原位杂交ppt课件.ppt
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1、第五章第五章 原位杂交组织化学原位杂交组织化学刘颖(in situ hybridization histochemistry)1What Kind of Disease Is Cancer?2CELLCell junctionProliferationExtracellular matrixTelomereSignal transductionDifferentiationApoptosis3 What We Have Known about the Cell Cycle Control?4OncogeneAntioncogene Cell Division Cycle Gene, cdc g
2、enes;Cyclins Cyclin Dependent Kinases, CDKsCyclin Dependent Kinases Inhibitors, CDKIsS phase Promoting Factor, SPFMaturation Promoting Factor, MPF蛋白质水平基因水平5 第一节第一节 原位杂交组织化学基本原理原位杂交组织化学基本原理o 变性变性o 变性温度(变性温度(TmTm)o 复性复性共价键酯键James Watson and Francis Crick (Cambridge) discover the structure of DNA. 6我国培
3、育出转基因克隆奶牛我国培育出转基因克隆奶牛 时间:2011-08-26 吉林大学农学部奶牛繁育基地近日成功培育出一头携带转入赖氨酸基因的克隆奶牛。据介绍,这是世界上首次利用分子生物学技术和体细胞核移植技术获得的赖氨酸转基因克隆牛,也标志着世界克隆技术的又一次突破。 7o DNA变性变性(denaturation)n指指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。o 变性温度(变性温度(melting temperature,Tm)n热变性使热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度。分子双链解开所需温度称为熔解温度。o 影响影响
4、Tm的因素的因素nDNA的均一性的均一性nDNA分子中的(分子中的(G+C)含量)含量n溶剂的性质溶剂的性质p低离子强度,低离子强度,Tm低低o高高pHo变性剂甲酰胺变性剂甲酰胺8o 复性(复性(renaturation)n指变性的指变性的DNA(单链单链)在适当的条件下,两条彼此分开的在适当的条件下,两条彼此分开的多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋结构结构o 复性的影响因素复性的影响因素n温度温度nDNA浓度浓度nDNA片段长度片段长度nDNA分子的复杂性分子的复杂性n离子强度离子强度9第二节第二节 核酸分子杂交核酸分子杂交o 两条互补两条互补DNA或或RNA单
5、链之间以复性的原单链之间以复性的原理形成双链核酸的过程理形成双链核酸的过程o 影响杂交体稳定性的因素影响杂交体稳定性的因素n杂交双链的碱基组成杂交双链的碱基组成n杂交双链的长度杂交双链的长度n碱基错配程度碱基错配程度n离子强度离子强度n变性剂浓度变性剂浓度10o 核酸分子杂交核酸分子杂交n 液相杂交液相杂交n 固相杂交固相杂交11原位杂交组织化学原位杂交组织化学(ISH)p 应用特定标记的应用特定标记的已知核酸探针已知核酸探针与与组织或细胞组织或细胞中待测中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合,形成杂的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合,形成杂交体,杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。
6、交体,杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。p 可进行细胞内核酸定性、可进行细胞内核酸定性、 定位的一种技术。定位的一种技术。12第三节第三节 核酸分子探针核酸分子探针 o定义:一种带有标记物的、已知的、仅与定义:一种带有标记物的、已知的、仅与靶分子特异反应的分子。靶分子特异反应的分子。o探针的种类探针的种类nDNA探针探针ncRNA探针探针n寡核苷酸探针寡核苷酸探针13o DNA探针探针n基因组基因组DNA探针探针 最常用的核酸探针,指长度在几百碱基对以上的双最常用的核酸探针,指长度在几百碱基对以上的双链链DNA或单链或单链DNA探针探针ncDNA探针探针 互补于互补于mRNA的的DNA分
7、子,是由逆转录酶催化而分子,是由逆转录酶催化而产生的产生的p优点:制备方法简便,不易降解,标记方法较成熟优点:制备方法简便,不易降解,标记方法较成熟14o cRNA探针探针n以以cDNA为模板在体外转录而成的探针为模板在体外转录而成的探针 n优点优点p 单链探针,故以单链探针,故以cRNA探针进行杂交反应可避免应用双链探针进行杂交反应可避免应用双链cDNA探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。p cRNA和和mRNA之间形成的杂交体要比之间形成的杂交体要比cDNA-mRNA杂交杂交体稳定因此杂交反应后可经受高严格度洗涤。体稳定因此杂交反应后可经
