生物大分子课件:bio-coures-6.ppt
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- 生物 大分子 课件 bio coures
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1、蛋白质的化学修饰蛋白质的化学修饰用化学修饰的方法研究蛋白质的结构与功能已经成为一种重要的基础手段,蛋白质侧链基团的修饰是通过选择性的试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的,这是蛋白质化学基础研究的一个方向。广义上,凡涉及共价或部分共价键的形成或破坏的转变都可看作是蛋白质的化学修饰,其内容也应当包括质子转移、氢同位素交换、金属螯合、酶底物结合以及氢键合等。狭义上,特指选择性化学修饰。即在较温和的条件下,以可控制的方式使一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应,以引起单个氨基酸残基或其功能基发生共价的化学变化。优点在于:单个修饰的实验条件远较多个修饰易于控制,实验结果也容
2、易解释。侧链基团化学修饰的一个非常重要的作用是用来探测活性部位的结构。反应试剂与蛋白质分子接触并发生化学反应,与蛋白质分子的侧链氨基酸残基共价连接形成某些可探测的报告基团。理想情况下,修饰试剂只是有选择地与某一特定的残基反应,很少或几乎不引起蛋白质分子的构象变化。在此基础上,从该基团的修饰对蛋白质分子的生物活性所造成的影响,就可以推测出被修饰的残基在该蛋白质分子中的功能。在20种构成蛋白质的常见氨基酸中,只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行化学修饰,这些基团的反应性取决于它们的亲核性。很多因素都可以影响亲核性的大小,这些因素对蛋白质的化学修饰反应会造成较大的影响。化学修饰的主要作用化学
3、修饰的主要作用(1)探测酶和蛋白质的必需氨基酸残基的性质和数目。蛋白质的化学修饰可以很快地揭示蛋白质分子中哪些侧链基团是表现酶活性所必需的。这对于目前空间结构尚未搞清楚的蛋白质分子尤为重要。它可以帮助人们初步认识该蛋白质分子中哪些残基能处于活性部位并为其表现功能所必需。这将为空间结构的解析提供重要的信息。(2)用于蛋白质纯度分析与鉴定。(3)用于蛋白质一级序列的测定。如在蛋白质序列分析时,首先必须了解N-末端的残基。多肽链N-末端残基的分析常用的修饰试剂有二硝基氟苯、丹氟酰氯,即二甲基氨基萘磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯(PITC)。PITC也是测定蛋白质序列的Edman降解法的关键试剂。此外
4、,在氨基酸组成分析中的半胱氨酸残基的测定、二硫键的断裂、侧链基团的保护等均采用各种方法的化学修饰。(4)探测蛋白质分子的构象变化和运动性。利用化学修饰试剂的反应,探测某些基因的暴露程度,以分析蛋白质分子的构象变化,如利用5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测定不同去折叠状态的反应巯基数目,可以探测其去折叠的程度,还可以通过监测A412随时间的变化探测去折叠的动力学。(5)利用亲和标记探测活性部位局部区域的构象状态。有些化学试剂可专一性地修饰酶的活性部位的侧链基团,从而在活性部位引入探测基团(如具有荧光性或顺磁性基团),以探明活性部位的构象状态及构象变化。(6)探索蛋白质和酶作用的化学机
5、理。通过化学修饰可以探明哪些侧链基团参与了酶的催化作用,为探明其作用的化学机理和催化历程起了重要的作用,也为药物设计提供了分子基础。(7)利用共价交联技术研究蛋白质分子的拓扑学、构象的运动性以及寡聚蛋白质的亚基结合状态。(8)利用蛋白质晶体的重金属衍生物(也属于一种化学修饰),进行X衍射晶体结构分析。(9)用于蛋白质和酶分子的固定化。在蛋白质和酶分子的固定化技术中,除部分用物理方法固定外,主要的还是采用化学方法的固定化。其本质是蛋白质和酶的化学修饰,其中包括载体偶联法和共价交联法。这类化学修饰希望只修饰非必需基团,设法避免必需基团的破坏,以保持蛋白质和酶的活性。(10)定向改造蛋白质分子的性质
