标记免疫分析课件.ppt
- 【下载声明】
1. 本站全部试题类文档,若标题没写含答案,则无答案;标题注明含答案的文档,主观题也可能无答案。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
2. 本站全部PPT文档均不含视频和音频,PPT中出现的音频或视频标识(或文字)仅表示流程,实际无音频或视频文件。请谨慎下单,一旦售出,不予退换。
3. 本页资料《标记免疫分析课件.ppt》由用户(三亚风情)主动上传,其收益全归该用户。163文库仅提供信息存储空间,仅对该用户上传内容的表现方式做保护处理,对上传内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知163文库(点击联系客服),我们立即给予删除!
4. 请根据预览情况,自愿下载本文。本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
5. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007及以上版本和PDF阅读器,压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 标记 免疫 分析 课件
- 资源描述:
-
1、7. 3 标记免疫分析标记免疫分析 针对抗原针对抗原-抗体反应缺乏高灵敏的定量检测抗体反应缺乏高灵敏的定量检测信号的缺点,人们发展了在分析体系中引入探信号的缺点,人们发展了在分析体系中引入探针系统针系统-标记技术的方法,从而开创了微量和超标记技术的方法,从而开创了微量和超微量分析的新天地。微量分析的新天地。标记免疫分析标记免疫分析是将已知抗是将已知抗体或抗原标记上易显示的物质,通过检测标记体或抗原标记上易显示的物质,通过检测标记物,反映有无抗原物,反映有无抗原-抗体反应,从而间接测定微抗体反应,从而间接测定微量的抗原或抗体。量的抗原或抗体。 作为一种分析技术,标记免疫分析最早建立于作为一种分析
2、技术,标记免疫分析最早建立于1954年,它是由美国科学家年,它是由美国科学家R.S.Yallow和和S.A.Berson利利用放射同位素用放射同位素125I标记胰岛素,并使其与血浆中游标记胰岛素,并使其与血浆中游离的胰岛素共同竞争有限的胰岛素抗体的特异性结离的胰岛素共同竞争有限的胰岛素抗体的特异性结合位点,最终形成的放射性抗原合位点,最终形成的放射性抗原-抗体复合物与待抗体复合物与待测物含量呈线性负相关,应用测物含量呈线性负相关,应用 -或或 -计数器进行检计数器进行检测,这种方法称为测,这种方法称为放射免疫分析法放射免疫分析法。该方法在当时。该方法在当时及其随后的及其随后的20年中是生物分析
3、检测中最重要的成就,年中是生物分析检测中最重要的成就,R.Yallow由此于由此于1977年获得了诺贝尔奖。年获得了诺贝尔奖。 近年来标记免疫分析飞速发展,应用不同的标记近年来标记免疫分析飞速发展,应用不同的标记物,根据不同原理、不同技术建立起来的检测方物,根据不同原理、不同技术建立起来的检测方法层出不穷。常用的标记物有放射性同位素、酶、法层出不穷。常用的标记物有放射性同位素、酶、荧光素、化学发光试剂、镧系稀土元素等。与这荧光素、化学发光试剂、镧系稀土元素等。与这些标记物相对应的免疫分析方法分别称为些标记物相对应的免疫分析方法分别称为放射免放射免疫分析法疫分析法(RIA)、)、酶联免疫吸附测定
4、法酶联免疫吸附测定法(ELISA)、)、荧光免疫分析法荧光免疫分析法(FIA)、)、化学发光化学发光免疫分析法免疫分析法(CLIA)、)、时间分辨荧光免疫分析法时间分辨荧光免疫分析法(TrFIA)等多种。)等多种。 根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的标记抗原或标记抗体,标记免疫分析又分为异相标标记抗原或标记抗体,标记免疫分析又分为异相标记免疫分析和均相免疫分析两大类。记免疫分析和均相免疫分析两大类。 7. 3. 1 异相标记免疫分析的基本原理异相标记免疫分析的基本原理 异相标记免疫分析异相标记免疫分析是一种需要在检测前分离是一种需要在检测前
