酶的生产与分离纯化课件.ppt

1、第第2章章 酶的生产与分离纯化酶的生产与分离纯化主要内容：主要内容： 2.1 酶的发酵生产酶的发酵生产* 2.2 提高酶发酵产量的方法提高酶发酵产量的方法 2.3 食品用酶发酵生产举例食品用酶发酵生产举例 2.4 酶分离纯化工作的基本原则酶分离纯化工作的基本原则 2.5 酶的纯化酶的纯化* 2.6 酶纯度的评价酶纯度的评价 2.7 酶的剂型与保存酶的剂型与保存12.1 酶的发酵生产酶的发酵生产 目前，酶的生产主要通过三种方法：目前，酶的生产主要通过三种方法：组织提取组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶发酵生产发酵生产：最大量的来源：最大量的来源化学及生物合成化学及生物合成：

2、生物重组：生物重组其中，酶的发酵生产生目前生产酶的主要方法。其中，酶的发酵生产生目前生产酶的主要方法。2 酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工酶的发酵生产：经过预先设计，通过人工操作控制，利用细胞（包括操作控制，利用细胞（包括微生物细胞微生物细胞、植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生植物细胞和动物细胞）的生命活动，产生人们所需要酶的过程，称为酶的发酵生产。人们所需要酶的过程，称为酶的发酵生产。3 能用于酶发酵生产的细胞需能用于酶发酵生产的细胞需具备如下几个具备如下几个条件条件： （1）产酶量高）产酶量高 （2）容易培养和管理）容易培养和管理 （3）产酶稳定性好）产酶稳定性好 （4）利于酶的分离

3、纯化）利于酶的分离纯化 （5）安全可靠）安全可靠42.1 酶的发酵技术酶的发酵技术 利用微生物产酶的优点是：利用微生物产酶的优点是：(1) 微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。(2) 微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。(3) 微生物培养基来源广泛、价格便宜。微生物培养基来源广泛、价格便宜。(4) 可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。可连续化、自动化，经济效益高。(5) 可以利用以基因工程为主的现代

4、分子生物学技术，选育可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。52.1.1 产酶微生物产酶微生物 菌种菌种是发酵生产酶的重要条件。菌种不仅与产酶种类、是发酵生产酶的重要条件。菌种不仅与产酶种类、产量密切相关，而且与发酵条件、工艺等关系密切。已产量密切相关，而且与发酵条件、工艺等关系密切。已经在自然界中发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生经在自然界中发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有产的酶约有5060种。它们的生

5、产菌种十分广泛，包括种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。6 （1）枯草芽孢杆菌）枯草芽孢杆菌 细菌属细菌属 革兰氏阳性革兰氏阳性 菌落粗糙，不透明菌落粗糙，不透明 此菌用途广，可用于生产此菌用途广，可用于生产-淀粉酶、蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶，碱性磷酸酶等。葡聚糖酶，碱性磷酸酶等。7 革兰氏染色是微生物中重要的染色方法革兰氏染色是微生物中重要的染色方法 1、初染：结晶紫染色、初染：结晶紫染色 2、媒染：碘液媒染、媒染：碘液媒染 3、脱色：乙醇脱色、脱色：乙醇脱色 4、复染：番红复染、复染：番红复染8细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它

6、们细胞壁的成分和结构不同而造成的。细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫结晶紫碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性革兰氏阳性菌菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫时细

7、胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫碘的碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰革兰氏阴性菌氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。9 （2） 大肠杆

