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类型原位杂交ppt课件.ppt

  • 上传人(卖家):三亚风情
  • 文档编号:2192110
  • 上传时间:2022-03-19
  • 格式:PPT
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    关 键  词:
    原位杂交 ppt 课件
    资源描述:

    1、第五章第五章 原位杂交组织化学原位杂交组织化学刘颖(in situ hybridization histochemistry)1What Kind of Disease Is Cancer?2CELLCell junctionProliferationExtracellular matrixTelomereSignal transductionDifferentiationApoptosis3 What We Have Known about the Cell Cycle Control?4OncogeneAntioncogene Cell Division Cycle Gene, cdc g

    2、enes;Cyclins Cyclin Dependent Kinases, CDKsCyclin Dependent Kinases Inhibitors, CDKIsS phase Promoting Factor, SPFMaturation Promoting Factor, MPF蛋白质水平基因水平5 第一节第一节 原位杂交组织化学基本原理原位杂交组织化学基本原理o 变性变性o 变性温度(变性温度(TmTm)o 复性复性共价键酯键James Watson and Francis Crick (Cambridge) discover the structure of DNA. 6我国培

    3、育出转基因克隆奶牛我国培育出转基因克隆奶牛 时间:2011-08-26 吉林大学农学部奶牛繁育基地近日成功培育出一头携带转入赖氨酸基因的克隆奶牛。据介绍,这是世界上首次利用分子生物学技术和体细胞核移植技术获得的赖氨酸转基因克隆牛,也标志着世界克隆技术的又一次突破。 7o DNA变性变性(denaturation)n指指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。o 变性温度(变性温度(melting temperature,Tm)n热变性使热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度。分子双链解开所需温度称为熔解温度。o 影响影响

    4、Tm的因素的因素nDNA的均一性的均一性nDNA分子中的(分子中的(G+C)含量)含量n溶剂的性质溶剂的性质p低离子强度,低离子强度,Tm低低o高高pHo变性剂甲酰胺变性剂甲酰胺8o 复性(复性(renaturation)n指变性的指变性的DNA(单链单链)在适当的条件下,两条彼此分开的在适当的条件下,两条彼此分开的多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋结构结构o 复性的影响因素复性的影响因素n温度温度nDNA浓度浓度nDNA片段长度片段长度nDNA分子的复杂性分子的复杂性n离子强度离子强度9第二节第二节 核酸分子杂交核酸分子杂交o 两条互补两条互补DNA或或RNA单

    5、链之间以复性的原单链之间以复性的原理形成双链核酸的过程理形成双链核酸的过程o 影响杂交体稳定性的因素影响杂交体稳定性的因素n杂交双链的碱基组成杂交双链的碱基组成n杂交双链的长度杂交双链的长度n碱基错配程度碱基错配程度n离子强度离子强度n变性剂浓度变性剂浓度10o 核酸分子杂交核酸分子杂交n 液相杂交液相杂交n 固相杂交固相杂交11原位杂交组织化学原位杂交组织化学(ISH)p 应用特定标记的应用特定标记的已知核酸探针已知核酸探针与与组织或细胞组织或细胞中待测中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合,形成杂的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合,形成杂交体,杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。

    6、交体,杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。p 可进行细胞内核酸定性、可进行细胞内核酸定性、 定位的一种技术。定位的一种技术。12第三节第三节 核酸分子探针核酸分子探针 o定义:一种带有标记物的、已知的、仅与定义:一种带有标记物的、已知的、仅与靶分子特异反应的分子。靶分子特异反应的分子。o探针的种类探针的种类nDNA探针探针ncRNA探针探针n寡核苷酸探针寡核苷酸探针13o DNA探针探针n基因组基因组DNA探针探针 最常用的核酸探针,指长度在几百碱基对以上的双最常用的核酸探针,指长度在几百碱基对以上的双链链DNA或单链或单链DNA探针探针ncDNA探针探针 互补于互补于mRNA的的DNA分

    7、子,是由逆转录酶催化而分子,是由逆转录酶催化而产生的产生的p优点:制备方法简便,不易降解,标记方法较成熟优点:制备方法简便,不易降解,标记方法较成熟14o cRNA探针探针n以以cDNA为模板在体外转录而成的探针为模板在体外转录而成的探针 n优点优点p 单链探针,故以单链探针,故以cRNA探针进行杂交反应可避免应用双链探针进行杂交反应可避免应用双链cDNA探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。p cRNA和和mRNA之间形成的杂交体要比之间形成的杂交体要比cDNA-mRNA杂交杂交体稳定因此杂交反应后可经受高严格度洗涤。体稳定因此杂交反应后可经

