生物大分子全册配套完整课件4.ppt

1、生物大分子全册配套完整课件生物大分子全册配套完整课件4生物大分子生物大分子from the point view of material science生物大分子的种类生物大分子的种类蛋白质蛋白质：由氨基酸通过酰胺键（肽键）连接而成 核酸核酸：一种线型多聚核苷酸，核苷酸由碱基、戊糖与磷酸组成 多糖多糖：由单糖分子缩合、失水形成糖苷键连接而成 脂类脂类：简单脂类（不含结合脂肪酸的脂类）；复合脂类（与脂肪酸结合的脂类） 什么是生物材料？什么是生物材料？生物材料(Biomaterials)通常有两种定义： 1. 天然生物材料天然生物材料(Biological Materials)， 也就是由生物过程

2、形成的材料，如结构蛋白（胶原纤维、丝等）、生物矿物（骨、牙、贝壳等）和纤维素。 2. 生物医用材料生物医用材料(Biomedical Materials)，用于取代、修复活体组织的天然或人造材料。 可以预见，随着组织工程的发展，生物医用材料的定义将逐渐增大生物过程形成材料的成分，这样，两种定义将会有越来越多的重叠。 蛋白质的分类蛋白质的分类简单蛋白质：简单蛋白质：仅由氨基酸组成的蛋白质（核糖核酸酶，胰岛素等）结合蛋白质：结合蛋白质：由氨基酸和非氨基酸两部分组成，其非氨基酸部分通常是糖类、脂类、核酸及各种辅助因子等（血红蛋白，核蛋白等）化学结构分子外形的对称程度球状蛋白质：球状蛋白质：分子对称性

3、佳，外形接近球状或椭球状，溶解度较好，能结晶纤维状蛋白质：纤维状蛋白质：分子对称性差，分子类似细棒或纤维；又可再分为可溶性（肌球蛋白、血纤维蛋白原等）和不溶性（胶原、角蛋白、丝素蛋白等）结合蛋白质结合蛋白质糖蛋白：糖蛋白： 由低聚糖（分子量为 5203500 左右）通过共价键与蛋白质连接而成的复合蛋白。 有的蛋白质还与几个带有高电荷的多糖（如硫酸软骨素、肝素和透明质酸）通过共价键或非共价键结合在一起。 脂蛋白：脂蛋白： 脂主要通过非共价键相互作用与蛋白质连接，且脂可大可小。 核蛋白：核蛋白： 蛋白质与核酸（既有 RNA，也有 DNA）紧密相连，其连接在本质上是非共价结合的。 不少蛋白质还需要小

4、分子量的辅助因子来完成其生物功能，这些辅助因子常与蛋白质紧密相连，分离时常常同蛋白质一起被分离出来；它们的连结，既有共价结合，也有非共价结合。 蛋白质的基本结构蛋白质的基本结构蛋白质的基本组成蛋白质的基本组成氨基酸氨基酸组成蛋白质基本结构的有二十种氨基酸（氨基酸） 氨基酸通式 脯氨酸 从 H 向 C方向看过去，氨基、羧基、R 基若沿顺时针方向排列的是 L构型。自然界中存在 D氨基酸，但蛋白质中的所有氨基酸都是 L构型。 氨基酸的分类氨基酸的分类H2NCHCCH3OHOH2NCHCCH2OHOCH2CH2NHCNH2NHH2NCHCCH2OHOCNH2OH2NCHCCH2OHOCOHOH2NCH

5、CCH2OHOCH2COHOH2NCHCCH2OHONNHH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2H2NCHCCH2OHOCH2CNH2OH2NCHCCH2OHOSHH2NCHCCH2OHOCH2SCH3H2NCHCHOHOH2NCHCCHOHOCH3CH3HNCOHOH2NCHCCH2OHOCHCH3CH3H2NCHCCH2OHOH2NCHCCHOHOCH3CH2CH3H2NCHCCH2OHOHNH2NCHCCH2OHOOHH2NCHCCHOHOOHCH3H2NCHCCH2OHOOH侧链性质侧链性质 acidiclargehydrophobicbasicsmallhydrophobi