5、分离游离的标记抗原或标记抗体的方法,它是医学检验游离的标记抗原或标记抗体的方法,它是医学检验中常用的方法。中常用的方法。 尽管目前已发展了许多涉及异相标记免疫分尽管目前已发展了许多涉及异相标记免疫分析的方法,在原理上它主要包括两种:其一析的方法,在原理上它主要包括两种:其一是利用标记抗原与待测抗原共同竞争有限的是利用标记抗原与待测抗原共同竞争有限的抗体结合位点的抗体结合位点的竞争结合免疫分析竞争结合免疫分析;其二是;其二是标记抗体过量的标记抗体过量的非竞争性免疫分析非竞争性免疫分析。这些方。这些方法均有商品化试剂盒和自动化检测仪器。法均有商品化试剂盒和自动化检测仪器。一、竞争结合免疫分析一、竞
6、争结合免疫分析 这一技术的基本原理是固定抗体的量,通这一技术的基本原理是固定抗体的量,通过待测抗原与标记抗原间的竞争,获得可测定的过待测抗原与标记抗原间的竞争,获得可测定的免疫复合物,检测信号与待测抗原浓度成反比。免疫复合物,检测信号与待测抗原浓度成反比。任何可逆的特征键合蛋白质或细胞受体均可用此任何可逆的特征键合蛋白质或细胞受体均可用此法进行分析测定。其过程可用下式表示:法进行分析测定。其过程可用下式表示: Ag AgAb + Ab (7.3) Ag* Ag*Abk1 k2 其中标记抗原其中标记抗原Ag*与抗体与抗体Ab的浓度或总量是固定的浓度或总量是固定已知的,达到平衡时与抗体结合的标记抗
7、原已知的,达到平衡时与抗体结合的标记抗原Ag*的量与样品中抗原的量与样品中抗原Ag的量成反比。利用标准曲线的量成反比。利用标准曲线法可以测出待测抗原的量。当然在检测前需分离法可以测出待测抗原的量。当然在检测前需分离游离的标记抗原。游离的标记抗原。二、非竞争免疫分析二、非竞争免疫分析 利用过量的标记抗体与待测抗原形成抗原抗利用过量的标记抗体与待测抗原形成抗原抗体免疫复合物。由于抗体过量,所有待测抗原均形体免疫复合物。由于抗体过量,所有待测抗原均形成络合物,无需建立反应平衡:成络合物,无需建立反应平衡:Ag + Ab* AgAb* + Ab* (7.4) 形成的复合物与形成的复合物与Ag浓度成正比
8、。最后,分离已复浓度成正比。最后,分离已复合的合的Ab*和游离的和游离的Ab*进行测定。进行测定。 7. 3. 2 均相免疫分析均相免疫分析 均相法的最大特点是结合和未结合的抗原或均相法的最大特点是结合和未结合的抗原或抗体不需物理分离过程即可直接测定,使标记免抗体不需物理分离过程即可直接测定,使标记免疫分析更方便地实现自动化。最常用的体系是酶疫分析更方便地实现自动化。最常用的体系是酶放大免疫技术(放大免疫技术(EMIT),这一方法对小分子),这一方法对小分子(半抗原)如药物的测定特别有用。(半抗原)如药物的测定特别有用。 用酶标记抗原后,酶保持它的生物活性。当酶标抗用酶标记抗原后,酶保持它的生
9、物活性。当酶标抗原与抗体反应后,酶的活性由于空间立体阻碍或构原与抗体反应后,酶的活性由于空间立体阻碍或构象改变而被抑制(图象改变而被抑制(图7.7)。)。这种抑制随着游离抗这种抑制随着游离抗原浓度的增加而减弱,因而酶的活性及其催化产物原浓度的增加而减弱,因而酶的活性及其催化产物所给出的信号也就越强,利用标准曲线可测定抗原所给出的信号也就越强,利用标准曲线可测定抗原浓度。浓度。 图图7.7 酶放大免疫技术检测原理示意图酶放大免疫技术检测原理示意图 另一个均相免疫分析体系是利用磷光偏振技术,另一个均相免疫分析体系是利用磷光偏振技术,又称荧光偏振免疫分析(又称荧光偏振免疫分析(FPIA)。荧光物质经
