《基因表达》(研究生)全册配套完整课件.ppt（480页）

1、基因表达基因表达(研究生研究生)全册全册配套完整课件配套完整课件基基 因因 表表 达达GENES EXPRESSION基因表达导论基因表达导论学生眼中的学生眼中的基因表达基因表达老师眼中的老师眼中的基因表达基因表达科学方法学中的科学方法学中的基因表达基因表达分子生物学中的分子生物学中的基因表达基因表达应用意义上的应用意义上的基因表达基因表达发展中的发展中的基因表达基因表达认知论上的基因表达认知论上的基因表达文字的作用文字的作用心理的作用心理的作用自身的感知极限自身的感知极限表达的相对性与事实的客观性表达的相对性与事实的客观性主要参考书目主要参考书目书名书名编者编者出版社出版社出版时间出版时间分

2、子遗传学分子遗传学盛祖嘉等盛祖嘉等复旦大学出版社复旦大学出版社1988年年基因基因VIII本杰明本杰明卢因卢因科学出版社科学出版社(余龙余龙)2005年年genes IXBenjamin Lewin2007基因的基因的分子生物学分子生物学 Watson科学出版社科学出版社(杨焕明杨焕明)2005/2009考考 试试平时成绩平时成绩(20分分)：2次课堂练习，每次次课堂练习，每次12题，提前题，提前1周通知；周通知；期末考试期末考试(80分分) 闭卷闭卷 (40分分)：10个名词解释，个名词解释，4个小问答。个小问答。 (时间时间40分钟，交卷后再进行开卷考试分钟，交卷后再进行开卷考试)； 开卷

3、开卷(40分分)：4个论述题。个论述题。 (时间时间75分钟，不准相互交流和携带笔记本分钟，不准相互交流和携带笔记本)。第一章第一章 概述概述基因和基因表达基因和基因表达v基因（概念）的发展基因（概念）的发展v基因表达基因表达vRNA也能提供遗传信息也能提供遗传信息遗传学发展简史遗传学发展简史年份年份概念演进概念演进1865基因是某种特定因子基因是某种特定因子1871发现核酸发现核酸1903染色体是遗传单位染色体是遗传单位1910基因位于染色体上基因位于染色体上1913基因在染色体上是线性排列的基因在染色体上是线性排列的1927突变是基因上物理变化突变是基因上物理变化1931交换导致重组交换导

4、致重组1944DNA是遗传物质是遗传物质1945一个基因编码一个蛋白一个基因编码一个蛋白1951蛋白质首次测序蛋白质首次测序1953DNA是双螺旋结构是双螺旋结构1958DNA是半保留复制是半保留复制1961发现三联体遗传密码发现三联体遗传密码1977真核基因是不连续的真核基因是不连续的1977DNA可以测可以测序序1995基因组首次测序基因组首次测序1.1 基因是基因是DNA Genes are DNAvDNA作为生物体独有的一种语言，是靠非常简作为生物体独有的一种语言，是靠非常简单的单的A、T、C和和G四种碱基来完成的四种碱基来完成的v生命体通过这门语言对内从时空上调控其生命生命体通过这门

5、语言对内从时空上调控其生命活动，维持内环境的平衡和稳定；对外则对各活动，维持内环境的平衡和稳定；对外则对各种各样的外来刺激作出反应，保持一定限度范种各样的外来刺激作出反应，保持一定限度范围内的适应性围内的适应性1.2 基因表达基因表达vDNA分子的碱基序列中隐藏了生物体中所有的分子的碱基序列中隐藏了生物体中所有的遗传信息。基因表达就是将这些信息通过特定遗传信息。基因表达就是将这些信息通过特定的传递链显现出来的过程的传递链显现出来的过程v基因表达的宏观主线是以中心法则提出及其后基因表达的宏观主线是以中心法则提出及其后来的修正来体现来的修正来体现中心法则的提出中心法则的提出中中心心法法则则的的修修

6、正正完完善善基因表达与功能基因组基因表达与功能基因组v目前克隆一个（真核）基因已经是比较容易的目前克隆一个（真核）基因已经是比较容易的事情，想明确该基因的部分功能也不是很难事情，想明确该基因的部分功能也不是很难v功能基因组面临的困难之一在于如何弄清基因功能基因组面临的困难之一在于如何弄清基因执行其功能的过程中是怎样受到各种各样的内执行其功能的过程中是怎样受到各种各样的内因素作用，也就是说基因在表达的过程中如何因素作用，也就是说基因在表达的过程中如何受到内环境调控的受到内环境调控的v真核基因表达调控的网络清晰明了之后，我们真核基因表达调控的网络清晰明了之后，我们才算真正地掌握了它的才算真正地掌握

