普通显微镜课件.ppt(124页)
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- 普通 显微镜 课件
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1、12主要内容主要内容v一、显微镜的发展一、显微镜的发展v二、显微镜的应用二、显微镜的应用v三、显微镜的原理三、显微镜的原理v四、显微镜的结构四、显微镜的结构v五、显微镜的重要参数五、显微镜的重要参数v六、显微镜的镜头六、显微镜的镜头v七、显微镜的像差七、显微镜的像差34 v显微镜理论、制作和应用的发显微镜理论、制作和应用的发展展v从十五世纪开始逐渐发展起来的。从十五世纪开始逐渐发展起来的。5近代光学显微镜的发展历程v1590年,荷兰的詹森父子年,荷兰的詹森父子(Hans and zachrias Janssen) 制造出第一台原始的、放大倍数约为制造出第一台原始的、放大倍数约为20倍的显微镜倍
2、的显微镜v这个显微镜是用一个这个显微镜是用一个凹镜凹镜和一个凸镜做成的,制和一个凸镜做成的,制作水平还很低。作水平还很低。v发明的发明的偶然性偶然性v詹森父子俩的修养起了决定作用,他们抓住这个詹森父子俩的修养起了决定作用,他们抓住这个偶然的发现,认真思索,反复实践,用大大小小偶然的发现,认真思索,反复实践,用大大小小的凸玻璃片做各种距离不等的配合,终于发明了的凸玻璃片做各种距离不等的配合,终于发明了世界上第一台显微镜。世界上第一台显微镜。v并没有发现显微镜的真正价值。也许正是因为这并没有发现显微镜的真正价值。也许正是因为这个原因,詹森的发明并没有引起世人的重视。个原因,詹森的发明并没有引起世人
3、的重视。 6v16l0年,意大利物理学家年,意大利物理学家伽利略伽利略(Galileo)制造了具有物镜、目镜及镜筒制造了具有物镜、目镜及镜筒的望远镜的望远镜 7v1665年,英国物理学家年,英国物理学家罗伯特罗伯特胡克胡克(Robert Hooke)用复式显微镜观察软木用复式显微镜观察软木塞时发现了小的蜂房状结构,称为塞时发现了小的蜂房状结构,称为“细细胞胞”,由此引起了细胞研究的热潮。,由此引起了细胞研究的热潮。8(左)1665年 R. Hoock用来发现细胞的光学显微镜。(右)1848年的显微镜。9近代光学显微镜的发展历程v荷兰的显微镜学家、微生物荷兰的显微镜学家、微生物学的开拓者学的开拓
4、者列文虎克列文虎克(A.van Leeuwenhoek)首先制造成放首先制造成放大大275倍的显微镜倍的显微镜,并于,并于1673年,描述了哺乳动物年,描述了哺乳动物红血红血球球的观察情况,的观察情况,1677年,又发年,又发现了人以及狗和兔子的现了人以及狗和兔子的精子精子10Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723).Magnification ranges at 50-275x.11近代光学显微镜的发展历程v1684年,荷兰物理学家年,荷兰物理学家惠更斯惠更斯(Huygens)设计并制造出双透镜目镜设计并制造出双透镜目镜惠更斯目镜惠更斯目镜,是现代多种目镜的
5、原型。,是现代多种目镜的原型。这时的光学显微镜已初具现代显微镜的这时的光学显微镜已初具现代显微镜的基本结构基本结构惠更斯目镜有两片凸面朝向显惠更斯目镜有两片凸面朝向显微物镜的内焦点平凸透镜构成微物镜的内焦点平凸透镜构成,该结构不能消场曲该结构不能消场曲,由像散来由像散来平衡平衡,一般用于低倍显微镜一般用于低倍显微镜; 12v1752年,英国人年,英国人J. Dollond 发明消色差显微镜。发明消色差显微镜。v1812年,苏格兰人年,苏格兰人D. Brewster 发明油浸物镜,改发明油浸物镜,改进了体视显微镜。进了体视显微镜。1840年法国光学仪器商人查尔斯年法国光学仪器商人查尔斯塞福尔制造