10、一)。荧光物质经一平面的偏振光照射后,可跃入激发态,当其释放平面的偏振光照射后,可跃入激发态,当其释放能量回到基态时,便发出偏振荧光。荧光偏振强能量回到基态时,便发出偏振荧光。荧光偏振强度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比。分度与荧光物质受激发时分子转动速度成反比。分子越大,旋转越慢,发出的偏振光越强。荧光偏子越大,旋转越慢,发出的偏振光越强。荧光偏振免疫技术中偏振光强度的变化如图振免疫技术中偏振光强度的变化如图7.8所示。所示。例如,将荧光素标记的小分子药物和例如,将荧光素标记的小分子药物和待测药物一起与该小分子药物的抗体待测药物一起与该小分子药物的抗体混合。若体液中待测未标记的小分子混合
11、。若体液中待测未标记的小分子药物浓度低,则标记的药物分子与抗药物浓度低,则标记的药物分子与抗体结合的就多,由于抗体分子大,所体结合的就多,由于抗体分子大,所形成的荧光素标记的药物分子与抗体形成的荧光素标记的药物分子与抗体的结合物体积亦大,旋转减慢,荧光的结合物体积亦大,旋转减慢,荧光偏振光强度就高。反之,荧光偏振光偏振光强度就高。反之,荧光偏振光强度就低。利用所产生的荧光偏振信强度就低。利用所产生的荧光偏振信号与待测物浓度成反比,通过标准曲号与待测物浓度成反比,通过标准曲线可以进行定量分析。线可以进行定量分析。 图图7.8 FPIA原理示意图原理示意图7. 3. 3 放射免疫分析放射免疫分析
12、如前文所述,放射免疫分析(如前文所述,放射免疫分析(RIA)是最早)是最早建立的标记免疫分析方法,它是将同位素标记技建立的标记免疫分析方法,它是将同位素标记技术与抗原抗体反应相结合的一种微量分析方法,术与抗原抗体反应相结合的一种微量分析方法,广泛用于激素、药物、细胞因子、抗体、肿瘤标广泛用于激素、药物、细胞因子、抗体、肿瘤标志物等化合物的定量分析,检测范围可达志物等化合物的定量分析,检测范围可达10-910-12 ng mL-1,是灵敏、可靠的免疫分析方法之一,是灵敏、可靠的免疫分析方法之一,现已有现已有300多种微量物质用此法测定。多种微量物质用此法测定。 常用来标记抗原或抗体的同位素有常用
13、来标记抗原或抗体的同位素有125I,131I,3H和和35S。放射活性检测用液体闪烁计数,固相体系则。放射活性检测用液体闪烁计数,固相体系则用用X射线胶片显影。射线胶片显影。 在临床上将利用放射同位素标记抗原通过竞在临床上将利用放射同位素标记抗原通过竞争法原理进行测定的方法称为争法原理进行测定的方法称为放射免疫分析放射免疫分析(RIA),而将放射性同位素标记抗体,利用夹心),而将放射性同位素标记抗体,利用夹心法检测的方法称为法检测的方法称为免疫放射分析免疫放射分析(IRMA)。)。放射免疫分析放射免疫分析的原理是用已知的标记抗原与标本中的原理是用已知的标记抗原与标本中可能存在的抗原竞争一定量的
14、已知抗体,分别形成可能存在的抗原竞争一定量的已知抗体,分别形成标记的抗原抗体结合物(标记的抗原抗体结合物(B)和无标记的抗原抗体)和无标记的抗原抗体结合物(结合物(F)。然后将两者分离,并根据测得的放)。然后将两者分离,并根据测得的放射性强度,算出结合率射性强度,算出结合率B/(B十十F),它与标本中,它与标本中抗原的量成反比。实验时除作标本检测外,还要以抗原的量成反比。实验时除作标本检测外,还要以不同浓度的已知抗原参与反应得到的数据给出竞争不同浓度的已知抗原参与反应得到的数据给出竞争抑制曲线,作为定量分析的依据。抑制曲线,作为定量分析的依据。 免疫放射分析免疫放射分析是将抗体固定在管壁或是将
15、抗体固定在管壁或载体上,待测抗原与固定抗体反应后,载体上,待测抗原与固定抗体反应后,倒掉反应液,生成物抗原倒掉反应液,生成物抗原-抗体复合物抗体复合物留于管底或固定相载体上,再加入标留于管底或固定相载体上,再加入标记抗体,在固相上形成抗原记抗体,在固相上形成抗原-抗体抗体-标记标记抗体的复合物,洗涤后测定放射性强抗体的复合物,洗涤后测定放射性强度,从而推算出标本中抗原的含量。度,从而推算出标本中抗原的含量。这种形成抗原这种形成抗原-抗体抗体-标记抗体的复合物标记抗体的复合物的免疫检测方法又称为夹心法,它是的免疫检测方法又称为夹心法,它是固相免疫法的一种,其原理如图固相免疫法的一种,其原理如图7
16、.9所所示。示。 图图7.9 利用夹心法进行利用夹心法进行检测的免疫放射分析流检测的免疫放射分析流程图程图标记抗原的放射性同位素有:标记抗原的放射性同位素有:1H、14C、131I和和125I。H和和C的标记较为复杂,而的标记较为复杂,而I的标记比较简单,且的标记比较简单,且131I和和125I的半衰期分别是的半衰期分别是8.05天和天和60天,无论是检天,无论是检测还是后处理都合适,故在应用中最常用的是放射测还是后处理都合适,故在应用中最常用的是放射性性125I的的射线(射线(0.035 meV)。)。 尽管放射免疫分析具有诸多优点,且易于制成尽管放射免疫分析具有诸多优点,且易于制成配套试剂
17、盒,实现自动化检测,并已成为颇具权威配套试剂盒,实现自动化检测,并已成为颇具权威性的分析方法,但由于放射性同位素的使用带来了性的分析方法,但由于放射性同位素的使用带来了污物处理的难题,不仅有可能损害操作人员的健康,污物处理的难题,不仅有可能损害操作人员的健康,而且限制了而且限制了“试剂试剂”的寿命,难以获得长期稳定的的寿命,难以获得长期稳定的检测标准,在检测标准,在RIA方法的启发下,陆续发展了一系方法的启发下,陆续发展了一系列非放射性的标记免疫分析方法。列非放射性的标记免疫分析方法。 7. 3. 4 酶联免疫分析酶联免疫分析 1966年年Engrall等人将抗原抗体免疫反应和酶等人将抗原抗体
18、免疫反应和酶的高催化作用相结合,用特定的酶标记抗原或抗的高催化作用相结合,用特定的酶标记抗原或抗体,酶催化底物的显色程度,对待测物进行定性体,酶催化底物的显色程度,对待测物进行定性或定量测定,建立了或定量测定,建立了酶免疫分析法酶免疫分析法(EIA)。目)。目前,常用的前,常用的EIA法是酶联免疫吸附测定法法是酶联免疫吸附测定法(ELISA),其检测原理如图),其检测原理如图7.10所示。所示。 A. 直接法(1)抗体包被(2)抗原包被B. 间接法C. 夹心法(1)直接夹心法(2)间接夹心法:抗原:酶标抗原:抗体:酶标抗体:底物产物图图7.10 ELISA的检测原理的检测原理方法之一是将抗原或
19、抗体吸附于固相载体上,分别方法之一是将抗原或抗体吸附于固相载体上,分别加入检样和酶标抗体或酶标抗原进行竞争反应,而加入检样和酶标抗体或酶标抗原进行竞争反应,而后利用酶催化其底物显色反应来进行检测。该方法后利用酶催化其底物显色反应来进行检测。该方法又称又称直接法直接法,可用于检测大分子抗原和小分子抗原,可用于检测大分子抗原和小分子抗原,也可用于检测抗体,显色的深浅与标本中待测抗原也可用于检测抗体,显色的深浅与标本中待测抗原或抗体量成反比。以测定抗原为例,待测样品中的或抗体量成反比。以测定抗原为例,待测样品中的抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合,待测抗原含抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合,待测抗原含
20、量越多,能与固相抗体结合的酶标抗原就越少,则量越多,能与固相抗体结合的酶标抗原就越少,则显色越浅。显色越浅。 在检测抗体时,将抗原包被于固相载体,加入待测在检测抗体时,将抗原包被于固相载体,加入待测血清反应后,洗去未参与反应的无关蛋白成分后,血清反应后,洗去未参与反应的无关蛋白成分后,加入酶标记的抗体(如酶标抗人加入酶标记的抗体(如酶标抗人IgG作为第二抗体)作为第二抗体)或酶标记的抗原,使其与固相载体上抗原待测抗或酶标记的抗原,使其与固相载体上抗原待测抗体复合物反应,在固相载体上形成抗原待测抗体体复合物反应,在固相载体上形成抗原待测抗体酶标记抗体(或抗原待测抗体酶标记抗原)酶标记抗体(或抗原
展开阅读全文