7、了它的“来龙去脉来龙去脉”真核基因结构真核基因结构v一般真核基因的结构包括转录调控区和基因表一般真核基因的结构包括转录调控区和基因表达区两部分。转录调控区有增强子、沉默子、启达区两部分。转录调控区有增强子、沉默子、启动子，转录启始点之后为基因表达区动子，转录启始点之后为基因表达区v原核生物的操纵子也有类似功能区域的划分原核生物的操纵子也有类似功能区域的划分1.3 RNA作为遗传物质作为遗传物质v逆转录病毒逆转录病毒v基因组是单链的基因组是单链的RNA分子分子 v感染周期中以单链感染周期中以单链RNA为模板，并由逆转录为模板，并由逆转录酶逆转录为单链酶逆转录为单链DNA，进而合成双链，进而合成双

8、链DNA分分子。随后的复制和转录便以这双链子。随后的复制和转录便以这双链DNA为中为中间模板，这种双链间模板，这种双链DNA已成为基因组的一部已成为基因组的一部分，就象基因一样可以遗传分，就象基因一样可以遗传vRNA的复制及逆转录现象的存在，说明了遗的复制及逆转录现象的存在，说明了遗传信息可以以核酸的任何一种形式存在，且这传信息可以以核酸的任何一种形式存在，且这两种形式之间可互相转换两种形式之间可互相转换RNA拟酶拟酶vRNA拟酶（拟酶（ribozyme：也叫核糖拟酶、核：也叫核糖拟酶、核酶）的发现有两个重要意义：酶）的发现有两个重要意义： v1. 使人们认识到使人们认识到RNA也可以象蛋白质

9、一样，也可以象蛋白质一样，具有酶学催化活性，可应用于生化研究和基因具有酶学催化活性，可应用于生化研究和基因工程研究工程研究v2. 为生命起源和分子进化提供了新颖有力的证为生命起源和分子进化提供了新颖有力的证据。据。RNA可能是生命起源中最初出现的生命大可能是生命起源中最初出现的生命大分子，早期的自我复制系统可能就是由分子，早期的自我复制系统可能就是由RNA一一身兼任的身兼任的1.4 基因和基因组基因和基因组v原核基因原核基因v多数功能相关的基因串连一起，组成以操纵元多数功能相关的基因串连一起，组成以操纵元（operon）为单位的调控单元，共同开启或）为单位的调控单元，共同开启或关闭，转录出多顺

10、反子关闭，转录出多顺反子(polycistron)的的mRNAv原核生物的基因为蛋白质编码的原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数序列绝大多数是连续的是连续的v原核基因组原核基因组v原核生物的染色体较小原核生物的染色体较小 v基本上是单倍体基本上是单倍体v原核基因组中除原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多基因有多个拷贝外，重复序列不多个拷贝外，重复序列不多v真核基因真核基因v由一个结构基因与相关的调控区组成，由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子转录产物为单顺反子v是断裂基因（是断裂基因（split gene），基因间存在），基因间存在非编码的间隔非编码的间隔DNA（spa

11、cer DNA）v功能相关的基因构成各种基因家族功能相关的基因构成各种基因家族，可，可以串联在一起，也可以相距很远以串联在一起，也可以相距很远v真核基因组结构庞大真核基因组结构庞大v人人 3109bp；细胞存在染色质、染色体、核膜等结构；细胞存在染色质、染色体、核膜等结构v一般含两份同源的基因组一般含两份同源的基因组v具有多复制起点，每个复制子大小不一具有多复制起点，每个复制子大小不一v含有大量重复序列含有大量重复序列v非编码序列（非编码序列（non-coding sequence）占）占90%以上以上v端粒（端粒（telomere）v其他的序列其他的序列原核与真核基因表达的差异原核与真核基因

12、表达的差异原核原核真核真核转录本转录本多顺反子多顺反子单顺反子单顺反子mRNA来源来源不需加工不需加工必须经过加工必须经过加工翻译翻译转录和翻译转录和翻译偶联偶联转录和翻译是在不同时间和空转录和翻译是在不同时间和空间进行间进行第二章第二章原核转录原核转录 Transcription In ProkaryotesDNARNAPROTEINtodays focusv单链书写：单链书写：5 3v正链（）：非模板链正链（）：非模板链v负链（）：模板链负链（）：模板链v有义链（有义链（ sense strand ）：）：v反义链（反义链（ antisense strand ）：）：2.1 转录（转录（T