8、菌大肠杆菌 革兰氏阴性，无芽孢革兰氏阴性，无芽孢 菌落光滑菌落光滑 用于谷氨酸脱羧酶，天用于谷氨酸脱羧酶，天门冬氨酸酶等门冬氨酸酶等胞内酶胞内酶10 （3）黑曲霉）黑曲霉 属于真菌属，菌丝体属于真菌属，菌丝体由横隔的分枝菌丝构由横隔的分枝菌丝构成，菌丛呈黑褐色成，菌丛呈黑褐色 糖化酶、淀粉酶、酸糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶等。性蛋白酶、果胶酶等。11 （4） 米曲霉米曲霉 真菌属，菌丛一般由真菌属，菌丛一般由黄绿色变为黄褐色。黄绿色变为黄褐色。产分生孢子产分生孢子 主要用于糖化酶和蛋主要用于糖化酶和蛋白酶的生产白酶的生产12 （5）根霉）根霉 由营养菌丝产生匍匐由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐

9、枝的末端产枝，匍匐枝的末端产生假根，并生长出成生假根，并生长出成群孢子囊梗。群孢子囊梗。 主要用于糖化酶、淀主要用于糖化酶、淀粉酶、转化酶等生产粉酶、转化酶等生产13 （6）毛霉）毛霉 菌丝体上生出孢子囊菌丝体上生出孢子囊梗，孢子囊梗顶端有梗，孢子囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊。膨大成球形的孢子囊。 主要用于生产蛋白酶、主要用于生产蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、脂糖化酶、淀粉酶、脂肪酶等。肪酶等。14 （7）链霉菌）链霉菌 放线菌放线菌 气生菌丝和基内菌气生菌丝和基内菌丝丝 葡萄糖异构酶。青葡萄糖异构酶。青霉素酰化酶、纤维霉素酰化酶、纤维素酶、几丁质酶等素酶、几丁质酶等15 （8）啤酒酵母）啤酒酵母

10、细胞呈圆形，卵形、细胞呈圆形，卵形、椭圆形到腊肠形。菌椭圆形到腊肠形。菌落呈白色，有光泽、落呈白色，有光泽、平滑。平滑。 用于生产转化酶、丙用于生产转化酶、丙酮酸脱羧酶等。酮酸脱羧酶等。16 2.1.1.2 产酶菌株的选育产酶菌株的选育 特定酶产生菌的筛选方法主要依据特定酶产生菌的筛选方法主要依据酶催化的反应性质酶催化的反应性质、作作用底物的特异性用底物的特异性、底物和产物的特性底物和产物的特性以及以及酶在细胞中所处酶在细胞中所处的位置的位置来进行选育。来进行选育。 对于对于胞外酶胞外酶，可在培养基中加入酶作用的不溶性底物或酶，可在培养基中加入酶作用的不溶性底物或酶催化反应的产物，根据菌落周围

11、的催化反应的产物，根据菌落周围的透明圈、颜色变化来筛透明圈、颜色变化来筛选选。 对于对于胞内酶胞内酶，若酶作用底物分子量小可透过细胞膜，将酶，若酶作用底物分子量小可透过细胞膜，将酶催化反应的产物作为底物，加在培养基中，根据催化反应的产物作为底物，加在培养基中，根据菌落颜色菌落颜色变化来筛选变化来筛选。而多数胞内酶产生菌的筛选则通过细胞破碎。而多数胞内酶产生菌的筛选则通过细胞破碎物做酶源，经酶反应后，根据物做酶源，经酶反应后，根据酶反应产物的特点来筛选酶反应产物的特点来筛选（辅酶（辅酶NAD）。17 酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的。因酶的发酵生产是以获得大量所需的酶为目的。因此，除了此，

12、除了选择性能优良的产酶微生物选择性能优良的产酶微生物，还应对酶，还应对酶的发酵加以控制。酶的发酵技术内容包括的发酵加以控制。酶的发酵技术内容包括培养基培养基设计设计、选择合适的发酵方式选择合适的发酵方式及及发酵过程的各种参发酵过程的各种参数控制数控制等。酶的发酵的生产一般工艺如图所示：等。酶的发酵的生产一般工艺如图所示：2.1.2 酶的发酵技术酶的发酵技术重要18保藏细胞保藏细胞细胞活化细胞活化细胞扩大培养细胞扩大培养原生质体原生质体固定化细胞固定化细胞固定化原生质体固定化原生质体预培养预培养发酵发酵发酵发酵分离纯化分离纯化酶酶重要19 2.1.2.1 培养基培养基培养基的营养成分是微生物发酵