    8、受高严格度洗涤。p cRNA-mRNA杂交体不受杂交体不受RNA酶的影响,故杂交后还可用酶的影响,故杂交后还可用RNA酶处理,以除去未结合的探针。酶处理,以除去未结合的探针。n缺点缺点p 制备过程较复杂,需要较高的分子生物学实验条件,制备过程较复杂,需要较高的分子生物学实验条件,p cRNA对对RNA酶敏感,易被酶敏感,易被RNA酶破坏,因而在操作过程中酶破坏,因而在操作过程中需严格防止需严格防止RNA酶污染。酶污染。 15o 寡核苷酸探针寡核苷酸探针 根据已知的核酸序列,采用根据已知的核酸序列,采用DNA合成仪合成一定合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段。长度的寡核苷酸片段。n 优点:优点: 短

    9、的探针比长探针杂交速度快,易穿透组织。短的探针比长探针杂交速度快,易穿透组织。 制备简易,可以在短时间内大量制备,序列任制备简易,可以在短时间内大量制备,序列任定。定。 在合成中进行标记制成探针。在合成中进行标记制成探针。 使用简便,可合成单链探针,避免了用双链使用简便,可合成单链探针,避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性,提高杂交效率。探针在杂交中自我复性,提高杂交效率。 寡核苷酸探针可以检测小寡核苷酸探针可以检测小DNA片段,在严格的片段,在严格的杂交条件下,可用于检测在序列中单碱基对的错配。杂交条件下,可用于检测在序列中单碱基对的错配。 16o 探针的标记探针的标记 n 探针标记物探针

    10、标记物o 放射性同位素放射性同位素 3H 、3535S S或或32P 易掺入,敏感,易检易掺入,敏感,易检测,测,时间长,污染时间长,污染 o 非放射性标记物非放射性标记物 稳定,分辨率高,时间短,操作简稳定,分辨率高,时间短,操作简便,无污染便,无污染n酶类:酶类:HRP,AKPHRP,AKPn半抗原:生物素半抗原:生物素, ,地高辛,地高辛,2,4-二硝基苯(二硝基苯(DNP) n荧光素:荧光素:FITC,罗丹明罗丹明n 探针标记方法探针标记方法17o 根据探针的标记物 是否能直接检测n 直接法n 间接法18第四节第四节 原位杂交组织化学基本程序原位杂交组织化学基本程序o 标本制备标本制备

    11、o 杂交前处理杂交前处理 o 杂交反应杂交反应 o 杂交后处理杂交后处理o 检测杂交信号检测杂交信号19标本制备标本制备o 取材取材 o 固定固定 n 固定剂固定剂 4PFAn 固定方法固定方法 o 切片切片 n 石蜡切片石蜡切片n 冰冻切片冰冻切片 n 培养细胞培养细胞 载玻片核酸酶清洗试剂盒(原位杂交) 20杂交前处理杂交前处理 o 增强组织通透性和核酸探针穿透性增强组织通透性和核酸探针穿透性 n 去污剂处理去污剂处理 Triton X-100处理15min n 蛋白酶处理蛋白酶处理 蛋白酶K ,37孵育1530 min o 减低背景染色减低背景染色n 酸酐和稀酸处理酸酐和稀酸处理 0.2

    12、5%乙酸酐处理10 min n 预杂交预杂交 不含探针的预杂交液在杂交温度下预先孵育标本12h n 内源性生物素和酶的抑制内源性生物素和酶的抑制 o 用5%脱脂奶粉缓冲盐液来稀释标记的卵白素以及将标本浸于含2%牛血清白蛋白的缓冲液o 对于内源性的AKP和过氧化物酶过氧化物酶可通过将标本分别浸于20%乙酸(4)中15秒或过碘酸淋洗和用含1%H2O2的蒸馏水或甲醇溶液室温孵育30min加以阻断。 21杂交反应杂交反应 o双链双链DNA探针和靶探针和靶DNA变性变性 n杂交反应进行时,探针和靶核酸必须是单链。o杂交液杂交液n探针探针o探针长度探针长度 50-100bp,最长不宜超过400个碱基。探针

    13、短易进入细胞,杂交率高,杂交时间短。o探针浓度探针浓度 0.5-5.0g/ml 。n甲酰胺甲酰胺可使Tm降低,可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。n硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖能与水结合,提高探针有效浓度。n牛血清白蛋白牛血清白蛋白阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合,以减低背景。 o杂交温度和时间杂交温度和时间 n大约在3060之间。一般将杂交时间定为1620h,或为了方便,将杂交液和标本孵育过夜 用杂交液孵育组织切片,杂交液中标记的核酸探针在适当的条件下与组织细胞内相应的靶核酸互补结合形成杂交体的过程。22杂交后处理杂交后处理 o 杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同