13、ranscription）v通过通过RNA多聚酶的催化作用从双链多聚酶的催化作用从双链DNA合成单合成单链链RNA，合成的方向是，合成的方向是53，合成的序列信息，合成的序列信息与有义链一致与有义链一致vRNA合成的模板是反义链合成的模板是反义链vRNA合成的必需组分：启动子（合成的必需组分：启动子（promotor），），RNA多聚酶（多聚酶（RNA polymerase），），NTPs, 终终止子（止子（terminator）v转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步转录与复制的主要差异转录与复制的主要差异v仅一条仅一条DNA模板链被转录模板链被转录

14、vRNA聚合酶不需要引物，能从头起始转录聚合酶不需要引物，能从头起始转录v一个细胞的完整遗传信息中仅有少部分被转录一个细胞的完整遗传信息中仅有少部分被转录成成RNAv转录远没有转录远没有DNA复制精确复制精确2.2 转录的基本过程转录的基本过程 Basic principles of transcription起始（起始（Initiation): RNA聚合酶和启动子聚合酶和启动子延伸（延伸（Elongation): RNA聚合酶聚合酶终止（终止（Termination): 终止子（终止子（terminator）起始起始InitiationvRNA聚合酶与双链聚合酶与双链DNA（dsDNA）结

15、合）结合v滑动直到发现启动子滑动直到发现启动子vDNA螺旋解旋（螺旋解旋（ unwind ）v在起始点（在起始点（initiation site，+1 ）开始合成）开始合成RNAPromoter+1延伸延伸 ElongationvRNA聚合酶一边沿聚合酶一边沿DNA移动，一边合成移动，一边合成RNA链。聚合酶前的链。聚合酶前的DNA不停解旋而聚不停解旋而聚合酶后面合酶后面DNA重新螺旋（重新螺旋（rewind）v在在3-端加上核苷酸（端加上核苷酸（ ribonucleotides ） vRNA链的生长方向是链的生长方向是 5 3v聚合酶沿反义链上的移动方向聚合酶沿反义链上的移动方向3 5 终止

16、终止TerminationvRNA聚合酶识别终止子，停止合成。聚合酶识别终止子，停止合成。v终止子通常是发夹（终止子通常是发夹（ hairpin ）结构，有些终止）结构，有些终止子的需要辅助因子子的需要辅助因子rho（）v转录复合物从转录复合物从DNA模板链上释放模板链上释放vRNA链释放链释放转录的起始延伸和终止转录的起始延伸和终止Promoter binding DNA unwinding RNA chain initiation RNA chain elongation RNA chain termination Rho-dependent termination 1. 聚合不需要引物（

17、聚合不需要引物（ primer ） 2. 酶的活性依赖酶的活性依赖DNA，尤其是双链，尤其是双链DNA作为模板作为模板 3. RNA合成需要合成需要Mg2+，合成方向，合成方向5 3 4. 所有所有RNA聚合酶缺聚合酶缺 3 5外切活性，每掺入约外切活性，每掺入约104105个核苷酸就会发生一个错配个核苷酸就会发生一个错配5.物种之间存在差异物种之间存在差异(NMP)n + NTP (NMP)n+1 + PPi2.3 RNA聚合酶聚合酶 RNA polymeraseRNA聚合酶与聚合酶与 DNA聚合酶比较聚合酶比较RNA polDNA pol模板模板双链双链DNA较好较好单单/双链双链DNA引

18、物需求引物需求不不是是起始起始启动子启动子复制点（复制点（origin）延伸延伸40 nt/ sec900 bp/sec终止子终止子合成的合成的 RNA 模板模板DNAE.coli RNA聚合酶聚合酶v仅由一种聚合酶完成全部仅由一种聚合酶完成全部RNARNA的转录的转录 v酶的组成：酶的组成： 2 2 v全酶（全酶（HoloenzymeHoloenzyme）= =核心酶（核心酶（Core enzymeCore enzyme）+ + v全酶（全酶（ 2 2）: RNA: RNA合成的起始合成的起始v核心酶核心酶（ 2 2 ）: : RNARNA合成的合成的延伸延伸E. coli RNA poly

19、meraseBoth initiation & elongationInitiation only36.5 KD36.5 KD151 KD155 KD11 KD70 KD465kdsubunitSizeaaSize（d）genefunctionalpha ( )32936511 rpoA酶组装所需，与一些调节蛋白作用，也参与催酶组装所需，与一些调节蛋白作用，也参与催化作用化作用beta ()1342150616 rpoB催化作用：链的起始和延伸催化作用：链的起始和延伸beta ()1407155159 rpoC与与DNA模板结合模板结合sigma ()61370263 rpoD使酶定位到启动子