13、产酶的原料，培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。和产酶促进剂等。重要20 氨基酸结构通式氨基酸结构通式CCOOHHRNH221（1）碳源）碳源碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌体生命活动的能量的主要来源。活动的能量的主要来源。当前酶制剂生产上使用当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用的菌种大都是只能利用有机碳有机碳的异养型微生物。的异养型微生物。重要吃点啥？吃点啥？2

14、2重要有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯皮、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品中中1216碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。23不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。另

15、外，选择碳源除考求而选择合适的碳源。另外，选择碳源除考虑虑营养要求营养要求外，还要考虑酶生物合成的外，还要考虑酶生物合成的诱导诱导作用作用和是否存在和是否存在分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用。尽量。尽量选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。有分解代谢物阻遏作用的碳源。例如，例如，淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。遏作用的果糖作为碳源。重要24 （2）氮源）氮源氮是生物体内各种含氮

16、物质，如氨基酸、蛋白质、氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂生产中的氮核苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂生产中的氮源主要有源主要有有机氮源和无机氮有机氮源和无机氮源源两种，常用的有机两种，常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿、尿素等。素等。重要25不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求

17、进行选择和配制。一般来说，动物细胞要求有机氮；植物细胞选择和配制。一般来说，动物细胞要求有机氮；植物细胞主要要求无机氮；主要要求无机氮；微生物细胞中，异养型微生物用有机氮，微生物细胞中，异养型微生物用有机氮，自养型用无机氮。自养型用无机氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的效果。使用才能取得较好的效果。重要我有我要求我有我要求26例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或硝酸盐例如黑曲霉酸性蛋白酶生产，只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为有胨时的为氮源时，酶产量仅为有胨时的30%。只用有机。只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般除使用氮源而不

18、用无机氮源时产量也低，故一般除使用高浓度有机氮源外尚需添加高浓度有机氮源外尚需添加1%3%的无机氮源。的无机氮源。重要27 （3） 无机盐无机盐微生物酶生产和其他微生物产品生产一样，培养基中微生物酶生产和其他微生物产品生产一样，培养基中需要有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在。需要有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在。提提供细胞生命活动，调节培养基的供细胞生命活动，调节培养基的pH、氧化还原电位和、氧化还原电位和渗透压。渗透压。在酶生产中常以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐作在酶生产中常以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐作为为磷源磷源，以硫酸镁为硫源和，以硫酸镁为硫源和镁源镁源。钙离子钙离子对

19、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的活性有对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的活性有十分重要的稳定作用，例如在无十分重要的稳定作用，例如在无Ca2+存在时灰色链霉存在时灰色链霉菌中性蛋白酶只在菌中性蛋白酶只在pH77.5很小范围内稳定，当有很小范围内稳定，当有Ca2+存在时稳定存在时稳定pH范围可以扩大到范围可以扩大到57。重要28钠离子钠离子有控制细胞渗透压使酶产量增加的作用，酶生有控制细胞渗透压使酶产量增加的作用，酶生产的培养基中有时以磷酸氢二钠及硝酸钠等形式加入，产的培养基中有时以磷酸氢二钠及硝酸钠等形式加入，例如米曲霉例如米曲霉淀粉酶生产，添加适量的硝酸钠以促进淀粉酶生产，添加适量的硝酸钠以

20、促进酶生产。酶生产。在天然培养基中，一般微量元素不必另外加入，但也在天然培养基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉为碳源时，添加有一些例外。如玉米粉、豆粉为碳源时，添加100 ppm Co2+和和Zn2+，放线菌，放线菌166蛋白酶活力可增加蛋白酶活力可增加70%80%。微量元素如过量会引起不良效果。微量元素如过量会引起不良效果。重要29 （4）生长因子）生长因子 微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才能正微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才能正常生长发育，这类物质统称生长因子常生长发育，这类物质统称生长因子(或生长素或生长素)。其中包括某些氨基酸、维生素、嘌