    14、温度盐溶液的漂洗漂洗 o 一般而言,盐浓度由高到低,而温度由低到高,漂洗1015min。高浓度的盐可减少探针与组织标本间的静电结合。o 漂洗过程中,还必须注意防止切片干燥,因干燥的切片即使用大量溶液漂洗也很难减少非特异性结合。 23杂交体检测杂交体检测 o放射性同位素标记探针的检测放射性同位素标记探针的检测 n32P、125I、35S等放射性同位素均可用来标记探针,利用感光乳胶感光乳胶记录被研究材料中放射性物质分布和定位。 o非放射性标记探针的检测非放射性标记探针的检测n常用非放射性标记物多为常用非放射性标记物多为半抗原,以半抗原标记探半抗原,以半抗原标记探针的原位杂交信号可通过针的原位杂交信

    15、号可通过免疫酶组织化学免疫酶组织化学或或亲合组亲合组织化学织化学技术显示。技术显示。 是通过一定的方法使杂交反应形成的杂交体成为是通过一定的方法使杂交反应形成的杂交体成为在显微镜下可识别的产物。在显微镜下可识别的产物。24放射性同位素标记放射性同位素标记探针的检测探针的检测非放射性标记探针的检测非放射性标记探针的检测25对照实验o组织对照nSouthern/Northernn免疫组织化学o探针对照n已知阳性组织和已知阴性组织n用有意义链RNA探针n吸收试验o杂交反应对照n空白实验n杂交前用核酸酶预处理标本o检测系统对照n放射自显影检测系统对照n非放射性原位杂交检测系统对照26试剂盒内容1.胃蛋

    16、白酶(10; Pepsin)2ml; 2.预杂交液 2ml; 3.地高辛标记ADRA1寡核苷酸探针杂交液 2ml;4. 封闭液 5ml; 5.生物素化鼠抗地高辛 5ml; 6.SABC-POD 5ml; 7.生物素化过氧化物酶 5ml; 27 原位杂交组织化学技术进展原位杂交组织化学技术进展o 原位原位PCR技术技术 o 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术 o 胚胎原位杂交技术胚胎原位杂交技术 o 双重和多重原位杂交技术双重和多重原位杂交技术 o 原位杂交结合免疫组织化学技术原位杂交结合免疫组织化学技术 o 电镜原位杂交技术电镜原位杂交技术 o 肽核酸原位杂交肽核酸原位杂交 28p将将PCRPC

    17、R技术与原位杂交技术结合起来,不改变周围技术与原位杂交技术结合起来,不改变周围组织的原有位置,直接在组织、细胞或病原体原位研组织的原有位置,直接在组织、细胞或病原体原位研究基因变化的技术。究基因变化的技术。p根据在扩增反应中所用的根据在扩增反应中所用的dNTP或引物是否标记,或引物是否标记,原位原位PCR可分为:可分为:n直接法原位直接法原位PCRn间接法原位间接法原位PCR原位原位PCR技术技术原理原理29原位原位PCR技术技术n直接法原位直接法原位PCR 在标本进行PCR扩增时,标记物掺入到扩增产物中,无需分子杂交。优点:操作简便、省时. 缺点:特异性较差、扩增效率较低、易出现假阳性,特别

    18、是在组织切片上,假阳性信号主要来自标本中受损DNA的修复过程。固定组织固定组织蛋白酶蛋白酶K消化消化PCR扩增扩增显微镜观察显微镜观察dNTP-荧光素荧光素或或dNTP-地高辛地高辛 -生物素生物素或荧光染料抗地高辛抗体或荧光染料抗地高辛抗体 抗生物素抗体抗生物素抗体30原位原位PCR技术技术n间接法原位间接法原位PCR 先将引物、核苷酸及酶等反应物引入细胞内进行扩增,然后用特异性标记探针与扩增产物进行原位杂交,检测细胞内扩增的DNA产物。优点:克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性染色问题,使扩 增效率提高,特异性增强.缺点:操作步骤繁琐,用时长。固定组织固定组织蛋白酶蛋白酶K消化消化P

    19、CR扩增扩增显微镜观察显微镜观察原位杂交原位杂交31原位原位PCR技术技术o原位逆转录原位逆转录PCR原理:是将逆转录反应和PCR相结合,在原位检测细胞 内低拷贝mRNA的方法。分类:直接法和间接法.步骤:1.用DNA酶处理以破坏组织细胞中的DNA。 2.逆转录 3.扩增优点:不需从标本中提取mRNA,不会因在核酸的 分离中造成靶序列破坏而致信号丢失。32荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术( (Fluorescent in situ hybridization,FISH)原理:一种利用荧光信号对原位杂交样本进 行检测的技术。 o 直接FISHo 间接FISH33直接FISH34直接FISHo 将

