琼脂糖凝胶电泳PPT幻灯片课件.ppt

1、DNA/RNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 1一一实验原理实验原理二二实验仪器、材料与试剂实验仪器、材料与试剂三三实验步骤实验步骤四四注意事项与实验技巧注意事项与实验技巧2凝胶电泳凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术；分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳琼脂糖电泳凝胶电泳 聚丙烯酰胺电泳3一、实验原理一、实验原理（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNADNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，

2、在外加电场分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的以分离大小不同的DNA或或RNA分子。分子。4DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。（2 2）琼脂糖是一种）琼脂糖是一种线性多糖聚合物线性多糖聚合物，可以

3、形成具有刚，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。5分离长度分离长度凝胶电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳200bp近近50kb 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 5500bp 分辨率高分辨率高采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的采用不同浓度的凝胶可以分辨范围广泛的DNA分子分子。6含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量%（W/V）DNA/RNA分子的分离范围（ kb ）0.35600.61200.70.8

4、100.90.571.20.461.50.2320.127二、实验仪器、材料与试剂二、实验仪器、材料与试剂 质粒样品、酶切样品和质粒样品、酶切样品和PCRPCR样品。样品。 凝胶电泳系统和电泳图像分析系统凝胶电泳系统和电泳图像分析系统( (凝胶成凝胶成像系统像系统) )等。等。 琼脂糖、琼脂糖、 1XTAE电泳缓冲液电泳缓冲液、溴化乙锭溴化乙锭、 6X载样缓冲液载样缓冲液 （ 6X loading buffer）和）和DNA分子量标准分子量标准等。等。8凝胶电泳系统凝胶电泳系统DYY-6C型型 双稳定时电泳仪电源（北京双稳定时电泳仪电源（北京六一）六一） 输出范围（显示分辨率）：6-600V(

5、1V) 4-400mA (1mA) 240W 美国美国Bio-rad伯乐伯乐 小型水平电泳槽小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell 9 凝胶成像分析系统凝胶成像分析系统10DNA Marker一个已知分子质量的一个已知分子质量的DNA样品做对照，用样品做对照，用来确定待测样品的相来确定待测样品的相对分子质量。对分子质量。11常用电泳缓冲液常用电泳缓冲液 高度复杂高度复杂DNA混合混合物；超螺物；超螺旋旋DNA12Tris-硼酸（硼酸（TBE） Tris-乙酸（乙酸（TAE） Tris-磷酸（磷酸（TPE） DNA的泳动受到电泳缓冲液和离子浓度的影响。的泳动受到电泳缓冲液和离子

6、浓度的影响。 缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，电导率升高，极易产生大量的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性。变性。 常用的电泳缓冲液有常用的电泳缓冲液有TAE，TPE和和TBE，其中，其中TAE的缓冲容量的缓冲容量最低，长时间电泳将被消耗。最低，长时间电泳将被消耗。13上样缓冲液上样缓冲液电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。组成上样缓冲液。 作用

7、：作用：增加样品比重，以确保增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样均匀沉入加样孔内。孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。使样品呈色，使加样操作更方便。14EB染料染料 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，）是一种高度灵敏的荧光染色剂，它在标准的它在标准的302mm紫外光照射下能发射橙红色紫外光照射下能发射橙红色信号，当信号，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的脂糖凝胶中的EB就插入就插入DNA分子中形成荧光络分子中形成荧光络合物，使合物，使D

8、NA发射的荧光增强几十倍，电泳后发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。 151617 EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少或更少的的DNA即可检出，效果较好；可以加到样品中或胶即可检出，效果较好；可以加到样品中或胶中。中。 EB是诱变剂，有是诱变剂，有剧毒剧毒，使用时一定要戴手套，且一，使用时一定要戴手套，且一定要注意等到琼脂糖凉到四十多度的时候再加定要注意等到琼脂糖凉到四十多度的时候再加EB，否则否则EB

9、有一定的挥发性，而鼻黏膜对有一定的挥发性，而鼻黏膜对EB的吸收是较的吸收是较明显的。明显的。 EB废液要经过净化处理再行弃置。废液要经过净化处理再行弃置。 SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，但操作不便，信新型低毒，高灵敏度染料，但操作不便，信号不稳定，易猝灭，价格较昂贵。号不稳定，易猝灭，价格较昂贵。 Goldview:主要成分吖啶橙，主要成分吖啶橙，高毒高毒，在相当程度导致，在相当程度导致细胞凋忘。较便宜，但效果不及细胞凋忘。较便宜，但效果不及EB。18三、实验步骤三、实验步骤1. 制备琼脂糖凝胶（制备琼脂糖凝胶（1%）2. 制备凝胶板制备凝胶板3. 加样加样4. 电泳电泳 5. 染色染色6

10、. 结果观察结果观察 19二、实验方法二、实验方法 150TAE的稀释：如的稀释：如制备制备50mL 1TAE，取，取1mL 50TAE加入加入49mL水定容至水定容至50mL。 2制备制备1%的琼脂糖胶的琼脂糖胶液：取液：取0.2g琼脂糖溶于琼脂糖溶于20mL TAE中，在短时间中，在短时间里加热琼脂糖全部熔化，里加热琼脂糖全部熔化，使溶液冷却至使溶液冷却至40.(加入加入浓度为浓度为10mg/mL的的EB 2L，使，使EB的终浓度为的终浓度为1g/mL)。202122 3用于用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满乙醇干燥

11、后灌满3% 的的H2O2溶液，于室温放置溶液，于室温放置10分钟，然后用分钟，然后用DEPCSDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。冲洗电泳槽，梳子同样处理。 4用胶带封住胶床，放好梳子。用胶带封住胶床，放好梳子。23 5将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在35mm之间，凝之间，凝固固2060min。24 6在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。 7向电泳槽中注入适量的向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液缓冲液，通常缓冲液高于胶面高于

12、胶面1cm。 8分别将分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合样品与加样缓冲液混合,用移液枪用移液枪将样品加入加样孔。将样品加入加样孔。 9正确连接电泳槽和电源，设定稳压为正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一，电流一般为般为50mA。 10电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。25262728四、注意事项与实验技巧四、注意事项与实验技巧 制胶和加样过程中要制胶和加样过程中要防止气泡防止气泡的产生。的产生。 紫外光紫外光对人眼有害对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。 EB具有强诱变性，可具有强诱变性，可

13、致癌致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。必须戴手套操作，严格注意防护。 加样时，加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或则样品渗漏或DNA带型不整齐。带型不整齐。 配胶和灌电泳槽需使用配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液同一批缓冲液。因为。因为pH 或离子强度很或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA 片段的泳动。片段的泳动。 梳板的选用梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于齿宽厚，形成

14、的点样容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于PCR产物、酶产物、酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。 29跑出好看的电泳图跑出好看的电泳图 凝胶一定要加热凝胶一定要加热熔解完全熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清，均匀，可以对着光亮的地方看看清澈不清澈澈不清澈 ； 一般情况下，梳子一般情况下，梳子越薄而长越薄而长，条带越好看，条带越好看 ； 上样量上样量不宜过多不宜过多，会造成条带的相互挤压；，会造成条带的相互挤压； 如果点样孔多余，将样点到如果点样孔多余，将样点到中间中间，中间电场比较均匀，中间电场比较均匀 ，尽量避，尽量避免边缘效应免边缘效应 ； 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致一致； 加样时加样时不要太快不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内 ； 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。 30Thanks31