21、呤或嘧啶等。酶制其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等。酶制剂生产中所需的生长因子，大多是由天然原料提供，剂生产中所需的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。玉米浆中一般含有生长素玉米浆中一般含有生长素32128mg / mL。重要有你才有你才健康！健康！30 （5） 产酶促进剂产酶促进剂 产酶促进剂产酶促进剂是指在培养基中添加某种少量物质，能显是指在培养基中添加某种少量物质，能显著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。著提高酶的产率，这类物质称为产酶促进剂。产酶促进剂大体上分为两种：产酶促进剂大体上分

22、为两种：一是诱导物，二是表面一是诱导物，二是表面活性剂。活性剂。表面活性剂，如吐温表面活性剂，如吐温80的浓度为的浓度为0.1 %时能时能增加许多酶的产量。表面活性剂能增加细胞的通透性，增加许多酶的产量。表面活性剂能增加细胞的通透性，处在气液界面改善了氧的传递速度，还可以保护酶处在气液界面改善了氧的传递速度，还可以保护酶的活性。的活性。重要31 2.1.2.2 细胞活化与扩大培养细胞活化与扩大培养 细胞活化细胞活化是指保藏细胞在使用之前必须接种于新是指保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，以恢复细胞的生命活动能力。以恢

23、复细胞的生命活动能力。 为了保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化了为了保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化了的细胞一般要经过一级至数级的扩大培养。的细胞一般要经过一级至数级的扩大培养。32 2.1.2.3 发酵方式的选择发酵方式的选择 酶的种类繁多，产酶菌种各异，但其发酵酶的种类繁多，产酶菌种各异，但其发酵生产的工艺流程是相似的，一般有生产的工艺流程是相似的，一般有固态发固态发酵法酵法和和液体深层发酵法液体深层发酵法之分，具体采用何之分，具体采用何种方法由微生物和酶的种类来决定。种方法由微生物和酶的种类来决定。33 2.1.2.4 发酵条件的控制发酵条件的控制 酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌

24、种产酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶性能的影响外，还受到发酵温度、酶性能的影响外，还受到发酵温度、pH、溶氧量等条件的影响。溶氧量等条件的影响。34 (1) pH对产酶的影响对产酶的影响种子培养基和发酵培养基的种子培养基和发酵培养基的pH直接影响酶的产量和质直接影响酶的产量和质量。在发酵过程中，微生物不断分解和同化营养物质，量。在发酵过程中，微生物不断分解和同化营养物质，同时排出代谢产物。由于这些产物都与同时排出代谢产物。由于这些产物都与pH有直接关系，有直接关系，因此发酵液因此发酵液pH在不断发生变化。生产上根据在不断发生变化。生产上根据pH的变化的变化情况常作为生产控制的根据。情况常

25、作为生产控制的根据。35一般来说，培养基成分中碳一般来说，培养基成分中碳/氮氮(C/N)比高，发酵液倾向比高，发酵液倾向于酸性，于酸性，pH低；低；C/N低，发酵液倾向于碱性，低，发酵液倾向于碱性，pH高。高。pH的这些变化情况，常常引起细胞生长和产酶环境的的这些变化情况，常常引起细胞生长和产酶环境的变化，对产酶带来不利的影响。因此生产中常采用一变化，对产酶带来不利的影响。因此生产中常采用一些控制些控制pH的方法，通常有：添加缓冲液维持一定的的方法，通常有：添加缓冲液维持一定的pH；调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围；调节通风量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围；调节培养基的初始调节

