化学酶工程课件.pptx
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- 化学 工程 课件
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1、第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰第二节第二节 模拟酶模拟酶第三节第三节 抗体酶抗体酶第四节第四节 印迹酶印迹酶第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰游离酶缺点:游离酶缺点:抗原性;抗原性;稳定性差;稳定性差;活性不够高。活性不够高。广义:广义:凡是通过化学的方法和手段或是通过化学反应使酶的分凡是通过化学的方法和手段或是通过化学反应使酶的分子结构发生改变的技术或过程,都可称为酶的化学修饰。子结构发生改变的技术或过程,都可称为酶的化学修饰。狭义:狭义:酶的化学修饰则主要是指在较温和的条件下,以可控的酶的化学修饰则主要是指在较温和的条件下,以可控的方式使酶同某些化学试剂发生特异
2、反应,从而引起单个氨基酸方式使酶同某些化学试剂发生特异反应,从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变的过程。残基或其功能基团发生共价的化学改变的过程。定义定义第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰酶化学修饰的目的酶化学修饰的目的:人为地改变天然酶的一些性质,创造人为地改变天然酶的一些性质,创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的特性,扩大酶天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的特性,扩大酶的应用领域。的应用领域。酶化学修饰后的变化酶化学修饰后的变化:改变活性部位的构象。改变活性部位的构象。提高生物活性。提高生物活性。增强酶的稳定性。增强酶的稳定性。降低酶类药物的抗
3、原性。降低酶类药物的抗原性。改变酶学性质。改变酶学性质。第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰酶化学修饰的原理酶化学修饰的原理利用化学修饰剂所具有的各种基团的特性,直接或间接地经过一利用化学修饰剂所具有的各种基团的特性,直接或间接地经过一定的活化过程与酶分子的某种氨基酸残基发生化学反应,从而使定的活化过程与酶分子的某种氨基酸残基发生化学反应,从而使酶分子的结构发生改变。酶分子的结构发生改变。被修饰酶。被修饰酶。修饰剂的选择。修饰剂的选择。修饰反应条件的选择。修饰反应条件的选择。第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰考虑因素考虑因素 酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的化学修
4、饰 酶分子表面的化学修饰酶分子表面的化学修饰方法及修饰剂方法及修饰剂第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰采用一些可溶性的大分子物质通过共价键将其连接到酶分子的的采用一些可溶性的大分子物质通过共价键将其连接到酶分子的的表面,使之在酶表面形成覆盖层,从而使酶的性质发生改变,以表面,使之在酶表面形成覆盖层,从而使酶的性质发生改变,以满足人们的需要。满足人们的需要。常用的大分子修饰剂常用的大分子修饰剂:聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。白蛋白。常见的修饰方法常见的修饰方法:溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、:溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛
5、法、叠氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面的化学修饰酶分子表面的化学修饰第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰酶蛋白的侧链主要包括酶蛋白的侧链主要包括氨基氨基、羧基羧基、巯基巯基、胍胍基基、酚基酚基等。侧链基团等。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变,从而空间构象的改变,从而改变酶的特性和功能。改变酶的特性和功能。第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰氨基的化学修饰氨基的化学修饰 (赖氨酸)(赖氨酸)NH2OCOCH3COCH3NHCOCH3ENZ+pH 7ENZNH2O2NO2N
6、HO3SNO2NHO2NO2NNO2ENZ+pH 7ENZ乙酸酐乙酸酐2,4,62,4,6三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸NH2O2NFNO2NHO2NNO2ENZ+pH 8.5ENZNH2ICH2COONHCH2COOENZ+pH 8.5ENZ2,42,4二硝基氟苯二硝基氟苯碘乙酸碘乙酸氨基的化学修饰氨基的化学修饰 (赖氨酸)(赖氨酸)酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰NH2CONCNHCENZ+RRH2OH2O+ENZRRpH 9NaBH4ENZRRNH2NHENZ+SO2ClN(CH3)2ENZSO2N(CH3)2丹璜酰氯丹璜酰氯氨基的化学修饰氨基的化学修饰 (赖氨酸)(赖氨酸)酶