8、受高严格度洗涤。p cRNA-mRNA杂交体不受杂交体不受RNA酶的影响,故杂交后还可用酶的影响,故杂交后还可用RNA酶处理,以除去未结合的探针。酶处理,以除去未结合的探针。n缺点缺点p 制备过程较复杂,需要较高的分子生物学实验条件,制备过程较复杂,需要较高的分子生物学实验条件,p cRNA对对RNA酶敏感,易被酶敏感,易被RNA酶破坏,因而在操作过程中酶破坏,因而在操作过程中需严格防止需严格防止RNA酶污染。酶污染。 15o 寡核苷酸探针寡核苷酸探针 根据已知的核酸序列,采用根据已知的核酸序列,采用DNA合成仪合成一定合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段。长度的寡核苷酸片段。n 优点:优点: 短
9、的探针比长探针杂交速度快,易穿透组织。短的探针比长探针杂交速度快,易穿透组织。 制备简易,可以在短时间内大量制备,序列任制备简易,可以在短时间内大量制备,序列任定。定。 在合成中进行标记制成探针。在合成中进行标记制成探针。 使用简便,可合成单链探针,避免了用双链使用简便,可合成单链探针,避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性,提高杂交效率。探针在杂交中自我复性,提高杂交效率。 寡核苷酸探针可以检测小寡核苷酸探针可以检测小DNA片段,在严格的片段,在严格的杂交条件下,可用于检测在序列中单碱基对的错配。杂交条件下,可用于检测在序列中单碱基对的错配。 16o 探针的标记探针的标记 n 探针标记物探针
10、标记物o 放射性同位素放射性同位素 3H 、3535S S或或32P 易掺入,敏感,易检易掺入,敏感,易检测,测,时间长,污染时间长,污染 o 非放射性标记物非放射性标记物 稳定,分辨率高,时间短,操作简稳定,分辨率高,时间短,操作简便,无污染便,无污染n酶类:酶类:HRP,AKPHRP,AKPn半抗原:生物素半抗原:生物素, ,地高辛,地高辛,2,4-二硝基苯(二硝基苯(DNP) n荧光素:荧光素:FITC,罗丹明罗丹明n 探针标记方法探针标记方法17o 根据探针的标记物 是否能直接检测n 直接法n 间接法18第四节第四节 原位杂交组织化学基本程序原位杂交组织化学基本程序o 标本制备标本制备
11、o 杂交前处理杂交前处理 o 杂交反应杂交反应 o 杂交后处理杂交后处理o 检测杂交信号检测杂交信号19标本制备标本制备o 取材取材 o 固定固定 n 固定剂固定剂 4PFAn 固定方法固定方法 o 切片切片 n 石蜡切片石蜡切片n 冰冻切片冰冻切片 n 培养细胞培养细胞 载玻片核酸酶清洗试剂盒(原位杂交) 20杂交前处理杂交前处理 o 增强组织通透性和核酸探针穿透性增强组织通透性和核酸探针穿透性 n 去污剂处理去污剂处理 Triton X-100处理15min n 蛋白酶处理蛋白酶处理 蛋白酶K ,37孵育1530 min o 减低背景染色减低背景染色n 酸酐和稀酸处理酸酐和稀酸处理 0.2
12、5%乙酸酐处理10 min n 预杂交预杂交 不含探针的预杂交液在杂交温度下预先孵育标本12h n 内源性生物素和酶的抑制内源性生物素和酶的抑制 o 用5%脱脂奶粉缓冲盐液来稀释标记的卵白素以及将标本浸于含2%牛血清白蛋白的缓冲液o 对于内源性的AKP和过氧化物酶过氧化物酶可通过将标本分别浸于20%乙酸(4)中15秒或过碘酸淋洗和用含1%H2O2的蒸馏水或甲醇溶液室温孵育30min加以阻断。 21杂交反应杂交反应 o双链双链DNA探针和靶探针和靶DNA变性变性 n杂交反应进行时,探针和靶核酸必须是单链。o杂交液杂交液n探针探针o探针长度探针长度 50-100bp,最长不宜超过400个碱基。探针
13、短易进入细胞,杂交率高,杂交时间短。o探针浓度探针浓度 0.5-5.0g/ml 。n甲酰胺甲酰胺可使Tm降低,可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。n硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖能与水结合,提高探针有效浓度。n牛血清白蛋白牛血清白蛋白阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合,以减低背景。 o杂交温度和时间杂交温度和时间 n大约在3060之间。一般将杂交时间定为1620h,或为了方便,将杂交液和标本孵育过夜 用杂交液孵育组织切片,杂交液中标记的核酸探针在适当的条件下与组织细胞内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程。22杂交后处理杂交后处理 o 杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同
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