    20、已知碱基序列的特异DNA片断作为探针,并标记上不同荧光素,在组织切片、染色体标本上与靶核酸进行DNA-DNA原位杂交,因所形成的杂交体带有荧光素,故可在荧光显微镜下直接观察.o 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、得克萨斯红(Texas Red)、罗丹明(rhodamin) 等。o 简单、快速o 信号较弱,敏感性较低。 35间接FISHo 使用非荧光标记的探针,如生物素或地高辛等标记探针,再通过亲和连接或免疫反应带入各种发光物质来检测杂交体的存在。o 因为有杂交信号放大作用,从而增加了杂交的敏感性,也降低了实验成本,故间接法FISH是目前使用较多的方法。36间接FISH地高辛or生物素3

    21、7Down(21三体三体)综合征间期细胞中的杂综合征间期细胞中的杂交信号交信号38多色FISH通过选用多种具有可分辨光谱的荧光染料与不同的探针结合(直接法),在一个细胞核中可呈现多种颜色标记,同时检测多种染色体异常。39Figure 1. Upright optical slice of an intact embryo in blastoderm stage. Double staining for mRNA and protein. Target mRNAs for in situ probes (sog and sna) and protein stained by primary an

    22、tibody (anti-Dorsal) are indicated in the figure. DAPI was used to label the nuclei. Note that the expression of sog and sna are located apically in the cytoplasm, while the expression of Dorsal is nuclear. 40十二色荧光原位杂交技术鉴定食管癌KYSE450细胞系核型各染色体标记的探针池组合41FIBER FISHo 将细胞的全部DNA在玻片上制备出高度伸展的染色质DNA纤维,然后用标记不同

    23、颜色荧光物质的探针与DNA纤维进行杂交,最后用荧光显微镜观察结果并分析. 4243oSwanger SA, Bassell GJ, Gross C. High-resolution fluorescence in situ hybridization to detect mRNAs in neuronal compartments in vitro and in vivo.Methods Mol Biol. 2011;714:103-23. Department of Cell Biology, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA,

    24、 USA.oJames R. Coleman, David E. Culley, William B. Chrisler and Fred J. Brockman. mRNA-targeted fluorescent in situ hybridization (FISH) of Gram-negative bacteria without template amplification or tyramide signal amplification. Journal of Microbiological Methods.Volume 71, Issue 3, December 2007, P

    25、ages 246-255 Pacific Northwest National Laboratory, PO Box 999/MS P7-50, Richland, WA 99354, USA44胚胎原位杂交技术胚胎原位杂交技术 o全胚胎原位杂交全胚胎原位杂交 从整体水平反映胚胎发育过从整体水平反映胚胎发育过程中基因表达的时空顺序程中基因表达的时空顺序, 是一种广泛应用于胚胎发育是一种广泛应用于胚胎发育调控基因表达研究的技术。调控基因表达研究的技术。 o胚胎组织切片原位杂交胚胎组织切片原位杂交 A:小鼠10.5 dpc胚胎ER反义RNA探针的杂交: RE(菱脑), MA(颌弓), PC(心包)

    26、, SNT(脊神经管), GR(生殖脊), LB(肢芽);B:小鼠10.5 dpc胚胎ERb 有意义链有意义链RNA探针的杂交; C: 13.5 dpc胚胎ERb 反义RNA探针的杂交结 果:TE(端脑), ME(中脑), MO(延髓), SC(脊髓), LB(肢芽):D:小鼠13.5 dpc胚胎ERb 有意义链有意义链RNA探针的杂交。4546原位杂交结合免疫组织化学原位杂交结合免疫组织化学47电镜原位杂交48肽核酸(Peptide Nucleic Acids,PNA)o是人工合成的电中性的肽链电中性的肽链, 以多聚酰胺键形成的类似核苷酸的物质。o具有一个拟肽骨架,没有磷酸戊糖骨架.oPNA链更容易和带有负电荷的互补序列的DNA或RNA链结合. oPNA对互补DNA的错配容忍程度比相应的DNA/DNA更低.oPNA不被目前已知的任何核酸酶或蛋白酶所降解。 49LNA(Locked Nucleic Acid)o 是一种核酸类似物,和普通核酸分子区别在于在其碳环的2氧原子和4碳原子位置引入亚甲基桥形成锁状结构,因此也称锁核酸。o 优点n 和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性 n 水溶性好,自由穿入细胞膜 n 可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成 50A long way to go!51

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