20、上使酶定位到启动子上omega ()9110237 rpoZ体外（体外（in vitro）恢复变性聚合酶的全部活性）恢复变性聚合酶的全部活性所必需的所必需的 亚基亚基v核心酶含有核心酶含有2个相同的组分个相同的组分v由由rpoA 基因编码基因编码v核心酶组装所必需核心酶组装所必需v可能在启动子识别（可能在启动子识别（promoter recognition）中）中发挥作用发挥作用 亚基亚基v由由 rpoB 基因编码基因编码v是是RNA聚合酶的催化中心聚合酶的催化中心v利福平（利福平（Rifampicin）与）与亚基结合，阻断亚基结合，阻断转录的起始。转录的起始。rpoB 基因的突变可以导致利基

21、因的突变可以导致利福平抗性（福平抗性（resistance）v利迪链菌素（利迪链菌素（Streptolydigins）抗性突变）抗性突变也定位在也定位在 rpoB 基因，但抑制延伸而非起始基因，但抑制延伸而非起始v亚基可能包含亚基可能包含2个结构域（个结构域（ domains ）分）分别对应于转录的起始和延伸别对应于转录的起始和延伸 亚基亚基v由由 rpoC 基因编码基因编码v结合结合2个个 Zn2+ 离子，可能参与酶的催化作用离子，可能参与酶的催化作用 v肝素（肝素（Heparin）与）与 亚基结合，在体外抑亚基结合，在体外抑制转录制转录v肝素还与肝素还与 DNA 竞争结合聚合酶竞争结合聚合

22、酶v 亚基负责与亚基负责与DNA模板链的结合模板链的结合 因子（因子（ factor）v许多原核生物拥有多个许多原核生物拥有多个 因子用来识别不同的启动子，因子用来识别不同的启动子，E. coli最常用的是最常用的是 70v核心酶结合核心酶结合 因子后转变为全酶因子后转变为全酶v 因子可以降低核心酶对因子可以降低核心酶对DNA一般位点一般位点(non-specific DNA sites )的亲和力的亲和力(affinity )(10-4) ，而增加对应，而增加对应启动子的亲和力来实现启动子识别启动子的亲和力来实现启动子识别v转录起始后转录起始后( (RNA 链有链有 89 nt) )， 因子

23、从聚合酶中释因子从聚合酶中释放出来放出来v和和RNA聚合酶的其他亚基比，细胞中聚合酶的其他亚基比，细胞中 因子的数量较少因子的数量较少vE. coli 70 的启动子序列有的启动子序列有-10 序列和序列和 35序列序列2.4 转录单位转录单位a transcription unit ATACGTATGC+1promoterterminatorTranscribed regionRNADNATranscriptionAntisense strandAUACG2.4.1 启动子启动子v启动子序列在启动子序列在40 bp 到到 60 bp之间之间v-55 to +20：是聚合酶结合区域：是聚合酶结

24、合区域v-20 to +20：聚合酶紧密结合区，保护其免受：聚合酶紧密结合区，保护其免受DNase I 的消化的消化v上游一直到上游一直到-40的位置：启动子功能的重要区域的位置：启动子功能的重要区域v-10 序列和序列和 -35 序列：对启动子来说尤其重要序列：对启动子来说尤其重要-5-8 bp- GC T ATTGACATATAAT-16-18 bp-+1-35 sequence-10 sequence启动子序列启动子序列-10 序列序列（Pribonow box）v6 bp 序列以序列以-10点为中心点为中心v一致序列（一致序列（consensus sequence）为）为TATAATv

25、开始的开始的2个碱基（个碱基（TA）和最后的）和最后的T在在E. coli启动启动子里高保守子里高保守v6聚体序列与转录起始点聚体序列与转录起始点+1的距离在的距离在5 bp到到8 bp之间，这个距离重要之间，这个距离重要-35 序列序列v保守的保守的6聚体序列以聚体序列以-35点为中心点为中心v一致序列为一致序列为TTGACAv开始的开始的3个碱基（个碱基（TTG）在）在E. coli启动子启动子里高保守里高保守v所有启动子里的所有启动子里的90%，-35序列与序列与- 10 序列的距离在序列的距离在16 bp到到18 bp之间之间+1-7-12-31-365mRNATTGACAAACTGT

26、-35 regionTATAATATATTA-10 region79T44T96%T95A59A51APribnow box84 7953 45%82T TG64AC Aconsensus sequences全酶与启动子结合示意（全酶与启动子结合示意（over 60 bp）足迹法足迹法DNase I footprintvDNA序列单末端放射性序列单末端放射性标记标记v分组与分组与RNA聚合酶结合聚合酶结合vDNase I不完全消化不完全消化v消化产物变性，分离标消化产物变性，分离标记的记的DNA片断片断v凝胶电泳，放射显影凝胶电泳，放射显影DNase I footprint 用用CRP 和和

