）双菌混

17、合发酵法。利用）双菌混合发酵法。利用5 5 一黄苷酸或黄苷酸一黄苷酸或黄苷酸生产菌与能将黄苷酸或黄苷转化为鸟苷酸的菌株生产菌与能将黄苷酸或黄苷转化为鸟苷酸的菌株混合培养。混合培养。（一）二步法（一）二步法 （常用）（常用） 1.1.选用二步法的原因：选用二步法的原因：（1 1）GMPGMP的细胞膜透性很差（限的细胞膜透性很差（限MnMn2+2+） 微生物中普遍存在鸟苷酸的降解酶系（加高浓度磷微生物中普遍存在鸟苷酸的降解酶系（加高浓度磷盐）盐）, ,培养条件较复杂。培养条件较复杂。（2 2）直接发酵法产酸率不高，）直接发酵法产酸率不高，因因GMPGMP是嘌呤核苷酸生是嘌呤核苷酸生物合成的终产物，

18、使鸟苷酸的自身合成受阻。物合成的终产物，使鸟苷酸的自身合成受阻。（3 3）鸟苷的溶解度低，容易析出，相对减弱了反馈调）鸟苷的溶解度低，容易析出，相对减弱了反馈调节的强度，使积累鸟苷成为可能。节的强度，使积累鸟苷成为可能。 2.2.鸟苷生产菌的选育（鸟苷生产菌的选育（鸟苷高产菌株应具备的条件鸟苷高产菌株应具备的条件）（1 1）丧失腺苷酸琥珀酸合成酶活性，即切断肌苷酸到腺）丧失腺苷酸琥珀酸合成酶活性，即切断肌苷酸到腺 苷酸的通路。苷酸的通路。（2 2）鸟苷分解酶的活性微弱。）鸟苷分解酶的活性微弱。（3 3）解除鸟苷酸的反馈抑制与阻遏。）解除鸟苷酸的反馈抑制与阻遏。（4 4）由肌苷酸脱氢酶、鸟苷酸合

19、成酶催化的反应，比核）由肌苷酸脱氢酶、鸟苷酸合成酶催化的反应，比核 苷酸酶催化的反应优先进行，从而抑制肌苷的产生。苷酸酶催化的反应优先进行，从而抑制肌苷的产生。 按上述要求，利用枯草芽孢杆菌腺嘌呤缺陷型加以诱按上述要求，利用枯草芽孢杆菌腺嘌呤缺陷型加以诱变获得。变获得。3.3.鸟苷发酵条件鸟苷发酵条件（1 1）培养基）培养基 碳源碳源：葡萄糖或麦芽糖：葡萄糖或麦芽糖 氮源氮源：硫酸铵（氯化铵、大豆蛋白水：硫酸铵（氯化铵、大豆蛋白水 解液）、流加氨水解液）、流加氨水 无机盐无机盐：磷、镁、铁、锰：磷、镁、铁、锰 嘌呤前体物嘌呤前体物：L-L-谷氨酸钠谷氨酸钠 营养缺陷型菌株的营养物质营养缺陷型菌

20、株的营养物质（2 2）发酵条件）发酵条件 温度温度：3636（0 024h24h） 36.5 36.537.5 37.5 （24h24h后）后） pHpH值值：pHpH值下降，值下降，流加氨水流加氨水。 溶氧溶氧： 发酵周期：发酵周期：48h48h左右左右（3 3）鸟苷的分离提取）鸟苷的分离提取 灭菌后发酵液灭菌后发酵液除菌体除菌体一次结晶一次结晶过滤过滤鸟苷粗品鸟苷粗品脱色脱色过滤过滤二次结晶二次结晶过滤过滤鸟苷鸟苷 烘干烘干磨粉磨粉 包装包装（二）酶法（又称核酸水解法）（二）酶法（又称核酸水解法） 起始于日本，起始于日本，50506060年代研制成功，技年代研制成功，技术关键是筛选到产生术

21、关键是筛选到产生5 5 磷酸二酯酶（核酸磷酸二酯酶（核酸外切酶）的菌株。外切酶）的菌株。 1. 1.原理原理 5 5 磷酸二酯酶能水解核糖上磷酸二酯酶能水解核糖上3 3 碳原子羟碳原子羟基与磷酸形成的二酯键，生成基与磷酸形成的二酯键，生成4 4种种5 5 单核苷酸，单核苷酸，即：从游离即：从游离3 3 羟基端开始，逐个水解下羟基端开始，逐个水解下5 5 单单核苷酸。核苷酸。 特点：特点：工艺简单，得率高，副产物也为医药产品。工艺简单，得率高，副产物也为医药产品。核酸的降解过程核酸的降解过程核酸酶（磷酸二酯酶）核酸酶（磷酸二酯酶）核苷酸酶（磷酸单酯酶）核苷酸酶（磷酸单酯酶）核苷磷酸化酶核苷磷酸化

22、酶核酸核酸核苷酸核苷酸核苷核苷磷酸磷酸嘌呤或嘧啶嘌呤或嘧啶戊糖戊糖-1-磷酸磷酸某些核酸外切酶对某些核酸外切酶对RNARNA、DNADNA均有作用：均有作用：牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶3 -核苷酸核苷酸蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶5 -核苷酸核苷酸 2.2.磷酸二酯酶的制备磷酸二酯酶的制备（1 1）桔青霉（）桔青霉（Penicillium citrinumPenicillium citrinum） 可用固体发酵（制曲、浸泡、抽提）可用固体发酵（制曲、浸泡、抽提）（2 2）金色链霉菌（）金色链霉菌（Streptomyces aureusStreptomyces aureus） 液体深层发酵，该

23、菌不仅含有液体深层发酵，该菌不仅含有5 5 磷酸二酯酶，磷酸二酯酶，同时含有脱氨酶，使其中的同时含有脱氨酶，使其中的5 5 AMPAMP脱氨后生成脱氨后生成5 5 -IMP-IMP。 因此，使用该菌产生助鲜剂时，由于含有两种酶，因此，使用该菌产生助鲜剂时，由于含有两种酶，可同时得到可同时得到IMPIMP和和GMPGMP。3.3.核酸提取核酸提取（1 1）鲜酵母制备）鲜酵母制备（2 2）提取核酸（）提取核酸（RNARNA） l干酵母片研碎，干酵母片研碎，10%Nacl10%Nacl沸水浴浸提沸水浴浸提30min30min。 l冰盐浴冷却，离心取上清夜。冰盐浴冷却，离心取上清夜。 l等电点沉淀。等电点沉淀。 l乙醇洗涤，离心，重复乙醇洗涤，离心，重复3 3次。次。 l干燥，称重。干燥，称重。4.4.核酸酶解核酸酶解 核酸溶液核酸溶液 5 5 单核苷酸混合液单核苷酸混合液5. 55. 5 鸟苷酸的分离鸟苷酸的分离 离子交换树脂离子交换树脂 5 5 磷酸二酯酶磷酸二酯酶