26、培养基的初始pH，保持一定的，保持一定的C / N比；当发酵液比；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节，过高时用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过氮调节。过低时，通过氮调节。36 (2) 温度对产酶的影响温度对产酶的影响 发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅发酵温度的变化主要随着微生物代谢反应、发酵中通风、搅拌速度的变化而变化的。微生物在生长发育中，不断地吸收拌速度的变化而变化的。微生物在生长发育中，不断地吸收培养基营养成分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都培养基营养成分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都是吸热反应；培养基中的营养物质被大量分解时的生化反应是吸热反应；培养基

27、中的营养物质被大量分解时的生化反应都是放热反应。都是放热反应。发酵初期发酵初期合成反应吸收的热量大于分解反应合成反应吸收的热量大于分解反应放出的热量，放出的热量，发酵液需要升温发酵液需要升温。当。当菌体繁殖旺盛菌体繁殖旺盛时，情况则时，情况则相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量，相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量，这时，这时，发酵液必须降温发酵液必须降温，以保持微生物生长繁殖和产酶所需，以保持微生物生长繁殖和产酶所需的适宜温度。的适宜温度。37微生物生长繁殖和产酶的最适温度随着菌种和酶的性微生物生长繁殖和产酶的最适温度随着菌种和酶的性质不同而异，生长繁殖和产酶

28、的最适温度往往不一致。质不同而异，生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。一般细菌为一般细菌为37 ，霉菌和放线菌为，霉菌和放线菌为2830 ，一些，一些嗜热微生物需在嗜热微生物需在4050 下生长繁殖，如红曲霉生长下生长繁殖，如红曲霉生长温度温度3537，而生产糖化酶的最适温度为，而生产糖化酶的最适温度为3740 。38在酶生产中，为了有利于菌体生长和酶的合成，也有在酶生产中，为了有利于菌体生长和酶的合成，也有进行变温生产的。例如以枯草杆菌进行变温生产的。例如以枯草杆菌ASl.398进行中性蛋进行中性蛋白酶生产时，培养温度必须从白酶生产时，培养温度必须从31 逐渐升温至逐渐升温至40 ，然后再降

29、温到然后再降温到31进行培养，蛋白酶产量比不升温者进行培养，蛋白酶产量比不升温者高高66%。据报道，酶生产的温度对酶活力的稳定性有。据报道，酶生产的温度对酶活力的稳定性有影响，例如用嗜热芽孢杆菌进行影响，例如用嗜热芽孢杆菌进行淀粉酶生产时，在淀粉酶生产时，在55 培养所产生的酶的稳定性比培养所产生的酶的稳定性比35 好。好。39 (3)耗氧量和通风量对产酶的影响耗氧量和通风量对产酶的影响其实通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。一其实通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。一般来说，在发酵初期，虽然幼细胞呼吸强度大，耗氧般来说，在发酵初期，虽然幼细胞呼吸强度大，耗氧多，但由于菌体少，相对通风

30、量可以少些；菌体生长多，但由于菌体少，相对通风量可以少些；菌体生长繁殖旺盛期时，耗氧多，要求通风量大些；产酶旺盛繁殖旺盛期时，耗氧多，要求通风量大些；产酶旺盛时的通风量因菌种和酶种而异，一般需要强烈通风；时的通风量因菌种和酶种而异，一般需要强烈通风；但也有例外，通风量过多反而抑制酶的生成。因此，但也有例外，通风量过多反而抑制酶的生成。因此，菌种、酶种、培养时期、培养基和设备性能都能影响菌种、酶种、培养时期、培养基和设备性能都能影响通风量，从而影响酶的产量。目前用于酶制剂生产的通风量，从而影响酶的产量。目前用于酶制剂生产的微生物都为好气性微生物，生产上普遍采用自动测定微生物都为好气性微生物，生产

31、上普遍采用自动测定和记录溶解氧的仪表。和记录溶解氧的仪表。40 (4) 搅拌的影响搅拌的影响对于好气性微生物的深层发酵，除了需要通气外，还对于好气性微生物的深层发酵，除了需要通气外，还需要搅拌。搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀需要搅拌。搅拌有利于热交换、营养物质与菌体均匀接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代接触，降低细胞周围的代谢产物，从而有利于新陈代谢。同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加谢。同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气利用。但搅拌湍流速度，从而提高溶氧量，增加空气利用。但搅拌速度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生剪切力，易速