27、lac 阻遏物分析阻遏物分析lac启动子启动子DNAva：Sequence ladder vb：No DNA-binding proteins added vc：CRP（CAP）only vd,e,f：CRP （CAP）and repressor both addedvg：Repressor onlyvO是阻遏物结合区是阻遏物结合区vC是是CRP结合区结合区vScience 274, 1930-1931（1997）转录起始转录起始与启动子结合与启动子结合v核心酶（核心酶（ 2 ）和）和DNA的结合无特异性的结合无特异性（松散结合）（松散结合）v 因子增强核心酶与启动子结合的特异性因子增强核心酶

28、与启动子结合的特异性v聚合酶沿聚合酶沿DNA滑动寻找启动子的滑动寻找启动子的 -35 序列和序列和 -10 序列，一旦发现即与之形成闭合复合体序列，一旦发现即与之形成闭合复合体（closed complex）v“闭合闭合”意为意为DNA仍是双螺旋形式，闭合二元仍是双螺旋形式，闭合二元复合物的形成是可逆的，平衡常数复合物的形成是可逆的，平衡常数 KB=106-109M-1转录起始转录起始 DNA 解旋解旋v由聚合酶执行的由聚合酶执行的DNA解旋是必需的，这样反义解旋是必需的，这样反义链才能参与碱基配对链才能参与碱基配对v 对于多数基因来说，负超螺旋能够促进解旋以对于多数基因来说，负超螺旋能够促进

29、解旋以增强转录，但有例外（增强转录，但有例外（e.g. gyrase）v与酶结合的一小块区域与酶结合的一小块区域DNA被溶解后，转化为被溶解后，转化为开放复合开放复合体（体（open complex），导致这），导致这一系一系列反应叫做紧密结合列反应叫做紧密结合（tight binding）v对于强启动子，这个转化是不可逆的，速率常对于强启动子，这个转化是不可逆的，速率常数数K2=10-3-10-1sec-1 转录起始转录起始 RNA 链的起始链的起始v无需引物，由无需引物，由GTP（多数情况）或（多数情况）或 ATP开始开始 v插入头两个核苷酸，在他们中间形成磷酸二酯键。产生插入头两个核苷酸

30、，在他们中间形成磷酸二酯键。产生RNA、DNA和酶的三元复合物，和酶的三元复合物，速度常数速度常数K K1 1约约1010-3-3secsec-1-1v最初的最初的9 nt 合并无须聚合酶沿合并无须聚合酶沿DNA 移动和移动和因子释放。因子释放。任何一个碱基加入，聚合酶都可能释放任何一个碱基加入，聚合酶都可能释放RNA，导致流产导致流产起始（起始（abortive initiations）v产生流产起始后聚合酶又产生流产起始后聚合酶又重新开始合成，重新开始合成，RNA聚合酶往聚合酶往往需要经历多次的流产起始，产生一系列短的寡聚核苷往需要经历多次的流产起始，产生一系列短的寡聚核苷酸。这点对于转录

31、整体速率的控制非常重要酸。这点对于转录整体速率的控制非常重要v起始成功后，酶释放起始成功后，酶释放因子。核心酶离开启动子以便另因子。核心酶离开启动子以便另一个聚合酶可以开始，这个过程叫做启动子清除一个聚合酶可以开始，这个过程叫做启动子清除（promoter clear），最小时间），最小时间需需 12 秒（是个相对秒（是个相对长的事件）长的事件）启动子效率（启动子效率（efficiency）v不同启动子间的序列差异很大，转录的效率可以相差不同启动子间的序列差异很大，转录的效率可以相差1000倍倍v-35 序列，序列，-10 序列和转录起始点周围的序列都会影序列和转录起始点周围的序列都会影响到起

32、始效率响到起始效率v转录的头转录的头30个碱基序列控制个碱基序列控制RNA聚合酶对启动子的清聚合酶对启动子的清除，因此影响到转录的速率和启动子的整体效率除，因此影响到转录的速率和启动子的整体效率vRNA链在起始反应中的分离链在起始反应中的分离 v有些启动子在正常情况下不足以强大，需要另外活性有些启动子在正常情况下不足以强大，需要另外活性因子（因子（activating factor）的参与才能起始转录。例）的参与才能起始转录。例如，如，Lac 启动子启动子 Plac 需要需要 cAMP 受体蛋白（受体蛋白（ cAMP receptor protein，CRP）对启动子突变的分析对启动子突变的分