6、。用基因定点突变技术,改变蛋白质主链的化学结构,在蛋白质的肽链结构中删去、替换或增加某些氨基酸残基,以研究其结构与功能的关系,并可定向地进行蛋白质的改造。此外,还可以通过侧链基团的化学修饰,改造蛋白质分子的性质,如使其激活、失活,或使其稳定性提高等。总之蛋白质化学修饰仍然作为一种有效的研究手段广泛地应用于基础性研究和应用研究。化学修饰中的问题化学修饰中的问题化学修饰具有复杂性,其结果解释不易 对一定类型的功能基很少有绝对的特异修饰剂。换言之,被同一种试剂修饰的氨基酸残基,会因其存在的状态不同而出现反应差异。能修饰同类氨基酸的试剂,其本身的反应性也有不同,修饰的结果往往要受不同类型实验的影响。
7、设计能对酶的催化部位、底物的结合部位起作用的修饰剂常常是非常困难的,有时是不可能的。 在了解修饰剂与酶失活的关系上,除应注意其活性部位残基的直接修饰外,还必须考虑修饰过程中引起的酶蛋白位阻的间接影响,分析是否有同酶活性无关的残基起非特异性反应等等。但无论如何,应该记住一个基团的修饰反应所需的特定反应条件暗示了蛋白质分子内的特定的环境。关键问题关键问题设计和筛选出某些使单独一类氨基酸残基或功能基发生有效修饰的特异性试剂,即选择性化学修饰剂(基团选择性试剂)选择性修饰试剂首先必须要能够与某一特定的氨基酸残基的侧链基团发生化学反应,并形成紧密的共价连接。人们已经找到许多不同氨基酸残基侧链基团的特定的
8、修饰试剂并应用到蛋白质的化学修饰的研究中。然而目前这类反应试剂的专一性不够,即使试剂对某一基团的反应是专一性的,也仍然有多个同类残基与之进行反应,使得对某个特定残基的选择性修饰非常困难。解决方法解决方法为了克服这一缺陷,人们开始使用亲和性标记试剂,这些化合物是具有化学反应性的蛋白质分子的底物或配体的类似物。由于结构的相似性,它们对底物或配体的结合部位具有一定的亲和性,因而能够选择性地结合在蛋白质分子的特定部位。另外,由于它们的化学反应性,能够与蛋白质分子共价地结合。这类反应试剂具有饱和性,与底物或天然配体竞争蛋白质分子的结合位点。由于这些试剂对结合部位的亲和性,即高度的位点专一性,因此能否与某
9、一特定的氨基酸残基侧链基团反应已经不是主要问题。亲和性标记试剂中最重要的是光亲和标记和自杀性抑制剂两种类型。光亲和标记试剂的反应可以用光照来引发,因此它们的反应性可以被很好地控制,其参与反应的成分为自由基,可以与它们附近几乎所有的基团反应,这些标记试剂也可以与非极性的侧链基团相结合。自杀性抑制剂作为底物是没有反应活性的,一旦它们转变成产物,就会产生1个可反应基团,因此它们标记的是活性部位附近的侧链基团。由于它们的这种特性,自杀性抑制剂可以被用来作为治疗某些疾病的有效药物。酰化及其相关反应酰化及其相关反应这类化学修饰试剂如乙酰咪唑、二异丙基磷酰氟、酸酐磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯和O-甲基异脲等,它
10、们在室温(2025),pH 4.59.0的条件下可与蛋白质的某些侧链基团发生酰基化反应。被作用的蛋白质分子侧链基团有氨基、羟基、巯基以及酚基等。烷基化反应烷基化反应这类试剂的特点常常是带有活泼的卤素原子,由于卤素原子的电负性,使烷基带有部分正电荷,很容易导致蛋白质分子的亲核基因(例如-NH2,-SH等)发生烷基化。属于这类修饰试剂的有:2,4-二硝基氟苯、碘代乙酸、碘代乙酰胺、苯甲酰卤代物和碘甲烷等。被作用的蛋白质分子的侧链基团有氨基、巯基、羧基、硫醚基和咪唑基等。氧化和还原反应氧化和还原反应这类试剂具有氧化性,能将侧链基团氧化,属于这类试剂的有H2O2,N-溴代琥珀酰亚胺等,有些试剂具有很强
