《生物技术概论 》(研究生)全册配套完整课件.ppt（843页）

1、生物技术概论生物技术概论 (研究生研究生)全册配套完整课件全册配套完整课件生物技术概论课程安排生物技术绪论生物技术绪论 重组重组DNA技术与基因工程技术与基因工程细胞工程与组织工程细胞工程与组织工程蛋白质和酶工程蛋白质和酶工程微生物发酵和分离纯化工程微生物发酵和分离纯化工程合成生物学合成生物学转基因技术转基因技术PCR及各种基因扩增技术及各种基因扩增技术*生物芯片技术生物芯片技术*高通量基因测序技术高通量基因测序技术*蛋白质组学和代谢组学技术蛋白质组学和代谢组学技术生物技术应用生物技术应用 农业、人类健康、食品、环境 能源、司法考古等*也是今天的讲课的主要提纲也是今天的讲课的主要提纲课程目标：

2、课程目标：1 广义的最新的生物技术广义的最新的生物技术2 对今后科研有所帮助对今后科研有所帮助3 为了今后造福人类为了今后造福人类4 不断学习生物新技术不断学习生物新技术什么是生物技术？什么是生物技术？ 生物技术生物技术（biotechnology）,有时也称生物工程生物工程（bioengineering）,是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品所需产品或达到某种目的或达到某种目的。生物技术是人们利用微生物、动植物体对物质原料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。 现代生物技术综合生物化学、遗

3、传学、细胞生物学、胚胎学、免疫学、化学、物理学、信息学、计算机等多学科技术，发展到高通量组学（omics）芯片技术、基因组人工设计与合成生物学等技术。绪论绪论 B& B生物学科的三个专业 生物科学生物科学 生物技术生物技术 生物工程生物工程 一段时期，生物技术与生物工程相互代替； 但是在不少高校，生物技术与生物科学相似，生物工程与生物技术隶属不同学科。 我的理解： 科学问题-生物科学 （基础基础） 技术应用应用-生物技术 （广泛） 工程化应用工程化应用-生物工程 （部分）技术发展对科学的推动作用 工欲善其事，必须先利其器， 磨刀不误砍柴工 科学技术是第一生产力 显微镜、基因重组技术、基因测序、

4、PCR单克隆抗体、微生物发酵 生命科学是实验科学，必须掌握各种实验技术： 5个层次，分子，细胞，组织，个体，群体 生物技术对人类社会的作用古老， 不知不觉在应用： 发酵，种植，养殖，驯化基因工程：新的标志， 企业化生产 医药（药和诊断），农业（新品种），食品，环境，能源PCR技术： 拓展和加速发展其应用生物信息学：软技术各个学科综合 生物技术产品在我们身边 生物技术药物：胰岛素，EPO ，干扰素等 转基因农产品：转基因番茄，转基因大豆， 转基因棉花等 转基因动物： 一般只处于实验室阶段 基因治疗与细胞治疗 干细胞与组织工程： 生物克隆 体外诊断试剂： 抗体免疫与基因检测 合成生物： 各种产品与

5、物种基因工程基因工程: 生物技术的核心生物技术的核心 基因工程基因工程 微生物发酵工程 细胞工程 蛋白质酶生化工程基因工程 20世纪70年代随着DNA重组技术的出现而发展出来。 对基因进行加工，使生物体发展成为新的有机生物体。 是生物工程四兄弟中发展最迅速，威力最大的一个。 基因工程原理示意图基因工程的表达系统基因工程的表达系统 原核细胞：大肠杆菌 真核细胞：酵母细胞、 昆虫(家蚕),哺乳动物细胞 生物反应器：转基因植物 (分子农场)、转基因动物 （乳腺生物反应器） 基因是生物医药产业的源头基因是生物医药产业的源头基因基因 基因诊断基因诊断基因治疗基因治疗反义反义RNARNA免疫学诊断免疫学诊