33、析v-10序列下降突变：序列下降突变：T/AG/Cv-10序列上升突变：序列上升突变：GA；GTAAv可以用解链效应解释可以用解链效应解释v-10序列下降突变：序列下降突变： T/AA/Tv-35序列下降突变：序列下降突变： G/CT/Av与核心酶、与核心酶、亚基的结合有关亚基的结合有关转录起始点转录起始点Transcription start sitev90% 的基因是嘌呤（的基因是嘌呤（purine）v+1 位点位点G 比比 A 更普遍更普遍v通常起始位点的两侧是通常起始位点的两侧是 C 和和 T（i.e. CGT 或或 CAT）2.4.2 延伸延伸因子释放后形成因子释放后形成 pol-D

34、NA-RNA 三元复合体（三元复合体（ ternary complex ），），酶会沿着模板前进（启动子清除）酶会沿着模板前进（启动子清除）RNA聚合酶不断解旋前端聚合酶不断解旋前端 DNA ，其后端，其后端DNA重新螺旋。重新螺旋。转录泡（转录泡（Transcription bubble，DNA解旋区，解旋区， 17 bp）RNA 的的3 部分与部分与DNA反义链形成杂交螺旋（反义链形成杂交螺旋（ hybrid helix 约约 12bp ）E. coli 聚合酶平均的移动速率聚合酶平均的移动速率 40 nt/每秒，并与当时的每秒，并与当时的 DNA 序列相关序列相关.起始与延伸起始与延伸2

35、.4.3 RNA 链终止链终止v 在终止子在终止子DNA序列处终止序列处终止 v 绝大多数终止信号（绝大多数终止信号（stop signal）是）是 RNA 发夹（自身互补发夹（自身互补self-complementary）v 富含富含GC 有益于这种结构的稳定有益于这种结构的稳定v 终止有终止有Rho-依赖型和非依赖型依赖型和非依赖型vRNA 分离分离 DNA 复性复性 RNA pol释放释放终止子（终止子（Terminator）vDNA 的一段特殊序列，转录复合体在此分离的一段特殊序列，转录复合体在此分离vClass 1: 蛋白非依赖型蛋白非依赖型v自身互补组成茎环（自身互补组成茎环（ s

36、tem-loop ）或发夹二级结构）或发夹二级结构v连续的腺苷酸（连续的腺苷酸（As ）转录成）转录成RNA 末端的一串尿苷末端的一串尿苷酸（酸（ Us ） vClass 2: 蛋白依赖型蛋白依赖型v仅存在茎环或发夹二级结构仅存在茎环或发夹二级结构E. coli. 中一个中一个-非依赖的转录终止模型非依赖的转录终止模型vRNA 转录本自身互补转录本自身互补v富含富含GC的序列稳定使的序列稳定使聚合酶停滞聚合酶停滞v茎环后紧接的一串茎环后紧接的一串 Us（4个或更多）减弱个或更多）减弱 RNA和反义和反义 DNA链的结链的结合力，利于分离合力，利于分离-依赖的终止依赖的终止v有些基因的终止子需要

37、辅助因子有些基因的终止子需要辅助因子蛋白来蛋白来介导转录的终止介导转录的终止 vRNA 的的3 末端无连续的末端无连续的 U vRho 结合到单链结合到单链RNA 的特别位点的特别位点vRho 水解水解 ATP 从从RNA链的初生端向转链的初生端向转录复合体方向移动，最终使聚合酶终止录复合体方向移动，最终使聚合酶终止转录转录vRho 蛋白（六聚体蛋白（六聚体hexameric 蛋白）结合到蛋白）结合到RNA 某个特定位某个特定位点（点（72bp）v沿初生的沿初生的RNA 链向链向RNA pol复复合体移动合体移动v在在Rho -依赖的终止子处停止依赖的终止子处停止v转录复合体解离转录复合体解离

38、转录终止点转录终止点ttR1R1研究研究vt tR1R1 ，依赖的终止子依赖的终止子v不加不加蛋白的体外转录产物大于蛋白的体外转录产物大于16S，加入加入蛋白，从右启动子（蛋白，从右启动子（ PR ）转录的产物约）转录的产物约9St tR1R1转录终止点转录终止点v研究方法：研究方法： RNase T1（专一作用于（专一作用于RNA分子的分子的GpN键，产物的末端为键，产物的末端为G-3-P）分别消化）分别消化9S和和16SRNAv9S产物（有产物（有5种产物）种产物）v16S产物（仅一种产物）产物（仅一种产物）CAUACAUUCAAUCAAUUGv在在3端的端的AUCAA任何一个核苷酸上都可