6、的显微镜塞福尔制造的显微镜 Microscope made by Charles Chevalier 184013v在显微镜的发展史中,贡献最为卓著的是德国在显微镜的发展史中,贡献最为卓著的是德国的物理学家、数学家和光学大师的物理学家、数学家和光学大师恩斯特恩斯特阿贝阿贝(Ernst Abbe)。v他提出了显微镜的完善理论,阐明了成像原理、他提出了显微镜的完善理论,阐明了成像原理、数值孔径等问题,在数值孔径等问题,在1870年发表了有关放大理年发表了有关放大理论的重要文章。论的重要文章。v两年后又发明了油浸物镜,并在光学玻璃、两年后又发明了油浸物镜,并在光学玻璃、显微镜的设计和改进等方向取得了
7、光辉的业绩。显微镜的设计和改进等方向取得了光辉的业绩。14Bausch & Lomb Investigator microscope circa 1893 15v显微镜的发明显微镜的发明 v使人类更深刻地揭示了自然界的奥秘,推动了各使人类更深刻地揭示了自然界的奥秘,推动了各学科的发展,反过来由于科学的发展,又促进了学科的发展,反过来由于科学的发展,又促进了显微镜技术的改进,使之日趋完善。显微镜技术的改进,使之日趋完善。v显微镜设计与制造显微镜设计与制造v现代多为光、机、电的三结合体。现代多为光、机、电的三结合体。16现代显微镜现代显微镜17v1932年,荷兰籍德国人年,荷兰籍德国人F. Zer
8、nike成功设计了相差显成功设计了相差显微镜(微镜(phase contrast microscope),并因此获,并因此获1953年诺贝尔物理奖。年诺贝尔物理奖。现代光学显微镜的发展历程18v1932年,德国人年,德国人M.Knoll和和E.A.F.Ruska发明电镜,发明电镜,1940年,美、德制造出分辨力为年,美、德制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。的商品电镜。TEM19v1981年,瑞士人年,瑞士人G.Binnig和和H.RoherI在在IBM苏黎世实验中苏黎世实验中心(心(Zurich Research Center)发明了扫描隧道显微镜而)发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者与电镜
9、发明者Ruska同获同获1986年度的诺贝尔物理学奖。年度的诺贝尔物理学奖。Cs atoms (red) on the GaAs surface (blue).2021v显微镜的作用显微镜的作用v是一种处理波的工具,是处理可见光及近可见光波段的波,是一种处理波的工具,是处理可见光及近可见光波段的波,使之成束地照射在被检物体上。使之成束地照射在被检物体上。v其成象落在人眼的视网膜、感光片或其它记录系统其成象落在人眼的视网膜、感光片或其它记录系统( (如电视如电视显示或电影显示或电影) )上,突破了人类生理的限制。上,突破了人类生理的限制。v把视觉伸展到人眼不能分辨的微观世界中去。用来观察、记把视
10、觉伸展到人眼不能分辨的微观世界中去。用来观察、记录和研究经过制片技术处理后的被检物体的细微结构。录和研究经过制片技术处理后的被检物体的细微结构。v对微观世界的探索及理论上的研究起着极其重要的作用。对微观世界的探索及理论上的研究起着极其重要的作用。v广泛地应用于各学科的领域中。广泛地应用于各学科的领域中。22v光镜技术在生物学上的应用光镜技术在生物学上的应用vA 观察活细胞的形态结构,生命运动,观察活细胞的形态结构,生命运动,v 细胞周期。细胞周期。vB 细胞器的定位及功能研究。细胞器的定位及功能研究。vC 基因产物与大分子物质的定位及定量。基因产物与大分子物质的定位及定量。vD 监测细胞代谢活
11、动。监测细胞代谢活动。23v细胞的钙信号引起钙依赖水母发光蛋白发光细胞的钙信号引起钙依赖水母发光蛋白发光24v 罗丹明罗丹明123染色后显示的细胞线粒体的定位染色后显示的细胞线粒体的定位2526v光具有的物理性质光具有的物理性质v折射和折射率折射和折射率v光线在均匀的各向同性介质中,二点之间应以直线传播,当通过不光线在均匀的各向同性介质中,二点之间应以直线传播,当通过不同密度介质的透明物体时,则会发生折射现象,这是由于光在不同同密度介质的透明物体时,则会发生折射现象,这是由于光在不同介质中的传播速度不同所造成的。介质中的传播速度不同所造成的。 v不同介质的折射率不同介质的折射率v空气空气 1.
