退火温度对PCR反应的影响课件.ppt

1、一、一、PCR PCR 的概念的概念 二、二、PCR PCR 的基本原理的基本原理三、三、PCR PCR 的基本流程的基本流程四、四、PCRPCR反应体系的各成分及其对反应体系的各成分及其对PCRPCR的影响的影响讲解内容讲解内容 (2)(2)五、五、PCRPCR反应条件的确定反应条件的确定六、常见问题与对策六、常见问题与对策变性变性退火退火延伸延伸循环次数循环次数主要包括：主要包括： Half life of Taq DNA polymerase一般选用一般选用94949595 。92.5 2 hours， 95 40 mins， 97 5 mins. 30 个循环时，个循环时，变性温度：变

2、性温度：变性时间：变性时间：可根据模板长短、可根据模板长短、G+CG+C含量确定。含量确定。 一般采用一般采用30304545秒秒。五、五、PCRPCR反应条件的确定反应条件的确定变性共需要变性共需要 15 22.5 min。热启动热启动 : : 94（或（或95）, , 310min变性变性退火退火延伸延伸循环次数循环次数主要包括：主要包括：五、五、PCRPCR反应条件的确定反应条件的确定 退火是影响退火是影响 PCR 特异性的重要因素！特异性的重要因素！(2) Annealing temperature is too highPrimers and templates tends to b

3、e dissociated.(2) Annealing temperature is too lowMismatched hybrid.(1) Correct annealing temperaturePriming occures only at the desired target sites.(1)退火温度偏高，产物量减少，但反应特异性退火温度偏高，产物量减少，但反应特异性 ( (specificity) )高。高。(3) (2)五、五、PCRPCR反应条件的确定反应条件的确定变性变性退火退火延伸延伸循环数循环数主要包括：主要包括： 长度 20 mer 的引物， Tm 计算公式为：4(G

4、 + C)+ 2(A + T) 退火温度 = Tm （210） 退火温度：5065。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55 作为退火温度的起点较为理想。 较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。 但退火温度不能太高，要保证引物同目的序列有效退火。 通过参考引物的通过参考引物的 Tm 值，选择退火温度值，选择退火温度 Tm (melting temperature, 解链温度解链温度) : 当当 5050 的引物与互补序列表现为双链的引物与互补序列表现为双链DNADNA分子时的温度。分子时的温度。五、五、PCRPCR反应条件的确定反应条件的确定变性变

5、性退火退火延伸延伸循环次数循环次数主要包括：主要包括：Taq Taq 酶的最适工作温度：酶的最适工作温度：7272或或7474温度：温度： 取决于待扩增基因片段的长短取决于待扩增基因片段的长短 酶的延伸效率：酶的延伸效率： 约约 1kb/min1kb/min。1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min（足够）（足够） 3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4minn延伸时间过长会导致非特异性扩增延伸时间过长会导致非特异性扩增时间：时间：五、五、PCRPCR反应条件的确定反应条件的确定变性变性退火退火延伸延伸循环次数循环次数主要包括：主要包括：

6、决定了决定了 PCR PCR 扩增程度扩增程度 一般地，一般地， 30 cycles 30 cycles 循环次数过多会增加碱基的错配几率，非循环次数过多会增加碱基的错配几率，非特异性产物的量亦增多特异性产物的量亦增多。95, , 5 min94 45S，55 1min，72 2min。 30 个循环个循环 。72 延伸延伸10min。典型的典型的PCR条件：条件：六、常见问题与对策六、常见问题与对策无扩增产物无扩增产物假阳性假阳性非特异性扩增非特异性扩增拖尾拖尾主要包括：主要包括： 1) 1) 模板模板: : 提取的模板中含有杂质。如：蛋白质、氯仿、提取的模板中含有杂质。如：蛋白质、氯仿、