32、度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生剪切力，易使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，易使发酵使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，易使发酵液温度发生变化。搅拌速度还与发酵液黏度有关。液温度发生变化。搅拌速度还与发酵液黏度有关。41 (5) 泡沫的影响泡沫的影响发酵中往往产生较多的泡沫。泡沫的存在阻碍发酵中往往产生较多的泡沫。泡沫的存在阻碍了了CO2的排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影的排除，影响溶氧量，同时泡沫过多影响补料，也易使发酵液溢出罐外造成跑料。因响补料，也易使发酵液溢出罐外造成跑料。因此，生产上必须采用消泡措施。一般除了机械此，生产上必须采用消泡措施。一般除了机械消泡外，还可利用消泡剂。

33、消泡外，还可利用消泡剂。422.2 提高酶发酵产量的方法提高酶发酵产量的方法 为了获得大量所需的酶，在实际生产中，为了获得大量所需的酶，在实际生产中，通常采用代谢调控、控制发酵条件、基因通常采用代谢调控、控制发酵条件、基因改变等方法来提高酶的产量。改变等方法来提高酶的产量。43 2.2.1 酶合成调控机制酶合成调控机制 2.2.1.1 诱导酶合成调控诱导酶合成调控 20世纪世纪60年代初雅各布和莫诺等人从分子水平上年代初雅各布和莫诺等人从分子水平上解释了诱导酶合成调节系统。研究了突变对三个解释了诱导酶合成调节系统。研究了突变对三个基因的影响，这三个基因控制分解乳糖所必需的基因的影响，这三个基因

34、控制分解乳糖所必需的三种酶的合成，并依次排列呈乳糖基因区（即乳三种酶的合成，并依次排列呈乳糖基因区（即乳糖操纵子学说）要点如下：糖操纵子学说）要点如下：44乳糖操纵子结构 1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列列O，一个启动子，一个启动子P和一个调节基因和一个调节基因R。45 2、阻遏蛋白的负性调节：、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖没有乳糖存在时，存在时，I基因编码的基因编码的阻遏蛋白结

35、合于操纵序列阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖有乳糖存在时，乳糖作为诱存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为的这种调控机制为可诱导的负调控。可诱导的负调控。诱导机制诱导机制结构基因结构基因S调节基因调节基因R46 乳糖操纵子学说对酶合成的指导意义乳糖操纵子学说对酶合成的指导意义 1、采用现代诱变育种

36、技术是细胞中的调节、采用现代诱变育种技术是细胞中的调节基因发生突变，致使调节基因不能转录翻基因发生突变，致使调节基因不能转录翻译产生阻遏蛋白，诱导酶变成组成酶。译产生阻遏蛋白，诱导酶变成组成酶。 2、在诱导酶合成时加入诱导物以利于诱导、在诱导酶合成时加入诱导物以利于诱导酶的合成。酶的合成。47 2.2.1.2 酶合成的反馈阻遏酶合成的反馈阻遏 反馈阻遏反馈阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产生阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产生阻遏作用，引起反馈阻遏的终产物往往是小分子物质，作用，引起反馈阻遏的终产物往往是小分子物质，又称为产物阻遏。又称为产物阻遏。 P14图图2-348 反馈阻遏对食品酶生产时的指

37、导意义反馈阻遏对食品酶生产时的指导意义 1、设法从培养基中除去其终产物，以消除、设法从培养基中除去其终产物，以消除反馈抑制。反馈抑制。 2、向培养基中加入代谢途径的某个抑制因、向培养基中加入代谢途径的某个抑制因子切断代谢途径通路，也可限制细胞内末子切断代谢途径通路，也可限制细胞内末端产物的积累，可达到缓解其反馈阻遏的端产物的积累，可达到缓解其反馈阻遏的目的。目的。49 2.2.1.3 分解代谢对酶合成的阻遏作用分解代谢对酶合成的阻遏作用 分解代谢阻遏分解代谢阻遏作用（又称葡萄糖效应）是作用（又称葡萄糖效应）是指其在培养基中由于葡萄糖的存在微生物指其在培养基中由于葡萄糖的存在微生物虽能迅速生长，