7、分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰羧基的化学修饰羧基的化学修饰 (谷氨酸、天冬氨酸)(谷氨酸、天冬氨酸)COOCOOOCH3CH3H3CCH3CH3OCH3+pH=5ENZ+BF4+BF4ENZCONCOCNHHCOON HNH+RR+pH=5ENZ+RRENZCCOOCH3COOHCH3OH+ENZ+ENZ0.020.1mol/L HCl025。H2O碳二亚胺碳二亚胺硼氟化三甲烊盐硼氟化三甲烊盐巯基的化学修饰巯基的化学修饰 (半胱氨酸)(半胱氨酸)SHNNSSSSNENZ+ENZSHSSNO2COOOOCSSNO2COOENZ+O2NpH6.8ENZSHCOOSCOOENZ+Cl
8、HgpH5左右ENZHg5,5/ - 二硫代二硫代 双(双(2-硝基苯甲酸)硝基苯甲酸)4,4/ - 二硫二吡啶二硫二吡啶对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸SHNOOCH2CH3SNOOCH2CH3ENZ+pH5ENZNO2SHOHSNO2OHENZ+ClHgENZHgN - 乙基乙基 马来酰亚胺马来酰亚胺2 - 氯汞氯汞 - 4 - 硝基苯酚硝基苯酚巯基的化学修饰巯基的化学修饰 (半胱氨酸)(半胱氨酸)组氨酸咪唑基的化学修饰组氨酸咪唑基的化学修饰碘乙酸碘乙酸焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯NNENZHOCCOOOOCH2CH3CH2CH3+pH47ENZNNOCOCH2CH3NNENZH+ IH2CCOO-p
9、H5.5ENZNNCOCH3酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰精氨酸胍基的化学修饰精氨酸胍基的化学修饰CNNH2NH2OOCCNNHNHOHOHCNNHNHOOOHOH+pH79ENZ25。ENZENZB硼 酸 盐CNNH2NH2OOCCNNHNHOHOHCNNHNHOOOHOHENZ+pH7925。ENZ硼 酸 盐ENZB丁二酮丁二酮1,2-环己二酮环己二酮丁二酮丁二酮1,2-环己二酮环己二酮CNNH2NH2OOCCNNHNHOOOENZ+pH7825。ENZ2苯乙二醛苯乙二醛精氨酸胍基的化学修饰精氨酸胍基的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰色氨酸吲哚基的
10、化学修饰色氨酸吲哚基的化学修饰NHOHONHENZ+CH2BrO2NpH7.5ENZO2N+HBrNHNHENZ+NO2ClS20%60%乙 酸ENZSNO22 羟基羟基 5 - 硝基苄溴硝基苄溴4 - 硝基苯硫氯硝基苯硫氯酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基的化学修饰酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基的化学修饰ONNCCH3OHOCCH3OENZ+pH7.5ENZOOIOIIENZ+I3ENZI3ENZN-乙酰咪唑乙酰咪唑酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰OHOP OOFCHCH3CH3H3CH3CP OOCHCH3CH3OH3CCHCH3ENZ+HCENZ丝氨酸残基丝氨酸残基-二异
11、丙基氟磷酸酯二异丙基氟磷酸酯OOENZ+(NO2)4CENZNO2四硝基甲烷四硝基甲烷酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基的化学修饰酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基的化学修饰甲硫氨酸残基的化学修饰甲硫氨酸残基的化学修饰OCH3SH2O2CH3S+ENZpH5ENZ+H2OOCOCH3OSCH3S+ENZ2HCOOH约-10。ENZ+2HCOOHOCH3OCH3SSI+pH4ENZ+ICH2CNH2ENZCH2CNH2+甲硫氨酸亚砜甲硫氨酸亚砜过甲酸过甲酸碘乙酰胺碘乙酰胺采用一些可溶性的大分子物质通过共价键将其连接到酶分子的的采用一些可溶性的大分子物质通过共价键将其连接到酶分子的的表面,使之在酶表面
12、形成覆盖层,从而使酶的性质发生改变,以表面,使之在酶表面形成覆盖层,从而使酶的性质发生改变,以满足人们的需要。满足人们的需要。常用的大分子修饰剂常用的大分子修饰剂:聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清:聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。白蛋白。常见的修饰方法常见的修饰方法:溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、:溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面的化学修饰酶分子表面的化学修饰第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰聚乙二醇对酶的修饰聚乙二醇对酶的修饰 (单甲氧基聚乙二醇(单甲氧基聚乙二醇MPEG)MPEG均三嗪类