39、以终止任何一个核苷酸上都可以终止ttR1R1的突变分析的突变分析v活体内活体内tR1的转录终止有利于的转录终止有利于溶原（溶原（lysogene），转录），转录继续有利于裂解（继续有利于裂解（lysis）v有利于终止的突变有利于终止的突变vcin1A：G/UA/Ucin1Acnc1Ccnc8Gv不利于终止的突变不利于终止的突变vcnc1C：U/AC/Avcnc8G：A/UG/U终止效率终止效率v体外转录，检测各突变型离体转录产物的长短，表中数值为终止体外转录，检测各突变型离体转录产物的长短，表中数值为终止子后子后/前的比值前的比值v比值大终止程度小，比值小终止程度大比值大终止程度小，比值小终止

40、程度大cin1A有利于终止有利于终止cnc1C有利于连读有利于连读双突变双突变cnc1C的继续转录效应大大超过的继续转录效应大大超过cin1A的终止效应的终止效应噬菌体噬菌体不同时间后继续转录不同时间后继续转录 25秒秒40秒秒55秒秒3 0 0秒秒300秒（秒（）041410020cin1A1009cin1 cnc188929495转录与翻译偶联（转录与翻译偶联（coupling）无义突变和转录终止无义突变和转录终止v核糖体（核糖体（ribosomesribosomes）参与转录的终止（后面转录）参与转录的终止（后面转录调控还会提到）调控还会提到）v核糖体的翻译阻止核糖体的翻译阻止Rho蛋白

41、蛋白赶上赶上RNA聚合酶聚合酶v一个操纵子中，上游基因的突变不但影响自身的表一个操纵子中，上游基因的突变不但影响自身的表达，还影响下游基因的表达；下游基因突变则不影达，还影响下游基因的表达；下游基因突变则不影响上游基因的表达响上游基因的表达v多数极性突变是无义突变（多数极性突变是无义突变（nonsense mutant）或移）或移码突变码突变v突变位置越接近突变位置越接近N端，表达的极性效应越强；越接近端，表达的极性效应越强；越接近C端端越弱越弱插入序列（插入序列（IS）的极性效应）的极性效应v插入序列（插入序列（insertion sequence）如）如IS1、IS2等等DNA片断插入基因

42、中也产生极性效应片断插入基因中也产生极性效应vIS1：与插入方向无关，两端有无义密码子，形成一大：与插入方向无关，两端有无义密码子，形成一大段不翻译区段不翻译区vIS2： 本身含有依赖于本身含有依赖于Rho蛋白的终止序列（蛋白的终止序列（tIS2），），只有一种方向插入时产生极性效应只有一种方向插入时产生极性效应v天然的极性现象，天然的极性现象，T7噬菌体，靠近启动子的基因噬菌体，靠近启动子的基因转录效率高，远离的低。基因间的距离较远转录效率高，远离的低。基因间的距离较远第三章第三章原核转录调控原核转录调控 Regulation of Transcription in Prokaryotesv

43、操纵子（操纵子（operon）v全局性调控（全局性调控（global regulation）v因子指导的调控因子指导的调控v其他调控其他调控v抗终止（抗终止（anti-termination）v反义控制（反义控制（antisense control）v噬菌体策略噬菌体策略3.1 操纵子（操纵子（ operon ）v由由Jacob 和和 Monod 于于1961年首次提出操纵子年首次提出操纵子概念概念v基因表达和调节的单位，包括：基因表达和调节的单位，包括：v结构基因（结构基因（Structural genes）在某个特定代谢途）在某个特定代谢途径中的一组酶，它们被控制共同表达径中的一组酶，它们

44、被控制共同表达v控制元件（控制元件（Control elements），比如操纵基因（），比如操纵基因（operator）序列）序列v调节基因（调节基因（Regulator gene(s)）产物能够识别控制）产物能够识别控制元件（可以是不同操纵子上编码的）元件（可以是不同操纵子上编码的）控制元件控制元件结构基因结构基因3.2 E.Coli 乳糖（乳糖（lac）操纵子）操纵子3.2.1 结构基因结构基因vlacZ：编码：编码-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-galactosidase），），水解乳糖（水解乳糖（lactose）为葡萄糖（）为葡萄糖（glu）+半乳糖（半乳糖（gal）vlacY：编码半乳