12、01.0v 水水 1.331.33v甘油甘油 1.4051.405v光线经过不同介质发生折射,造成像的放大缩小光线经过不同介质发生折射,造成像的放大缩小27v人眼的重要性人眼的重要性v人眼具有敏捷的性能,视觉传入大脑的信息约占各种人眼具有敏捷的性能,视觉传入大脑的信息约占各种信息的信息的8080,其高度的准确性、灵敏度、分辨力和适,其高度的准确性、灵敏度、分辨力和适应性等方面,至今在理论上尚未完全解释清楚。应性等方面,至今在理论上尚未完全解释清楚。v人眼的局限性人眼的局限性 v不能看清很远或太小的物体。不能看清很远或太小的物体。v对所观察到的物体的形状、大小和远近,不能作出精对所观察到的物体的
13、形状、大小和远近,不能作出精确的定量比较和计量。确的定量比较和计量。v对发生在瞬间的现象或事物不能留下长久的记录。对发生在瞬间的现象或事物不能留下长久的记录。v只能感受光谱中很窄的可见光(波长约为只能感受光谱中很窄的可见光(波长约为400-700400-700毫微毫微米)范围内的电磁波。米)范围内的电磁波。2829v光学显微镜的组成光学显微镜的组成v均由单个和多个透镜组成,即由物镜、目镜及聚光镜等部件。均由单个和多个透镜组成,即由物镜、目镜及聚光镜等部件。v透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学原件。透镜是组成显微镜光学系统的最基本的光学原件。v透镜依其外形的不同可分为两大类透镜依其外形的不同
14、可分为两大类v1 1、凸透镜(又称会聚透镜、正透镜)、凸透镜(又称会聚透镜、正透镜)v2 2、凹透镜(又称散发透镜、负透镜)、凹透镜(又称散发透镜、负透镜)3031v透镜成象透镜成象v凸透镜凸透镜在物方所成的象是光线真正的交点,称为在物方所成的象是光线真正的交点,称为“实象实象”。v实象实象在屏幕上能显现出来,而虚象则不能,但当我们用眼睛在屏幕上能显现出来,而虚象则不能,但当我们用眼睛对着透镜观察时,则完全能看到它。对着透镜观察时,则完全能看到它。v凹透镜所形成的象是与物体处在同一方,称为凹透镜所形成的象是与物体处在同一方,称为“虚象虚象”。v虚象虚象当一束平行于光轴的光线通过凹透镜后,形成散
15、射光,当一束平行于光轴的光线通过凹透镜后,形成散射光,在象方空间不能相交于一点,只有它们的延长线才能在物方空间在象方空间不能相交于一点,只有它们的延长线才能在物方空间相交于一点,这个点称相交于一点,这个点称“虚焦点虚焦点”,这个平面称,这个平面称“虚焦点平面虚焦点平面”。FOFFOF32v显微镜的成象原理显微镜的成象原理v当物体位于透镜物方二倍焦距以内,焦点以外时,则当物体位于透镜物方二倍焦距以内,焦点以外时,则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象;在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象;v当物体位于透镜物方焦点以内时,则像方也无象的形当物体位于透镜物方焦点以内时,则像方也无象的形成,而在透镜物
16、方的同侧比物体远的位置形成放大的成,而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。直立虚象。l放大倍数物镜倍数放大倍数物镜倍数* *目镜倍数目镜倍数333435v照明系统照明系统 包括光源、聚光器包括光源、聚光器v光学放大系统光学放大系统 由物镜和目镜组成由物镜和目镜组成v机械装置机械装置 用于固定材料和观察方便用于固定材料和观察方便36v照明系统照明系统 包括光源、聚光器包括光源、聚光器37物镜物镜: : 是决定显微镜的质量、是决定显微镜的质量、分辨力和放大倍数的最关键部分辨力和放大倍数的最关键部件件; ; 在物镜筒壁上常注有主要性能在物镜筒壁上常注有主要性能指标指标放大倍数、镜口率等