6、断基因工程药物基因工程药物化学合成药物设化学合成药物设计的靶分子计的靶分子DNADNA疫苗疫苗或核酶等或核酶等基因工程疫苗基因工程疫苗 安全无毒： 无灭能不彻底，泄漏，回复，病原体蛋白毒副作用等。 可以大量生产； 不受来源限制 多价疫苗： 同时免疫多种传染病 成本低廉，易于推广 不足：不能完全模仿天然疫苗。 蛋白制备纯化和保纯仍然复杂 基因工程乙肝疫苗 人类历史上第一种规模化生产、最为成功基因工程疫苗，95年的全球销售额突破10亿美元；美国1986年正式投放市场。全世界乙肝病毒携带者78生活在亚洲国家，约有一半是中国人种，乙肝疫苗的年需求量约7000万支，并呈上升趋势。2000年底在中国基因乙

7、肝疫苗全部取代血源乙肝疫苗复旦大学获得世界上第一张复旦大学获得世界上第一张O型口蹄疫基因工程疫苗证书！型口蹄疫基因工程疫苗证书！基因工程药物 天然基因: 如促进血细胞生长因子 基因衍生物: 如肿瘤坏死因子 天然重组和融合: 导向性干扰素 人工筛选和合成: 如小肽分子 基因工程疫苗: 如乙肝疫苗 基因药物的优势IL-2, 胰岛素，胰岛素，GLP-1，EPO, IFN，EGF基因工程肿瘤坏死因子基因工程肿瘤坏死因子单克隆抗体单克隆抗体 单克隆抗体的导向治疗: 生物导弹 化学药物, 毒素和放射性核数作弹头和单克隆抗体(瞄准器)偶联, 制成生物导弹. 第一代单克隆抗体: 鼠源 基因工程抗体: 抗体的人

8、源化 完全人化的单克隆抗体 美国批准了美国批准了10多种单克隆抗体临床上市多种单克隆抗体临床上市 !进化论在现代科技中应用进化论在现代科技中应用-模仿进化模仿进化 地球上几十亿年的勃勃生机充分展示了进化的无所不能，研究人员从进化中借经验，利用定向进化来增强蛋白的有用功能。通过诱导基因发生突变，产生相应蛋白，筛选其功能改变蛋白，从中选取表现最好的基因进行新一轮的突变和检测，如此循环上百万次。 首先，找出用于进化的基因模板池，其次，了解特定基因如何进化。可以改变蛋白上的某个氨基酸，具体位置可以从整条氨基酸链上随机抽取，也可以在某些特定区域内随机选择，甚至可以选定已知的、对蛋白功能很重要的某个特定位

9、点。编码蛋白的基因在结构上由一段段独立片断组成，我们可以调换它们的顺序，创造出具有新功能的蛋白。我们还可以在一个由系统进化方法确定的基因家族中，或者从姐妹物种中，抽取相关基因的结构片段，混合成所谓的“嵌合蛋白”（chimeric protein）。在自然界中，基因片段的重组和重排使蛋白快速进化；如今这一过程在实验室中重现，正在向我们显示它的巨大威力。 人乳头瘤病毒（HPV）疫苗的开发和丙型肝炎疫苗的优化，是定向进化众多成功案例中比较典型的两个。在对20 多种人干扰素中的基因片段进行重排之后，一种超强嵌合蛋白已经问世，它减慢病毒复制的能力比原有人干扰素强25 万倍。经过改良的人类肿瘤抑制蛋白，在

10、实验室研究中已经显示出比原始蛋白更强的肿瘤生长抑制功能。背后的功臣背后的功臣复旦大学与上海医学复旦大学与上海医学遗传所首次报道了凝遗传所首次报道了凝血因子血因子IX转基因牛，转基因牛，引起热议！引起热议！在植物中成功表达的药用蛋白植物的次级代谢药物的基因调控是另外一个方向植物的次级代谢药物的基因调控是另外一个方向“ 病毒病毒”也是幸运的使也是幸运的使者者 基因治疗基因治疗- 新的医药革命新的医药革命1991年，复旦大学等进行了年，复旦大学等进行了世界首次血友病世界首次血友病B基因治疗基因治疗 遗传易感性与药物遗传学遗传易感性与药物遗传学 为什么有些人容易得癌症，高血压，糖尿病？为什么有些人容易