11、的氧化性,往往容易使肽链断裂,因此在修饰反应中要控制好氧化条件。光敏剂存在下的光氧化是一种比较温和的氧化作用。易受氧化作用的侧链基团有巯基、硫醚基、吲哚基、咪唑基以及酚基等。另外还有一类主要作用于二硫键的还原剂。这类修饰试剂有2硫基乙醇、硫基乙酸和二硫苏糖醇(DTT)等。值得提出的是连四硫酸钠或连四硫酸钾(Tetrathionate)是一种温和的氧化剂,因此在化学修饰反应中常用来作为-SH的可逆保护剂。芳香环取代反应芳香环取代反应蛋白质氨基酸残基的酚羟基在3和5位上很容易发生亲电取代的碘化和硝化反应。这类修饰反应的一个典型的例子是四硝基甲烷(TNM,Tetranitro-methane),它可
12、以作用于酪氨酸的酚羟基,形成3-硝基酪氨酸的衍生物。这种产物有特殊的光谱,可用于直接的定量测定。蛋白质肽链的裂解蛋白质肽链的裂解另外还有一些蛋白质与化学试剂的重要反应,如溴化氰裂解,在自发和诱导重排的条件下主要导致肽键的断裂。溴化氰(CNBr)裂解甲硫氨酸残基的羧基侧链肽键的反应机理如下图所示:巯基的化学修饰巯基的化学修饰由于巯基具有很强的亲核性,成为蛋白质分子中最容易反应的侧链基团,因此人们最先研究它的特异性修饰试剂并研究了巯基在酶催化过程中的重要作用以及在一些蛋白质中对维持亚基间相互作用所做的贡献。烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂,特别是碘乙酸和碘乙酰胺。在蛋白质的氨基酸组成分析和测序前
13、,通常要用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化,以防止半胱氨酸的降解,而且羧甲基化的半胱氨酸很容易被氨基酸分析仪所识别。其它一些卤代酸和卤代酰胺如溴代乙酸也被应用来修饰巯基,但反应比碘乙酸和碘乙酰胺要慢。然而,在卤代酸与巯基反应的同时,尽管反应能力比较弱,咪唑基团也会与卤代酸结合,核糖核酸酶中咪唑基团的反应就是一个明显的例子。N-乙基马来酰亚胺是一种有效的巯基修饰试剂。该反应具有较强的专一性并伴随光吸收的变化,可以很容易通过光吸收的变化确定反应的程度。另外,N-取代马来酰亚胺自旋标记物可以作为自旋探针来研究蛋白质分子构象变化的情况,如曾经用来有效地研究了丙酮酸脱氢酶复合体系臂的运动性。5,5-二硫-2-
14、硝基苯甲酸(DTNB),又称为Ellman试剂,目前已成为最常用的巯基修饰试剂。DTNB可以与巯基反应形成二硫键,使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸(TNB),同时释放1个有颜色的TNB阴离子。该阴离子在412 nm具有很强的吸收( =1.36104(molL)-1cm-1,pH =8.0),可以很容易通过光吸收的变化来监测反应的程度。DTNB也可以用来定量检测溶液中硫化氢的含量,只是l mol硫化氢与1 mol DTNB反应将产生2 mol TNB和1 mol硫。由于定点诱变的迅速发展,在目前蛋白质的结构与功能的研究中,特别是半胱氨酸的侧链基团的化学修饰有被定点诱变的方法取代的趋势
15、。 但Ellman试剂仍然是目前最常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂,用以研究巯基改变程度和巯基所处环境的探测。Ellman试剂还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状态以及跟踪构象变化的过程。由于TNB的pKa为4.4,在pH 8.0附近时带负电荷,与处于碱性环境中的巯基很难反应,而在pH较低的情况下,不能再用412nm处的光吸收定量,使得DTNB不适于作为酸性介质条件下的滴定剂或反应探针。为此,使用含有2-二硫砒啶和4-二硫砒啶的试剂来克服,如对称结构的2,2-二硫二砒啶,4,4-二硫二砒啶,6,6-二硫二尼克酸和2,2-二硫对(5-硝基砒啶)。这些巯基试剂作为“双质子状态”亲
16、电子试剂,很容易与由于环境中其它基团造成的高pH条件下解离的巯基或硫醇阴离子反应,与硫蛋白共价联结,并产生光谱效应。上述替代DTNB的试剂中, 2,2-二硫二砒啶(2-PDS)和4,4-二硫二砒啶(4-PDS)用得较为广泛。每修饰1分子巯基,同时释放1分子砒啶硫酮。对于2-PDS释放的2-砒啶硫酮(2-TP)在343nm处有光吸收;而4 -砒啶硫酮(4-TP)在324nm处有光吸收。用4-PDS滴定人肌肌酸激酶的差吸收光谱由于4,4-二硫二砒啶在324nm处无吸收,产生的4-砒啶硫酮在280nm也没有明显的吸收,而试剂与蛋白质侧链巯基的反应又是定量进行的,因此可以不分离未反应试剂而直接滴定蛋白