38、但明显地抑制某些分解代虽能迅速生长，但明显地抑制某些分解代谢诱导酶的形成。谢诱导酶的形成。50细菌乳糖操纵子的作用机制细菌乳糖操纵子的作用机制( (降解物阻遏降解物阻遏) )调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因lacZ lacYlacACAPcAMPCAP-cAMPCAP-cAMP复合物复合物mRNAmRNA当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，当葡萄糖作唯一碳源时，葡萄糖的降解物对腺苷酸环化酶有抑制作用，则则cAMPcAMP的浓度降低，的浓度降低， CAP-cAMPCAP-cAMP复合物减少，不能与启动子结合，故复合物减少，不能与启动子结合，故转录不得进行。转

39、录不得进行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶过去称葡萄糖效应过去称葡萄糖效应51 2.2.1.4 酶合成的细胞膜透性调节酶合成的细胞膜透性调节 细胞膜透性调节主要有以下几种：细胞膜透性调节主要有以下几种： 1、调节胞外酶的分泌、调节胞外酶的分泌 2、主动运输的调节、主动运输的调节 3、间隔作用的调节、间隔作用的调节52 2.2.2 通过发酵条件控制提高酶产量通过发酵条件控制提高酶产量关于发酵过程中参数控制见关于发酵过程中参数控制见2.1.2pH温度温度中间补料中间补料溶氧量溶氧量53 2.2.3 通过基因突变提高酶产量通过基因突变提高酶产量 2.2.3.1 自然选育自然选

40、育 自然选育自然选育是指不经人工处理，利用微生物的自然突变进行是指不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。菌种选育的过程称为自然选育。 自然突变主要有自然突变主要有两种原因两种原因 ： （1）自然环境中存在的低剂量宇宙射线、低浓度诱变物）自然环境中存在的低剂量宇宙射线、低浓度诱变物和微生物自身代谢产生的诱变物质的作用。和微生物自身代谢产生的诱变物质的作用。 （2）T和和G的六位酮基的烯醇式互变异构及的六位酮基的烯醇式互变异构及C和和A的六位的六位氨基亚氨式互变异构。氨基亚氨式互变异构。54 自然诱变的突变率低，概率为自然诱变的突变率低，概率为10-910-8。且可能导

41、致生产上不希望的结果发生，但且可能导致生产上不希望的结果发生，但是自然选育是一种简便易行的选育方法，是自然选育是一种简便易行的选育方法，可以达到纯化菌种、防止退化、稳定生产、可以达到纯化菌种、防止退化、稳定生产、提高生产水平的目的。因其效率低，常和提高生产水平的目的。因其效率低，常和诱变育种结合才能取得良好的效果。诱变育种结合才能取得良好的效果。55 2.2.2 诱变育种诱变育种 诱变育种诱变育种是人为利用物理化学等因素，使是人为利用物理化学等因素，使细胞内的遗传物质染色体或细胞内的遗传物质染色体或DNA的片段发的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或DNA

42、的某一碱基对发生改变，从而是微生的某一碱基对发生改变，从而是微生物的遗传物质物的遗传物质DNA和和RNA的化学结构发生的化学结构发生变化，引起微生物的遗传变异。变化，引起微生物的遗传变异。56 选择诱变育种出发菌株时应注意：选择诱变育种出发菌株时应注意： 1、诱变的出发菌株，具有一定的目标产物、诱变的出发菌株，具有一定的目标产物的生产能力的生产能力 2、对诱变剂敏感的菌株变异幅度较大、对诱变剂敏感的菌株变异幅度较大 3、生产性能好的菌株、生产性能好的菌株 4、可选择已经诱变后的菌株、可选择已经诱变后的菌株57 2.2.4 通过基因重组提高酶的产量通过基因重组提高酶的产量 基因工程操作主要包括：