11、得癌症，高血压，糖尿病？ 为什么同样的毛病，同样的治疗，疗效和毒性为什么同样的毛病，同样的治疗，疗效和毒性 千差万别？千差万别？SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 单核苷酸单核苷酸多态性多态性 是人类基因组中最是人类基因组中最常见的基因多态性，是个体常见的基因多态性，是个体差异的最基本因素，是功能差异的最基本因素，是功能基因组学、基因组学、 疾病基因组学、疾病基因组学、药物基因组学和环境基因组药物基因组学和环境基因组学研究重要内容。学研究重要内容。DNA损伤损伤修复途径修复途径肺癌肺癌肺癌易感性肺癌易感性肺癌化疗肺癌化疗吸烟吸烟复旦大学在国际上报道了一批肺

12、癌，肝癌等肿瘤易感基因和复旦大学在国际上报道了一批肺癌，肝癌等肿瘤易感基因和化疗药物敏感基因，对于个性化预防和治疗具有重要价值化疗药物敏感基因，对于个性化预防和治疗具有重要价值ALDH2基因缺陷饮酒脸红饮酒脸红 卫生部临检中心批准 “硝酸甘油治疗急性心绞痛疗效检测方法和试剂盒” 硝酸甘油治疗硝酸甘油治疗心绞痛效果差心绞痛效果差 该成果申请了国际专利 多家临检中心和医院在应用复旦大学首次报道了复旦大学首次报道了ALDH2基因变异导致硝酸甘油治疗心绞痛无效基因变异导致硝酸甘油治疗心绞痛无效环境基因组学环境基因组学 研究物理研究物理, 化学和生物环境对人化学和生物环境对人体基因组的作用及其易感性体基

13、因组的作用及其易感性. 为什么有人抽烟不得肺癌为什么有人抽烟不得肺癌? 而另外而另外一部分人却敏感异常一部分人却敏感异常? * 为什么有些人喝酒海量为什么有些人喝酒海量? 而另外一些而另外一些人一喝酒就醉倒人一喝酒就醉倒? 为什么有人对艾滋病谈笑风生为什么有人对艾滋病谈笑风生, 而一而一部分人却谈虎色变部分人却谈虎色变?基因预测功与过？基因预测功与过？基因预测疾病风险和指导治疗已经在国际上蓬勃开展，其科学性特别是一些公司的经营模式受到质疑？ DPD /5Fu,APOE49797年以来，克隆技术掀起浪潮年以来，克隆技术掀起浪潮胚胎干细胞与治疗性克隆胚胎干细胞与治疗性克隆 造血干细胞 真能干！07

14、年以来，年以来，iPS iPS 最激动人心之技术，长生不老有望！最激动人心之技术，长生不老有望！hfat-1 Transgenic Pigshfat-1 转基因猪富含 -3多不多不饱饱和脂肪酸和脂肪酸，能够预防：，能够预防：癌症, 糖尿病. 冠心病，高血压. 风湿关节炎，骨质疏松.忧郁症, 老年痴呆。基因打靶与生物克隆体细胞基因打靶体细胞基因打靶, 细胞克隆细胞克隆, 制备制备疾病动物模型疾病动物模型; 转基因动物等转基因动物等.无籽西瓜无籽西瓜 无籽西瓜的染色体组成，普通西瓜 2n22 诱变成功的四倍体作母本与二倍体父本杂交，获得三倍体西瓜，在形成生殖细胞时，不能正常减数分裂，所以成为无籽西

15、瓜。转基因抗虫棉转基因抗虫棉CK抗虫CK抗虫抗除草剂大豆，便于运输的西红柿，转基因金色大米， 2010年华中农大两抗虫转基因水稻获得农业部颁发的中国首张安全证书 少打农药，少打农药，少施化肥，少施化肥，抗旱节水，抗旱节水，优质高产，优质高产， 对环境生态长远作用问题对环境生态长远作用问题?编码目的基因表达可能对人体导致的过敏问题编码目的基因表达可能对人体导致的过敏问题? 调查发现，国内目前发对转基因的人数超过了赞成者，反对的呼声一浪高过一浪！克雷文特尔于2010年5月宣布,他们已经创造了一种人工合成的基因组,并且使用基因组表达培养出了第一个具有生命的有机体。打开了”潘多拉” 之盒! 免疫诊断