17、质溶液,并根据324nm处光吸收值来确定不同的修饰程度。样品光路为溶于50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)中的人肌肌酸激酶,酶浓度为12.5mol/L,参照光路为同样的缓冲液。图中的吸收光谱自下而上,其4-PDS与人肌肌酸激酶的分子比分别为0; 0.2; 0.4; 0.8; 1.2; 1.6; 2.4; 2.8; 3.2; 3.6; 4.0; 5.0 巯基的氧化也是一种专一性较高的化学修饰手段。过氧化氢一般用来氧化巯基形成二巯键或在较大量时形成磺酸。在一定的条件下,过氧化氢与蛋白质巯基反应也可以生成次磺酸。有机汞试剂是最早使用的巯基修饰试剂之一,其中最常用的是对氯汞苯甲酸,该化合物
18、溶于水中形成羧基衍生物,与巯基相互作用时在255nm处光吸收具有较大的增强效应。其中2-氯汞-4-硝基苯酚(MNP)与蛋白质分子中的侧链巯基反应很快,并在395nm处产生一负差吸收峰。另外,人们还利用溴代乙胺或氮丙啶将半胱氨酸残基转变成可水解的胰蛋白酶敏感的S-(2-氨基乙基)半胱氨酸残基。氨基的化学修饰氨基的化学修饰非质子化的赖氨酸的-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团。 -氨基的pKa值一般为10,由于微环境的影响,蛋白质分子中也可能存在低pKa值的赖氨酸残基,这些残基具有更强的可反应性,因而可以被选择性地修饰。在草酰乙酸脱羧酶中就存在一个pKa值为5.6的可反应赖氨酸残基。有许多化
19、合物都可用来修饰赖氨酸残基,三硝基苯磺酸(TNBS)就是其中非常有效的一种。TNBS与赖氨酸残基反应,在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。有人用TNBS标记了GSH转移酶的1个反应活性很高的赖氨酸残基,证实了在酶的活性部位GSH结合区域存在一个赖氨酸残基,即Lys44。目前,氨基的烷基化已经成为一种重要的赖氨酸修饰方法,这些试剂包括有卤代乙酸、芳基卤和芳族磺酸,或者在氢的供体(如硼氢化钠,硼氢化氰或硼氨)存在的条件下使蛋白质分子与醛或酮反应,称为还原性烷基化。赖氨酸残基的还原性烷基化所使用的羰基化合物取代基的大小对修饰的结果具有很大的影响。在硼氢化钠的存在下,用不同的羰基试剂使卵类粘
20、蛋白、溶菌酶、卵转铁蛋白的赖氨酸残基烷基化,修饰程度为40100。其中丙酮、环戊酮、环己酮和苯甲醛为单取代,而丁醛有2050的双取代,甲醛则几乎为100的双取代。这3种蛋白的甲基化和异丙基化的衍生物仍是可溶性的,并且仍然具有几乎全部的生物活性。近来的研究表明硼氨及其衍生物可以作为还原性烷基化的各种还原剂,其中比较成功的两种结构为二甲硼氨和三甲硼氨。利用氰酸盐使氨基甲氨酰化也是一种常用的修饰赖氨酸残基的手段,这种方法的一个主要的优点是氰酸根离子很小,比较容易接近所要修饰的基团。氰酸盐也能够与半胱氨酸和组氨酸残基反应,形成不稳定的甲氨酰衍生物,也有报道说胰凝乳蛋白酶活性部位的丝氨酸也可被甲氨酰化。
21、维生素B6的天然衍生物磷酸砒哆醛(PLP)是一种非常专一的赖氨酸修饰试剂,可逆反应生成的席夫碱可通过硼氢化钠还原来固定,反应可通过光吸收(还原的磷酸砒哆衍生物的最大吸收位在325nm处)或3H-H2B还原来定量。一个典型的例子是用PLP确定磷酸葡萄糖异构酶的必需赖氨酸残基,并发现该酶的每一个亚基只能特定地结合一个分子的PLP。兔肌磷酸葡萄糖异构酶经5-磷酸砒哆醛和硼氢化钠处理后的吸收光谱氨基的化学修饰在蛋白质序列分析中占了极其重要的地位。在蛋白质序列分析中,首先必须测定整个肽链的N-末端和C-末端残基。用于多肽链N-末端残基的测定的化学修饰方法最常用的有:(1)2,4-二硝基氟苯(DNFB)法
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