质粒酶切鉴定课件.ppt
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- 质粒 鉴定 课件
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1、1. 实验目的和要求实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法,并解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法,并理解限制性内切酶是理解限制性内切酶是DNA重组技术的重组技术的关键工具,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴关键工具,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定定DNA片段的有效方法。片段的有效方法。 2. 相关基础知识相关基础知识 限制性核酸内切酶:是一类能识别双限制性核酸内切酶:是一类能识别双链链DNA分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的DNA水水解酶。是体外剪切基因片段的重要工解酶。是体外剪切基因片段的重要工具,所以常常与核酸聚合酶、连接酶具,所以常常与
2、核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重组中重要的工具,而且还可以用于基因组重要的工具,而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。酶切图谱的鉴定。1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象2) 核酸限制性内切酶的类型核酸限制性内切酶的类型3) 核酸限制性内切酶的基本特性核酸限制性内切酶的基本特性4) 同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶5) 核酸限制性内切酶的命名法核酸限制性内切酶的命名法6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制
3、与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各各种细菌都能合成一种或几种能够切割种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双双链的核酸内切酶,链的核酸内切酶,它们以此来限制外源它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内,但合成存在于自身细胞内,但合成这种酶的细胞自这种酶的细胞自身的身的DNA不受影响,因为这种细胞还合成了不受影响,因为这种细胞还合成了一种修饰酶,对自身的一种修饰酶,对自身的DNA进行了修饰,限进行了修饰,限制性酶对修饰过的制性酶对修饰过的DNA不能起作用。不能起作用。这种现这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。象被称为寄主控制的限制与修饰现象
4、。2)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及以及切切断核酸的情况不同,分为三类:断核酸的情况不同,分为三类: 型型 型型* 型型第一类(第一类(I I型)限制性内切酶型)限制性内切酶能识别专一能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割核苷酸上切割DNADNA分子中的双链,但是切分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。这类限制性内切酶在这类限制性内切酶在DNADNA重组技术或基因重组技术或基因工程中用处不大,无法
5、用于分析工程中用处不大,无法用于分析DNADNA结构结构或克隆基因。这类酶如或克隆基因。这类酶如EcoBEcoB、EcoKEcoK等。等。 第二类第二类(II(II型型) )限制性内切酶限制性内切酶能识别专一的核能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此,这种限制性内的核苷酸都是专一的。因此,这种限制性内切酶是切酶是DNADNA重组技术中最常用的工具酶之一。重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是这种酶识别的专一核苷酸顺序
6、最常见的是4 4个或个或6 6个核苷酸,少数也有识别个核苷酸,少数也有识别5 5个核苷酸以个核苷酸以及及7 7个、个、8 8个、个、9 9个、个、1010个和个和1111个核苷酸的。个核苷酸的。 II II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向朝二个方向“读读”都完全相同。这种酶的切都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式:割可以有两种方式:粘性末端;是交错切割,结果形成两条单链末端,粘性末端;是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末端的核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,这种末端的
7、核苷酸顺序是互补的,可形成氢键,所以称为粘性末端。所以称为粘性末端。如如EcoRIEcoRI的识别顺序为:的识别顺序为: 5 5 GAA|TT_C GAA|TT_C 33 3 3 C_TT|AAG C_TT|AAG 5 5垂直线表示中心对称轴,从两侧垂直线表示中心对称轴,从两侧“读读”核苷酸顺序都是核苷酸顺序都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG,这就是回文顺序(,这就是回文顺序(palindromepalindrome)。)。_ _和和表示在双链上交错切割的位置,切割后生成表示在双链上交错切割的位置,切割后生成55G G和和AATTCAATTC33、33CTTAACTTAA
8、和和G G55二个二个DNADNA片段,各片段,各有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯有一个单链末端,二条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过键以及氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链,产生平头末端。例如上切割双链,产生平头末端。例如EcoRV EcoRV 的识别位置是:的识别位置是: 55 GAT|ATC GAT|ATC 3 333 CTA|TAG CTA|TAG 5 5 切割后形成切割后形成55 GAT GAT和和ATC ATC 3 3、 33 CTA CT
9、A和和TAG TAG 5 5。这种末端。这种末端同样可以通过同样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端:平头末端:第三类(第三类( IIIIII型)限制性内切酶型)限制性内切酶也有专一也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序的识别顺序,但不是对称的回文顺序, ,在识在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的一因此,这种限制性内切酶切割后产生的一定长度定长度DNADNA片段,具有各种单链末端。因此片段,具有各种单链末端。因此不能应用
10、于基因克隆。不能应用于基因克隆。同裂酶:同裂酶:有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同,其差别只在于当序和切割位置都相同,其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时,一种识别顺序中有甲基化的核苷酸时,一种限制性内切酶可以切割,另一种则不能。限制性内切酶可以切割,另一种则不能。例如例如HpaHpa和和MspMsp的识别顺序都是的识别顺序都是55GCG_GGCG_G33,如果其中有,如果其中有5-5-甲基胞嘧啶,则只有甲基胞嘧啶,则只有HpaHpa能够切能够切割。这些有相同切点的酶称为割。这些有相同切点的酶称为同裂酶同裂酶(同切酶或异源同工酶)(同切
11、酶或异源同工酶)。 3) 同裂酶和同尾酶:同裂酶和同尾酶:有时两种酶切割序列不完全相同,但却能有时两种酶切割序列不完全相同,但却能产生相同的粘性末端,这类酶被称为产生相同的粘性末端,这类酶被称为同尾同尾酶酶,可以通过,可以通过DNADNA连接酶将这类末端连接连接酶将这类末端连接起来,但原来的酶切位点将被破坏,有时起来,但原来的酶切位点将被破坏,有时可能会产生一个新的酶切位点。如可能会产生一个新的酶切位点。如Xba1Xba1、Nhe1Nhe1、Spe1Spe1以及以及StylStyl切割的切割的DNADNA序列不同,序列不同,但均给出相同的但均给出相同的“CTAG”CTAG”粘性末端。这些粘性末
12、端。这些粘性末端连接后,以上的酶将不能再切割,粘性末端连接后,以上的酶将不能再切割,但却产生了一个新的但却产生了一个新的4 4核苷酸的酶切位点,核苷酸的酶切位点,即即 Bfa1Bfa1的酶切位点。的酶切位点。同尾酶:同尾酶:4) 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法v 用属名的头一个字母和种名的头两个字母用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称,如表示寄主菌的物种名称,如E. coli 用用Eco表表示,所以用斜体字。示,所以用斜体字。v 用一个字母代表菌株或型,如流感嗜血菌用一个字母代表菌株或型,如流感嗜血菌Rd菌株用菌株用d,即,即Hind。v 如果一种特殊的寄
13、主菌株,具有几个不同如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同的限制与修饰体,则以罗马数字表示,如的限制与修饰体,则以罗马数字表示,如Hind, Hind,Hind等。等。5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA的纯度;的纯度;(2) DNA的甲基化程度;的甲基化程度;(3) 酶切消化反应的温度;酶切消化反应的温度;(4) DNA的分子结构;的分子结构;(5) 溶液中离子浓度及种类;溶液中离子浓度及种类;(6) 缓冲液的缓冲液的 pH值。值。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔
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