16、单克隆抗体 临床诊断的天下 疾病的预测疾病的预测 早期早期, 准确诊断准确诊断, 导向诊断导向诊断,指导治疗指导治疗 临床预后临床预后 ELISA， 免疫组化，荧光，化免疫组化，荧光，化学发光，流式细胞仪多种形式学发光，流式细胞仪多种形式单克隆抗体制备技术是诊断领域的革命！也是治疗领域的革命单克隆抗体制备技术是诊断领域的革命！也是治疗领域的革命基因诊断基因诊断 从遗传病到肿瘤 从Southern 到PCR 从组织到外周血 病毒疾病检测显神威 基因芯片的诞生 DNA指纹神奇的神奇的PCR： 1 变成变成 1000万万“扩增 RNA” 的 NASBA 技术引物引物 2逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录

17、酶T7 RNA聚合酶聚合酶逆相逆相 RNA 扩增物扩增物RNase H引物引物 1引物引物 1 1延伸延伸 RNase H 和和引物引物 2 2延伸延伸 RNAT7 RNA 聚合酶聚合酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶逆转录酶“分子灯塔分子灯塔” 杂交杂交AMV-RT (鸟肉瘤病毒逆转录酶): 延伸形成RNA-DNA 杂交链 RNase H: 降解杂交链中的RNAT7-RNA 聚合: 转录形成的RNA转录产物 亲子鉴定-DNA指纹 通过用限制性内切酶消化和与特异的核心探针（VNTR）杂交取得不同大小的DNA片段的多区带图谱，DNA指纹图被认为对某一个体是独特的。 目前的DNA指纹是指不同的STR特异基

18、因组合, 最为常见的是国际通用的15个STR组合。 父亲父亲 母亲母亲 子女子女1 子女子女2 子女子女3未来的基因芯片具有人体特征未来的基因芯片具有人体特征FISH技术是疾病诊断和治疗的重要技术 DNA损伤和突变检测技术 基因芯片基因芯片 -生物芯片的先锋生物芯片的先锋液相芯片液相芯片 利用微球标记和流式细胞仪的特性进行中高通量的各种分子检测，是检验领域中的革命！SPR技术分子互作仪也值得关注！测序技术飞速发展，一日千里！钱永健改造绿色荧光蛋白，钱永健改造绿色荧光蛋白，通过改变其氨基酸排序，造通过改变其氨基酸排序，造出能吸收、发出不同颜色光出能吸收、发出不同颜色光的荧光蛋白，其中包括蓝色、的

19、荧光蛋白，其中包括蓝色、青色和黄色，并让它们发光青色和黄色，并让它们发光更久、更强烈。更久、更强烈。荧光蛋白成为生命科学研究和应用的重要工具生物素与亲和素在生物分子相互作用中，生物素和亲和素的特异性和牢固性特别受到青睐！蛋白质组学检测和分析技术蛋白质组学检测和分析技术蛋白质组学对于疾病机蛋白质组学对于疾病机制诊断和治疗意义巨大制诊断和治疗意义巨大 结构生物学是阐明结构和功能关系的学科结构生物学是阐明结构和功能关系的学科, 技术性很强！计算可发挥更多作用技术性很强！计算可发挥更多作用 对于生物机制阐明和药物开发至关重要！对于生物机制阐明和药物开发至关重要！代谢组学作用日益体现 代谢组学是系统研究

20、生物体内各种代谢物质，尤其是小分子代谢物，新陈代谢是生命的基本特征，代谢组学的核心技术包括： 1 气相色谱质谱联用(GC/MS) 2 液相色谱质谱联用 (LC/MS) 3 核磁共振(NMR) 技术发展日新月异 科研的动力在于探求未知的好奇心 技术发展的动力除此还有利益驱动！ 技术发展日新月异！（SNP，测序，芯片） 目前我们最缺乏掌握高级技术的人员！ 我们的科学家甚至不屑技术，CRO 中国的研究经费大多耗费在试剂，仪器等技术性产品中！ 我们最落后的是仪器，是生物技术产业！ “生物经济”在国民经济中的地位 生物技术催生生物经济，比尔盖茨的预言，中国曾经的首富李锂夫妇；BT& IT 医药医药：从