17、放大倍数、镜口率等; ;目镜目镜: : 是由上面的接目透镜和是由上面的接目透镜和下面的会聚透镜二部分组成的下面的会聚透镜二部分组成的, ,两者之间装有一个光阑两者之间装有一个光阑; ; 光学光学放大放大系统系统 : :38镜座镜座 是显微镜的基座是显微镜的基座, ,用以支持整个显微镜用以支持整个显微镜, ,其内常装有照明光源和反射镜其内常装有照明光源和反射镜; ; 镜臂镜臂 是显微镜的主要支架是显微镜的主要支架, ,用以支持镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等用以支持镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等; ; 载物台载物台 又称镜台又称镜台, ,中央有一个通光孔中央有一个通光孔, ,确保光线与台面垂直
18、通过。确保光线与台面垂直通过。 镜筒镜筒 位于镜臂的上部位于镜臂的上部, ,其上端放置目镜其上端放置目镜, ,下端连接物镜转换器下端连接物镜转换器; ; 调焦装置调焦装置 包括较大的粗准焦螺旋和较小的细准焦螺旋包括较大的粗准焦螺旋和较小的细准焦螺旋; ; 物镜转换器等物镜转换器等机械装置:用于固定材料和观察方便机械装置:用于固定材料和观察方便, ,包括包括: :39404142显微镜的重要参数v分辨率v放大率和有效放大率v数值孔径v焦深v视场宽度v复盖差v工作距离v图像亮度v视场亮度v合理使用参数合理使用参数v各项参数并不都是越高越各项参数并不都是越高越好,在使用时,应根据镜检好,在使用时,应
19、根据镜检的目的和实际情况来协调各的目的和实际情况来协调各参数之间的关系,以保证分参数之间的关系,以保证分辨率为准。辨率为准。 43v分辨率(分辨率(ResolutionResolution)v又称又称“鉴别率鉴别率”、“解象力解象力”和和“分辨本领分辨本领”. .是指将邻近两点清晰区分辨认的是指将邻近两点清晰区分辨认的能力。能力。v是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。v分辨本领:分辨本领:v德国著名理论光学家德国著名理论光学家AbbeAbbe早在早在100100多年前就给出分辨本领:多年前就给出分辨本领:vR=0.61/nSinR=0.61/nSin,n
20、 n为物体所处媒介的折射率;为物体所处媒介的折射率;为孔径角;为孔径角;为发为发射光波长。射光波长。44衍射的形成v物理光学把光视为一种电磁波,具有波粒二物理光学把光视为一种电磁波,具有波粒二象性,即波动性和粒子性。由于光具有波动象性,即波动性和粒子性。由于光具有波动性质,使得光波相互之间发生干涉作用,产性质,使得光波相互之间发生干涉作用,产生衍射现象。生衍射现象。45狭缝实验狭缝实验v屏幕上的屏幕上的P1点到狭峰上边缘的距离点到狭峰上边缘的距离和它到狭峰下边缘的距离之差为一个和它到狭峰下边缘的距离之差为一个波长。波长。v从狭峰上缘和从狭峰下缘发出的两列从狭峰上缘和从狭峰下缘发出的两列光波在光