13、衍生物均三嗪类衍生物NNNClClClNNNClClCH3-(OCH2CH2)nOH+CH3-(OCH2CH2)nONNNClClClNNNOOClCH3-(OCH2CH2)nOH+(CH2CH2O)nCH3(CH2CH2O)nCH3MPEG1MPEG2NH2NHNNNOO天 冬酰胺 酶+MPEG2天 冬酰胺 酶(CH2CH2O)nCH3(CH2CH2O)nCH3NH2NH2NHNHClNNNOClNNNO天 冬酰胺 酶天 冬酰胺 酶+MPEG1(CH2CH2O)nCH3(CH2CH2O)nCH3聚乙二醇对酶的修饰聚乙二醇对酶的修饰 (单甲氧基聚乙二醇(单甲氧基聚乙二醇MPEG)MPEG氨基类
14、衍生物氨基类衍生物NHOCOOONCH COORMPEG蜂巢型蜂巢型MPEGCOCH2CH CHCH2OCCOmO(CH2CH2O)nCH3聚乙二醇对酶的修饰聚乙二醇对酶的修饰 (单甲氧基聚乙二醇(单甲氧基聚乙二醇MPEG)第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯对酶的修饰右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯对酶的修饰右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯分子中多糖链上的羟基经活化后可与右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯分子中多糖链上的羟基经活化后可与酶分子上的氨基结合。酶分子上的氨基结合。OCH2OHOHHOHOOCH2OHOHHOHOn(右旋糖酐)(右旋糖酐)OCH2OHOHHOHOOCH2OH
15、OHHOHOOCH2OHOHHOHOOCH2OHOHOOCNHnBrCNOHnOCH2OHOHHOHOOCH2OHOHOHOCNHOn酶OCH2OHOHHOHOOCH2OHOHOOCN酶n羟基活化羟基活化-溴化氰法溴化氰法OCH2OHOHHOHOOCH2OHOHHOHOOCH2OHOHHOHOOCH2HOHONH2OCH2OHOHHOHOOCH2HOHOCCHHNHOOHOCH2OHOHHOHOOCH2HOHOCCHHNHHnIO4OHnCHOOHC酶n酶NaBH4n酶羟基活化羟基活化-高碘酸氧化法高碘酸氧化法糖肽对酶的修饰糖肽对酶的修饰NH2CH3CH3C糖肽+NCONCONHNCONCOp
16、H7.5。4糖肽CH3NH2CH3NCONHNCO糖肽pH9.5酶NCONHNCONH糖肽酶异氰酸法异氰酸法戊二醛法戊二醛法NH2NCH(CH2)3CHO糖肽+OHC(CH2)3CHO糖肽NH2NCH(CH2)3CHONCH(CH2)3CHN酶酶糖肽糖肽具有生物活性的大分子对酶的修饰具有生物活性的大分子对酶的修饰肝素是一种含硫酸酯的黏多糖,由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组肝素是一种含硫酸酯的黏多糖,由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成,平均分子量成,平均分子量20000左右。左右。肝素增加酶的稳定性,由于肝素在体内还具有抗凝血、抗血栓、肝素增加酶的稳定性,由于肝素在体内还具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性,极
17、适合用来修饰血栓溶解酶而增加其疗效。降血脂等活性,极适合用来修饰血栓溶解酶而增加其疗效。OHCOOOHOHOHCH2OSO3OHOHOOHCOOOHOHCH2OSO3OHOHOHOHOSO3NHSO3NHSO3n碳二亚胺法碳二亚胺法OHCOOOHOHOHCH2OSO3OHOHOCOHCOHOHOHCH2OSO3OHOHOOCOSO3NHSO3nRNNROSO3NHSO3nRNHNROHCOHOHOHCH2OSO3OHOHOOCNH2OHCOHOHOHCH2OSO3OHOHOONHOSO3NHSO3nRNHNR酶OSO3NHSO3n酶三氯均嗪法三氯均嗪法NNNClClClOHOHCOOOHOHO
18、HCH2OSO3OHOHOOHCOOOHOHOHCH2OSO3OHOHONNNClCl+OSO3NHSO3nONHSO3nOHNH2OHCOOOHOHOHCH2OSO3OHOHONNNClNH酶ONHSO3n酶蛋白质或其他大分子对酶的修饰蛋白质或其他大分子对酶的修饰修饰剂:人血清白蛋白修饰剂:人血清白蛋白修饰方法:戊二醛法、羰二亚胺法、活化酯法修饰方法:戊二醛法、羰二亚胺法、活化酯法活化酯法活化酯法NH2OOOOHNHCOCH2CH2COOHNO2HONHCOCH2CH2COONO2NHCOCH2CH2CONHNH2白蛋白+白蛋白白蛋白白蛋白酶酶琥珀酸酐琥珀酸酐影响酶化学修饰的因素影响酶化学修
19、饰的因素反应时间的影响反应时间的影响分子量的影响分子量的影响pH对化学修饰的影响对化学修饰的影响修饰剂与酶的用量之比对修饰效果的影响修饰剂与酶的用量之比对修饰效果的影响温度的影响温度的影响第一节第一节 酶分子的化学修饰酶分子的化学修饰修饰酶的性质修饰酶的性质修饰酶的稳定性得到提高修饰酶的稳定性得到提高-热稳定性、耐蛋白水解酶稳定性。热稳定性、耐蛋白水解酶稳定性。修饰酶的抗原性得到降低修饰酶的抗原性得到降低-PEG和人血清白蛋白效果明显。和人血清白蛋白效果明显。修饰酶的半衰期得到延长修饰酶的半衰期得到延长-保持药用酶的体内疗效保持药用酶的体内疗效修饰酶的最适修饰酶的最适pH变化变化-在生理和临床
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