21、1998 年开始，全球生物制药产业的年销售额连续 10 年增长速度保持在 15% 33%，成为发展最快的高技术产业之一。2007 年基因工程药物的销售额已达到840 亿美元，占整个医药产业销售额的 12%左右，并且这一比重逐年递增。 祝大家中秋节快乐 DNA Recombination and Genetic Engineering朱焕章DNADNA重组重组接合作用接合作用 (conjugation)转化作用转化作用 (transformation)转导作用转导作用 (transduction)转转 座座 (transposition)同源重组同源重组 (homologous recombin

22、ation)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)概念：概念：发生在同源序列间的重组称为同源发生在同源序列间的重组称为同源重组重组(homologous recombination)，又称基本，又称基本重组。是最基本的重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。进行单链或双链片段的交换。 以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组的同源重组为例，了解同源重组机制的机制的Holliday模型。模型。一、同源重组一、同源重组Hollid

23、ay模型中，同源重组主要模型中，同源重组主要4个关键步骤个关键步骤 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐排列整齐一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体中间体通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复，形成两个双链中间体切开并修复，形成两个双链重组体重组体DNA，分别为：，分别为：片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁

24、移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 目目 录录Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶

25、DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体目目 录录二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的另一细胞（细菌）的DNA转移称为转移称为接合作用接合作用(conjugation)。可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor) 质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子分子（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地

26、供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为称为转化作用转化作用 (transformation)。 例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。（三）转导作用（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因转移及基因重组即为重组即为转导作用转导作用(transduction)。噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径

27、(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)例例目目 录录目目 录录三、位点特异重组三、位点特异重组位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生序列的特异位点间发生的整合。的整合。位点特异性重组不依赖于位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性顺序的同源性（虽然亦可有很短的同源序列），而依赖于能与某些（虽然亦可有很短的同源序列），而依赖于能与某些酶相结合的酶相结合的DNA序列的存在序列的存在噬菌体噬菌体DNA的整合的整合噬菌体的整合酶识

28、别噬菌体和宿主染色体的特噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒地识别、整合反转录病毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 噬菌体的整合和切除噬菌体的整合和切除 噬菌体：噬菌体： attP POP、 大肠杆菌：大肠杆菌： attB/ att BOB、 1.整和：整和： BOB、+ POP、 BOP、+ POB、 2.切除：切除： BOP、+ POB、 BOB+ POPIntIHFInt,Xis IHF 通过attP和att

29、B间的相互重组，环状的噬菌体DNA转换为整合的原噬菌体，原噬菌体通过attL和attR间的相互重组而切除的整合作用有两个特点：这种交换是可逆的，原先存在的DNA顺序全部被保存下来，并无丢失；噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的同源序列，重组交换必须通过其中的一个特定的核苷酸。这两个特点也就是位点特异性重组的共同特点 Biological consequences of recombinationInversion system (The FLP-FRT system): The 2-micron circular plasmid often found in yeast encodes a C

30、SSR system that can invert a large segment of plasmid. The inversion changes the orientation of replicative forks within the plasmid and thereby promotes amplification to high copy number.Rep forkRep forkRep forkRep forkFRTFLP Cre重组酶于1981年从P1噬菌体中发现，属于Int酶超基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453）

31、，编码38kDa蛋白质。Cre重组酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个34bp的LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的序列或基因被删除。LoxP由两个13bp的反向重复序列和8bp的中间间隔序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域 Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1 1、如果两个、如果两个LoxPLoxP位点位于一条位点位于一条DNADNA链上，且链上，且方向相同，方向相同，CreCre重组酶能有效切除两个重组酶能有效切除两个Lo