21、波在P1点相互影响。点相互影响。v整个狭峰内发出的光波的累计相干效整个狭峰内发出的光波的累计相干效果,是在果,是在P1点两侧造成一个光强的点两侧造成一个光强的低谷,低谷,P1点位于谷底位置。点位于谷底位置。v相反,在相反,在P2点处,从狭缝上缘和下点处,从狭缝上缘和下缘发出的光波的波程差缘发出的光波的波程差1 个波长,个波长,P2成为相干增强区的中心,称为第成为相干增强区的中心,称为第一级衍射极大值。一级衍射极大值。46衍射结果点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径 式中式中 n为介质折射率,为介质折射率,照明光波长,照明光波长,透镜孔径半角,说明埃利斑半
22、径与透镜孔径半角,说明埃利斑半径与照明光源波长成正比,与透镜数值孔径成反比照明光源波长成正比,与透镜数值孔径成反比 sin61. 00nR 由斑点光源衍射形成的埃利斑(a)及其光强分布图(b)衍射使物体上的一个点在成像的时候不会是一个点,而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近,它们将无法被区分开来。47v瑞利判据:瑞利判据:v两埃利斑中心间距等于第一暗环半径R sin61. 00nR 48阿贝成像原理v对于周期性结构的物体,图像的形成用阿贝成对于周期性结构的物体,图像的形成用阿贝成像原理来解释。像原理来解释。v光线通过细小的网孔时要发生衍射,衍射光线光线通过细小的网孔时要发生衍射,衍射光线
23、向各个方向传播,凡是光程差满足向各个方向传播,凡是光程差满足 k=0,1,2,的,互相加强。同一方向的衍射光的,互相加强。同一方向的衍射光则成为平行光束。则成为平行光束。v平行光束通过物镜在后焦面上会聚;形成衍射平行光束通过物镜在后焦面上会聚;形成衍射花样。衍射花样上的某个衍射斑点是由不同物花样。衍射花样上的某个衍射斑点是由不同物点的同级衍射光相干加强形成的;同一物点上点的同级衍射光相干加强形成的;同一物点上的光由于衍射分解,对许多衍射斑点有贡献。的光由于衍射分解,对许多衍射斑点有贡献。v从同一物点发出的各级衍射光,在产生相应的从同一物点发出的各级衍射光,在产生相应的衍射斑点后继续传播,在象平
24、面上又相互干涉,衍射斑点后继续传播,在象平面上又相互干涉,形成物象形成物象k49阿贝成像原理阿贝成像原理v阿贝成像原理可以简单地描述为两阿贝成像原理可以简单地描述为两次干涉作用:平行光束受到有周期次干涉作用:平行光束受到有周期性特征物体的散射作用形成衍射谱,性特征物体的散射作用形成衍射谱,各级衍射波通过干涉重新在像平面各级衍射波通过干涉重新在像平面上形成反映物的特征的像。上形成反映物的特征的像。50物与象之间的相似性物与象之间的相似性 v物象是由直射光和衍射光互相干涉形成的,不让衍射光通过就不能成象,物象是由直射光和衍射光互相干涉形成的,不让衍射光通过就不能成象,参与成象的衍射斑点愈多,则物象
25、与物体的相似性愈好。参与成象的衍射斑点愈多,则物象与物体的相似性愈好。51v分辨力:指分辨物体最小间隔的能力。分辨力:指分辨物体最小间隔的能力。vR=0.61/NA为入射光线波长;NA为镜口率 sin,n=介质折射率;介质折射率;=镜口角镜口角/2(样品对物镜镜口的张角(样品对物镜镜口的张角/2) v思考:思考:如何提高显微镜的分辨能力?如何提高显微镜的分辨能力?肉眼:肉眼:0.2 mm; 光镜:光镜:0.2 um; 电镜:电镜:0.2 nmsin.nAN.61. 0ANR52表表:几种介质的折射率几种介质的折射率sin.nAN.61. 0ANR53v显微镜的几个光学特点:分辨本领是由物镜的分
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