7、乙醇、乙醇、EDTAEDTA等抑制了等抑制了Taq 酶活性酶活性 模板的浓度可能不合适。模板的浓度可能不合适。2) 2) 引物：引物： 引物设计不合理：如，特异性长度不够，引物设计不合理：如，特异性长度不够，引物二聚体等。引物二聚体等。 选择一个好的引物合成公司。选择一个好的引物合成公司。 引物应高浓度小量分装冻存，防止多次冻引物应高浓度小量分装冻存，防止多次冻融导致引物发生降解。融导致引物发生降解。3) 3) 酶失活酶失活 反应体系方面的原因反应体系方面的原因无扩增产物无扩增产物假阳性假阳性非特异性扩增非特异性扩增拖尾拖尾1 1）变性）变性: : 不彻底；不彻底；2 2）退火）退火: : 温

8、度太高；温度太高；3 3）延伸）延伸: : 时间太短。时间太短。六、常见问题与对策六、常见问题与对策主要包括：主要包括：反应条件方面的原因反应条件方面的原因 无扩增产物无扩增产物假阳性假阳性非特异性扩增非特异性扩增拖尾拖尾六、常见问题与对策六、常见问题与对策主要包括：主要包括：PCR是一项非常敏感的技术，极微量是一项非常敏感的技术，极微量的靶序列的污染便可导致假阳性。的靶序列的污染便可导致假阳性。空白对照管（无模板）出现扩增产物空白对照管（无模板）出现扩增产物实验室中实验室中PCRPCR扩增产物、重组质粒的污染；扩增产物、重组质粒的污染；实验室中加样器、白衣、实验室中加样器、白衣、 PCRPC

9、R试剂的污染；试剂的污染；空气中灰尘的污染；空气中灰尘的污染； 标本间交叉污染标本间交叉污染 合理分隔实验室合理分隔实验室 隔离专用操作区；隔离专用操作区； 离心管、枪头等一次性使用离心管、枪头等一次性使用, ,不要碰到别处；不要碰到别处； 除酶等不能耐高温的物质外，所有试剂、器材均高压。除酶等不能耐高温的物质外，所有试剂、器材均高压。 各种试剂进行分装、低温贮存；各种试剂进行分装、低温贮存； 打开离心管前打开离心管前 应先离心，将管盖上的液体甩至管底部。应先离心，将管盖上的液体甩至管底部。 开管动作要轻，防止将开管动作要轻，防止将靶序列靶序列溅出离心管外。溅出离心管外。 防止将防止将靶序列靶

10、序列吸入加样器内，造成实验室污染；吸入加样器内，造成实验室污染； 设立设立阴性对照管阴性对照管： 该管该管PCRPCR反应时不加模板反应时不加模板DNADNA，以监测是否存在污染。，以监测是否存在污染。防止防止 PCR 污染的方法：污染的方法：无扩增产物无扩增产物假阳性假阳性非特异性扩增非特异性扩增拖尾拖尾六、常见问题与对策六、常见问题与对策主要包括：主要包括：现象现象：PCR产物的序列或长度与预期不一致；或除预期产物外，还出现其它条带。原因：原因： 退火温度偏低 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶或Mg2+浓度偏高 循环次数过多无扩增产物无扩增产物假阳性假阳性非特异性扩增非特异性扩增拖尾拖

11、尾六、常见问题与对策六、常见问题与对策主要包括：主要包括：现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈SmearSmear状态状态 M 1 2原因：原因： 退火温度偏低退火温度偏低 模板不纯或降解模板不纯或降解 酶或酶或dNTPdNTP浓度偏高浓度偏高 循环次数过多循环次数过多 PCR： 在体外，选择性地扩增目的在体外，选择性地扩增目的DNA片段的方法。片段的方法。影响因素有很多影响因素有很多： PCR反应体系各种成分反应体系各种成分的质和量直接影响的质和量直接影响PCR反应的质量反应的质量 PCR反应的条件反应的条件设置直接影响设置直接影响PCR反应的质量反应的质量 变性既要充分，又要考虑酶的活性变性既要充分，又要考虑酶的活性 退火温度：既要保证引物有效退火，又要保证特异性退火温度：既要保证引物有效退火，又要保证特异性讲解到此结束！讲解到此结束！ 希望大家：尽可能快地掌握分子生物希望大家：尽可能快地掌握分子生物学基本操作方面的、一些看似微不足道、学基本操作方面的、一些看似微不足道、但却是将来实验成功的秘诀的一些技巧。但却是将来实验成功的秘诀的一些技巧。 祝同学们实验顺畅！祝同学们实验顺畅！