43、基因工程操作主要包括： 1、目的基因的分离、目的基因的分离 2、载体分离、载体分离 3、限制性内切酶的应用、限制性内切酶的应用 4、基因重组、基因重组 5、细胞转化和基因表达、细胞转化和基因表达58 2.2.5 其他方法提高酶产量的方法其他方法提高酶产量的方法 1、添加诱导物、添加诱导物 : 这种方法只适应于诱导酶的合这种方法只适应于诱导酶的合成。其关键在于选择适宜的诱导物及其浓度。成。其关键在于选择适宜的诱导物及其浓度。 诱导物：诱导物： 一是酶的作用底物，但有些底物并不一定是诱导物；一是酶的作用底物，但有些底物并不一定是诱导物；二是一些难以代谢的底物类似物。二是一些难以代谢的底物类似物。三

44、是诱导物的前体物质。三是诱导物的前体物质。此外此外,对于参加分解代谢的胞外酶，它们的产物也往往行诱导对于参加分解代谢的胞外酶，它们的产物也往往行诱导作用，如纤维二糖诱导纤维素酶。作用，如纤维二糖诱导纤维素酶。592、控制阻遏物的浓度、控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。种。1.1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。的阻遏作用。2.2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的分解代谢物阻遏作

45、用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。 为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除使阻遏解除。 603、添加表面活性剂、添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过

46、性，有利表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。 将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（TweenTween）、特里顿）、特里顿(Triton)(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。量增加。 由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如活性剂（如新洁而灭新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能等）是消毒剂，对细胞的毒性

47、较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。在酶的发酵生产中添加到培养基中。 614 4、添加产酶促进剂、添加产酶促进剂 产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高酸二酯酶的产量提高1 12020倍；添加聚乙烯醇（倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcoholPolyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞

48、、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。促进剂的种类和浓度。 622.3 食品用酶发酵生产实例食品用酶发酵生产实例 1、-淀粉酶的生产淀粉酶的生产 生产菌种：主要来自细菌和曲霉，如枯草生产菌种：主要来自细菌和曲霉，如枯草芽孢杆菌、黑曲霉等。芽孢杆菌、黑曲霉等。 发酵方法：霉菌，固体曲法；细菌，液体发酵方法：霉菌，固体曲法；细菌，液体深层发酵。深层发酵。 回收方法：盐析、有机溶剂沉淀和淀粉吸回收方法：盐析、有机溶剂沉淀和淀粉吸附等。附等。63 2、果胶酶的生产、果胶酶的生产 生产菌种：

49、主要来自真菌，如曲霉菌、青生产菌种：主要来自真菌，如曲霉菌、青霉菌等，细菌主要有枯草芽孢杆菌、欧氏霉菌等，细菌主要有枯草芽孢杆菌、欧氏杆菌等。杆菌等。 发酵方法：固体曲法和液体深层发酵，依发酵方法：固体曲法和液体深层发酵，依据微生物特性。据微生物特性。 回收方法：一般用水提后加入乙醇沉淀。回收方法：一般用水提后加入乙醇沉淀。642.4 酶分离纯化的基本原则酶分离纯化的基本原则 酶的分离纯化工作，是酶学研究的酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础基础。酶的纯。酶的纯化过程，就目前而言，还是一门实验科学。一个化过程，就目前而言，还是一门实验科学。一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸特定酶的提

50、纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，没有通用的规律可循。酶的纯化过程与一般索，没有通用的规律可循。酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点： 一是特定的一种酶在细胞中的含量很少；一是特定的一种酶在细胞中的含量很少； 二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪； 前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。化过程的关键所在。65 2.4.1 酶活力的测定酶活力的测定 基本概念基本概念 酶活力酶活力(Enzyme activity)：