45、糖透过酶（：编码半乳糖透过酶（permease）转运乳糖）转运乳糖穿透细胞壁穿透细胞壁vlacA：编码半乳糖转乙酰基酶（：编码半乳糖转乙酰基酶（transacetylase）用于乳糖代谢用于乳糖代谢v基因基因lacZ, lacY, lacA 是由一个启动子是由一个启动子Plac 控制的控制的转录单位转录单位lacZYA转录而来转录而来3.2.2 操纵基因（操纵基因（operator）POZYA结构基因阻遏物基因启动子操纵基因产生阻遏蛋白RNA酶结合结合阻遏物IvOlac：v位于启动子位于启动子Plac 3-端端 -5 and +21v与与lac 阻遏物（阻遏物（ repressor ）结合）结

46、合3.2.3 阻遏物（阻遏物（repressor）v由由LacI基因编码，相同的亚基组基因编码，相同的亚基组成有活性的成有活性的4聚体，与操纵基因聚体，与操纵基因（Olac）结合占用一）结合占用一26bp的回文的回文（palindromic）序列）序列v同时，同时，RNA聚合酶能够与启动子聚合酶能够与启动子结合，实际上阻遏物增加了聚合结合，实际上阻遏物增加了聚合酶与启动子的结合力约酶与启动子的结合力约2个数量个数量级级v聚合酶与聚合酶与Plac 只能紧密结合而只能紧密结合而不能起始转录不能起始转录v缺少诱导物（如乳糖）时阻遏物缺少诱导物（如乳糖）时阻遏物几乎阻断几乎阻断 lacZYA 所有的转

47、录所有的转录Lac 启动子和操纵基因序列启动子和操纵基因序列示阻遏物结合区的回文序列示阻遏物结合区的回文序列3TTAACACTCGCCTATTGTTAA55-(lacO1)-3阻遏物阻遏物4聚体的协同作用使结合的聚体的协同作用使结合的DNA 成环（成环（Loop）基因的表达方式基因的表达方式v1.组成性表达（组成性表达（constitutive expression）v此类基因只受启动子与此类基因只受启动子与RNA聚合酶相互作用的影响聚合酶相互作用的影响，不受其他机制的调节。如管家基因（，不受其他机制的调节。如管家基因（housekeeping gene）v2.诱导诱导/阻遏表达阻遏表达v诱导

48、（诱导（induction）-在特定环境信号刺激下表达在特定环境信号刺激下表达增强的过程增强的过程v阻遏（阻遏（repression）-表达产物水平降低的过程表达产物水平降低的过程3.2.4 诱导表达诱导表达v 无诱导物时，阻遏物阻断无诱导物时，阻遏物阻断lacZYA所有的表达，但仍所有的表达，但仍有极低水平的转录有极低水平的转录v 一旦出现乳糖，低水平的透一旦出现乳糖，低水平的透过酶允许操纵子立即响应。过酶允许操纵子立即响应。同时同时-半乳糖苷酶能将乳糖半乳糖苷酶能将乳糖部分转变为异乳糖（部分转变为异乳糖（ allolactose ）v 异乳糖作为诱导物与异乳糖作为诱导物与lac阻遏阻遏物结

49、合并使之失活物结合并使之失活v细胞内的真实诱导物细胞内的真实诱导物是异乳糖是异乳糖v异乳糖是半乳糖苷酶异乳糖是半乳糖苷酶反应的中间产物反应的中间产物 Gal(16)Glu诱导物（诱导物（Inducer）v乳糖作是天然的诱导物将聚合酶从乳糖作是天然的诱导物将聚合酶从启动子启动子Plac 上释放上释放v实验室常用的一个诱导物是合成的实验室常用的一个诱导物是合成的异丙基硫代半乳糖异丙基硫代半乳糖IPTG （isopropylthiogalactoside ），因），因为不被半乳糖苷酶分解，在实验中为不被半乳糖苷酶分解，在实验中的浓度可以保持恒定的浓度可以保持恒定vIPTG可以迅速诱导可以迅速诱导la

50、c操纵子结构操纵子结构基因的转录基因的转录 v很多载体上克隆基因的表达是被设很多载体上克隆基因的表达是被设计成用计成用IPTG 诱导诱导LacZ启动子的转启动子的转录。如录。如 pUC19（以后再详细介绍）（以后再详细介绍）突变分析突变分析v下降突变（下降突变（down mutant）v上升突变（上升突变（up mutant） vi-、is、Ocvi和和O造成的突变，乳糖（或诱导物造成的突变，乳糖（或诱导物IPTG）浓度可以调节）浓度可以调节v诱导物不能调节的突变，对诱导物不能调节的突变，对lacI-的解释只的解释只能用启动子能用启动子阻遏蛋白的负调控阻遏蛋白的负调控v基因在其自身的启动子基因