32、xPLoxP位点间位点间的序列；的序列；2 2、如果两个、如果两个LoxPLoxP位点位于一条位点位于一条DNADNA链上，但链上，但方向相反，方向相反，CreCre重组酶能导致两个重组酶能导致两个LoxPLoxP位点间的序位点间的序列倒位；列倒位；3 3、如果两个、如果两个LoxPLoxP位点分别位于两条不同的位点分别位于两条不同的DNADNA链或染色体上，链或染色体上，CreCre酶能介导两条酶能介导两条DNADNA链的交换链的交换或染色体易位。或染色体易位。 FLP-FRTRecombinase: FLPRecombination site: FRTFRT: originalFRTR-R

33、SRecombinase: RRecombination site: RS13-13-8-1313-8-1312-7-12The recombination sites pair in same directionDeletion/ IntegrationInversiona b c da b c dExchange/ TranslocationMutant sites LE/ RE mutationLE mutantRE mutant Spacer Mutationlox511ATAACTTCGTATA GCATACAT TATACGAAGTTATTATTGAAGCATAT CGTATGTA

34、 ATATGCTTCAATAAReactions between mutant sitesLE mutant X RE mutantLE+RE mutant + loxPloxP X lox511lox511 X lox511lox511 X lox512Conditional Targeting ICre recombinase453Cre mediated deletionother recombination system: Flp recombinase, frt sites5-ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT-3 loxP siteCre re

35、combinase: recombinating enzyme of the phage P153Cre mediated inversion453453C31IntC31Int重组特点重组特点 比基于同源重组原理的基因打靶效率高2-3个数量级 比CreCre重组酶介导的位点特异重组酶介导的位点特异整合效率高整合效率高10-10010-100倍倍 比比随机整合随机整合效率高效率高5-105-10倍以倍以上上, ,且且90%90%的整合事件发生在的整合事件发生在假假attPattP位点位点 使外源基因稳定有效的整合使外源基因稳定有效的整合到哺乳细胞基因组上预定位到哺乳细胞基因组上预定位点的策略成

36、为可能，点的策略成为可能，尤其为尤其为在基因治疗上应用奠定了基在基因治疗上应用奠定了基础。础。四、转座重组四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为重排称为转座转座(transposition)。插入序列插入序列(insertion sequences, IS)组成：组成：二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列序列特有的正向重复序列特有的正向重复序列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因 IRTransposase GeneIR发生形式：发生形式：保守性转座保守性转座(con

37、servative transposition)复制性转座复制性转座(duplicative transposition)（一）插入序列转座（一）插入序列转座插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座目目 录录转座子转座子(transposons) 可从一个染色体位可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）转座子转座（二）转座子转座由转座子介导的转座由转座子介导的转座目目 录录

38、第第 二二 节节 重组重组DNA技术技术DNA Recombination Technique 重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传工遗传工程公司，专门应用重组程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造开始建

39、造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成功的克隆了多莉多莉 相关概念相关概念 DNA克隆克隆 工具酶工具酶 目的基因目的基因 基因载体基因载体 基本原理基本原理 重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系本节主要内容本节主要内容克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular

40、 clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）DNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具有自我接合成一具有自我复制能力的复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一D N

41、A 分 子 ， 也 称分 子 ， 也 称 基 因 克 隆 或 重 组基 因 克 隆 或 重 组 D N A (recombinant DNA) 。 生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。（二）工具酶（二）

42、工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺

43、口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在

44、3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是是识别识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其周并在识别位点或其周围切割双链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源饰系统，限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工

45、程技术中常用型）型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGA

46、TCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口同功异源酶同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同尾酶同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，后，产生相同的粘性末端，称为称为同尾酶同尾酶。这两个相同的粘性末端称为。这两个相同的粘性末端称为配配伍未端伍未端(

47、compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A（三）目的基因（三）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因组基因组DNA (genomic DNA)（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩

48、增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。载体的选择标准载体的选择标准 能自主复制；能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容

49、纳较大的外源DNA。1. 1. 质粒质粒 (plasmid)特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息些遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2. 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列3. 粘性质粒粘性质粒(cosmid)酵母人工染色体酵母人工染色体

50、(yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA