生物一轮复习专题一基因工程课件.ppt

1、黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端 1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶二、基因工程的“基本工具”EcoRI 1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 一种限制性内切酶只能一种限制性内切酶只能识别识别双链双链DNA分子分子 的某种的某种 ，并且使每一条链，并且使每一条链中中 的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的 断断开（开（切割切割DNA分子）分子）a.来源：来源： b.作用：作用：二、基因工程的“基本工具”形成形成平未端平未端（SmaI）及）及黏性未端黏性未端（EcoRI）主要从原核细胞分离主要从原核细胞分离 P5特定的核苷酸序列特定的核苷酸序列特定部位特定部位 磷酸二酯键磷酸二酯键 2.

2、DNA2.DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针”种类种类来源来源作用部作用部位位连接末端连接末端连接连接对象对象Ecoli DNA连接连接酶酶T4 DNA连连接酶接酶 大肠大肠杆菌杆菌T4噬噬菌体菌体磷酸二磷酸二酯键酯键黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端和平末端和平末端DNADNA片段片段 种类种类项目项目限制酶限制酶DNADNA连连接酶接酶DNADNA聚合酶聚合酶解旋酶解旋酶作用作用底物底物作用作用部位部位作用作用特点特点作用作用结果结果DNADNA分子分子DNADNA分子分子片段片段脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNADNA分子分子磷酸二磷酸二酯键酯键磷酸二磷酸二酯键酯键磷酸二磷酸二酯键酯键碱基对

3、间碱基对间的氢键的氢键切割目的基因及载体，切割目的基因及载体，能专一性识别双链能专一性识别双链DNADNA分子的某种特定的核分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的一条链中特定部位的两个核苷酸之间的两个核苷酸之间的磷磷酸二酯键断开酸二酯键断开将双链将双链DNADNA片段片段“缝合缝合”起来，起来，恢复恢复被限制酶切被限制酶切开了的两个开了的两个核苷酸之间核苷酸之间的的磷酸二酯磷酸二酯键键只能将只能将单单个个脱氧核脱氧核苷酸苷酸添加添加到脱氧核到脱氧核苷酸链苷酸链上上将将DNADNA两条链之两条链之间的间的氢键氢键打开打开形成黏性末端形成黏性末端或平末端或平末端形

4、成重组形成重组DNADNA分子分子形成新的形成新的DNADNA分子分子形成单链形成单链DNADNA分子分子下图为下图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A BC DC据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（据右图所示，有关工具酶功能的叙述不正确的是（ ）A. 限制性内切酶可以切断限制性内切酶可以切断a处，处，DNA连接酶可以连接连接酶可以连接a处处B. DNA聚合酶可以连接聚合酶可以连接a处处C. 解

5、旋酶可以使解旋酶可以使b处解开处解开D. 连接连接C处的酶可以为处的酶可以为DNA连接酶连接酶D 3. 3.分子运载车分子运载车运载体运载体（1 1） 作用：作用：将目的基因送入受体细胞将目的基因送入受体细胞（2 2） 具备的条件：具备的条件：a.a.能在受体细胞中稳定存在并复制能在受体细胞中稳定存在并复制b.b.具有一个或多个酶切位点，便于目的基因插入具有一个或多个酶切位点，便于目的基因插入. .c. c.有标记基因，便于筛选有标记基因，便于筛选. .d.d.对受体细胞无害对受体细胞无害. .质粒质粒、噬菌体、动植物病毒、噬菌体、动植物病毒（3 3）种类：）种类：质粒质粒细菌拟核细菌拟核DN

6、ADNA之外结构简单、之外结构简单、能能自主复制自主复制的很小的的很小的环状环状DNADNA分子分子。特别提醒特别提醒1.一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造天然的载体进行人工改造2.限制酶限制酶切割位点切割位点所处的位置必须是在所处的位置必须是在所需的标所需的标记基因之外记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的记忆的检测。有利于对目的记忆的检测。二、基因工程的基本操作程序（步骤）获取目的基因获取目的基

7、因构建表达载体构建表达载体导入受体细胞导入受体细胞目的基因检测与鉴定目的基因检测与鉴定第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步（一）目的基因的获取2.获取方法获取方法（2 2）. .从从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因1 1）基因组文库（鸟枪法）基因组文库（鸟枪法）提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库1.目的基因：目的基因：主要是指编码蛋白质的基因主要是指编码蛋白质的基因2 2）部分基因文库（）部分基因文库（CDNACDNA）（1 1）. .从供

8、体细胞从供体细胞直接提取直接提取（3 3）利用）利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因1 1）原理：）原理： 2 2）条件：）条件：DNADNA复制复制 目的基因（模板）、引物、原料（目的基因（模板）、引物、原料（4 4种种脱氧核苷酸）、耐高温的脱氧核苷酸）、耐高温的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）、酶）、能量等能量等 3 3）过程：）过程： 高温变性高温变性（9095）低温退火低温退火（5560）中温延伸中温延伸（7075）多次多次重复重复4 4）方式：以）方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循环循环 的次数）的次数）指数指数2 2n n（4 4）.

9、 .人工合成人工合成1 1）利用相应）利用相应mRNAmRNA反转录反转录形成形成 mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶单链单链DNADNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA2 2）根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA 蛋白质的蛋白质的氨基酸序氨基酸序列列推测推测mRNAmRNA的的核苷酸核苷酸序列序列推测推测基因的基因的核苷酸核苷酸序列序列化学化学合成合成目的目的基因基因放入放入DNA合成仪中合成仪中1.1.构建目的：构建目的： 使目的基因在受体细胞中使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在，并且，并且可可遗传给下一代遗传给下一代，同时，使目的基因能够，同

10、时，使目的基因能够表达和发挥作用表达和发挥作用。2.2.构建零件及其作用构建零件及其作用（1 1）目的基因目的基因（2 2）启动子启动子：是基因首端上：是基因首端上RNARNA聚合酶的识别和结合的位点，聚合酶的识别和结合的位点，驱动转录。驱动转录。（二）基因表达载体的构建（核心）（3）终止子终止子：位于基因尾端，使转录终止：位于基因尾端，使转录终止（4）标记基因标记基因 ： 便于筛选出含有目的基因的受体细胞（常便于筛选出含有目的基因的受体细胞（常使用抗性基因或荧光蛋白基因作为标记基因）使用抗性基因或荧光蛋白基因作为标记基因）DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组

11、质粒）3.3.基因表达载体的构建一般过程基因表达载体的构建一般过程基因表达载体基因表达载体连接启动子、终止子等连接启动子、终止子等质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口四个黏性末端四个黏性末端同一种同一种目的基因目的基因注意注意：构建过程中工具酶的使用与任意连接的现象构建过程中工具酶的使用与任意连接的现象（三）将目的基因导入受体细胞生物种类生物种类受体细胞受体细胞导入方法导入方法植物植物动物动物微生物微生物体细胞体细胞或受精或受精卵卵受精卵受精卵农杆菌转化法农杆菌转化法 基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射

12、法感受态细胞处理法感受态细胞处理法1.1.导入植物细胞导入植物细胞（农杆菌转化法农杆菌转化法）TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上目的目的基因基因插入插入转入转入农农杆杆菌菌导入导入植物植物细胞细胞植物细植物细胞染色胞染色体体DNA插入插入表达表达2.2.导入动物细胞导入动物细胞( (显微注射技术显微注射技术) )含目的基因含目的基因的表达载体的表达载体显微显微注射注射动动 物物 的的受受 精精 卵卵含目的基因含目的基因的受精卵的受精卵分裂分裂 分化分化早期胚胎早期胚胎雌性动物输雌性动物输卵管或子宫卵管或子宫发发育育转基因动物转基因动物移移 植植3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基

13、因导入微生物细胞感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNADNA表达载体与感表达载体与感受态细胞混合受态细胞混合用用CaCa2+2+处理处理细胞细胞 （CaClCaCl2 2溶液）溶液）感受态感受态细胞细胞原核生物特点：繁原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：检查是否成功导检查是否成功导入与表达入与表达1.1.分子检测分子检测导入检测：是否插入了目的基因导入检测：是否插入了目的基因转录检测：是否转录出了转录检测：是否转录出了mRNAmRNA翻译检测：是否翻译成蛋白质翻译检测：是否翻译成蛋白质方法方法DNADNA分子杂交分子杂交(DNA-DNA)(DNA-DNA)方

14、法方法分子杂交分子杂交(DNA-mRNA)(DNA-mRNA)方法方法抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交2.2.个体鉴定个体鉴定: : 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等（四）目的基因的检测与鉴定（四）目的基因的检测与鉴定（根据是否显现（根据是否显现出出杂交代杂交代判断）判断）特别提醒特别提醒 师说师说P2201.目的基因的目的基因的插入位点不是随意插入位点不是随意的，基因表达需的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子到启动子与终止子之间的部位之间的部位2.基因工程操作过程中基因工程操作过程中只有第

15、三步只有第三步（将目的基因（将目的基因导入受体细胞）导入受体细胞）没有碱基互补配对现象没有碱基互补配对现象，第一步，第一步存在逆转录法获得存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。3.以以目的基因目的基因的单链作为分子杂交技术的基因探的单链作为分子杂交技术的基因探针针三、基因工程的应用三、基因工程的应用（一）植物基因工程（一）植物基因工程1.1.抗虫转基因植物（抗虫转基因植物（如转基因抗虫棉如转基因抗虫棉减轻农药对环境的污染减轻农药对环境的污染）2.2. 抗病转基因生物抗病转基因生物（抗病毒

16、、细菌或真菌转基因植物抗病毒、细菌或真菌转基因植物）3.3.抗逆转基因作物抗逆转基因作物（如转如转鱼抗冻蛋白基因鱼抗冻蛋白基因番茄、转基因抗除番茄、转基因抗除草剂玉米草剂玉米）4.4.改良植物的品质（改良植物的品质（如富含赖氨酸的转基因玉米、转基因延如富含赖氨酸的转基因玉米、转基因延熟番茄熟番茄）（二）动物基因工程（二）动物基因工程1.1.提高动物生长速度提高动物生长速度 如如转生长激素基因鲤鱼转生长激素基因鲤鱼2 2. .改善畜产品的品质改善畜产品的品质 如如低乳糖转基因牛（转肠乳糖酶基因）低乳糖转基因牛（转肠乳糖酶基因）3.3.生产药物生产药物 生物反应器生物反应器（如乳腺生物反应器、膀胱

17、生物反（如乳腺生物反应器、膀胱生物反应器）应器）注：注：构建基因表达载体时需在目的基因前加入在某器官构建基因表达载体时需在目的基因前加入在某器官特异表达的启动子特异表达的启动子，使目的基因只在特定器官中表达并，使目的基因只在特定器官中表达并被分泌。被分泌。如如牛乳腺生物反应器时基因表达载体包括牛乳腺生物反应器时基因表达载体包括：牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子+ +目的基目的基因因+ +标记基因标记基因+ +终止子终止子+ +复制原点复制原点4.4.做器官移植供体做器官移植供体利用某种利用某种调节因子抑制或设法除去调节因子抑制或设法除去供体器官供体器官抗原抗原决定基因的

18、表达决定基因的表达，获得，获得没有免疫排斥反应没有免疫排斥反应的转基的转基因克隆猪器官因克隆猪器官（三）基因工程药物（三）基因工程药物利用基因工程方法制造转基因的利用基因工程方法制造转基因的工程菌工程菌，可，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。用基因工程方法，使外源基因得到高用基因工程方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。效率表达的菌类细胞株系。我国已生产的药物：我国已生产的药物：白细胞介素白细胞介素-2-2、干扰素、乙、干扰素、乙肝疫苗等肝疫苗等（四）基因诊断与基因治疗（四）基因诊断与基因治疗 1.1.基因诊断：基因诊断：用放射性同位素等

19、标记的用放射性同位素等标记的“DNADNA探针探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。且迅速。2.2.基因治疗：基因治疗：把健康的外源基因导入有基因缺陷的把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。细胞中，达到治疗疾病的目的。类型类型体外基因治疗体外基因治疗体内基因治疗体内基因治疗特别提醒特别提醒 师说师说P2211.并非所有的个体都可作为乳腺生物反应器：操并非所有的个体都可作为乳腺生物反应器：操作成功的应该是作成功的应该是雌性个体雌性个体，个体本身的繁殖速度，个体本身的繁殖速度较高，泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。较高，泌乳量、蛋白含量等都是应该考虑的因素。2.基因治疗后，基因治疗后，缺陷基因没有改变缺陷基因没有改变，基因治疗是，基因治疗是把正常基因导入受体细胞中，以表达正常产物从把正常基因导入受体细胞中，以表达正常产物从而治疗疾病，对原来细胞中存在缺陷的基因没有而治疗疾病，对原来细胞中存在缺陷的基因没有清除或改变（课本清除或改变（课本P24）