6、cpolar residuesulphurcontainingalcoholicresidues谷氨酸 Glu天冬氨酸Asp甲硫氨酸Met半胱氨酸Cys组氨酸His精氨酸Arg赖氨酸Lys 天冬酰胺Asn谷酰胺Gln苯丙氨酸Phe亮氨酸Leu色氨酸Trp异亮氨酸Ile酪氨酸Tyr丝氨酸Ser苏氨酸Thr甘氨酸Gly丙氨酸Ala脯氨酸Pro缬氨酸Val被修饰的氨基酸被修饰的氨基酸氨基酸序列氨基酸序列蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构就是氨基酸残基的排列顺序以及二硫键（如果存在）的位置。理论上，每种蛋白质具有唯一而确切的氨基酸顺序。 多肽链组成的蛋白质是有方向的，惯例

7、认为氨基端为多肽链的头，简称N端；相应地，羧基端为尾，简称C端卵清溶菌酶的一级结构蛋白质一级结构的重要性蛋白质一级结构的重要性测定蛋白质中氨基酸顺序的意义：测定蛋白质中氨基酸顺序的意义：氨基酸顺序是决定蛋白质生物活性的分子基础（氨基酸顺序是决定蛋白质生物活性的分子基础（i.e. 酶酶的活性部位及其作用机理的阐明）的活性部位及其作用机理的阐明）从某种意义上，氨基酸顺序将决定蛋白质的二级结构从某种意义上，氨基酸顺序将决定蛋白质的二级结构构象和三级结构；而其与三级结构之间的相互关系构象和三级结构；而其与三级结构之间的相互关系的分析，更揭露了控制多肽链折叠的一些规律的分析，更揭露了控制多肽链折叠的一些

8、规律如果蛋白质具有生理活性的话，氨基酸顺序的异常可如果蛋白质具有生理活性的话，氨基酸顺序的异常可能导致其功能异常和疾病（能导致其功能异常和疾病（i.e.镰刀形贫血症）镰刀形贫血症）氨基酸顺序指明该蛋白质的进化史（进化中的分子事氨基酸顺序指明该蛋白质的进化史（进化中的分子事件）件）蛋白质一级结构的测定方法蛋白质一级结构的测定方法蛋白质均一性的确定：蛋白质均一性的确定：分子量、荷电性、氨基酸组成、氨端分子量、荷电性、氨基酸组成、氨端和羧端残基、生物活性、结晶性等和羧端残基、生物活性、结晶性等氨基酸顺序测定程序：氨基酸顺序测定程序： 蛋白质或肽链的氨基酸定量分析（有时也包括其他化蛋白质或肽链的氨基酸

9、定量分析（有时也包括其他化学组成，如糖、核酸等的分析）学组成，如糖、核酸等的分析） 肽链末端残基，包括肽链末端残基，包括N端基与端基与C端基残基的测定端基残基的测定 肽链的专一性降解与碎片的分离纯化肽链的专一性降解与碎片的分离纯化 分别测定肽链与碎片的氨基酸顺序分别测定肽链与碎片的氨基酸顺序从已知肽的顺序，根据有交盖重叠顺序的碎片相联的从已知肽的顺序，根据有交盖重叠顺序的碎片相联的原则，复现肽链或蛋白质的一级结构原则，复现肽链或蛋白质的一级结构 确定分子中二硫键的位置确定分子中二硫键的位置肽链的降解肽链的降解降降解解方方式式 降降解解专专一一 化化学学降降解解 溴溴化化氢氢 甲甲硫硫氨氨酸酸的

10、的羧羧基基端端（但但对对 Met-Thr 和和 Met-Ser 的的产产率率较较低低，而而对对甲甲硫硫氨氨酸酸的的砜砜和和亚亚砜砜则则完完全全不不降降解解） BNPS甲甲基基吲吲哚哚 色色氨氨酸酸的的羧羧基基端端 稀稀酸酸 天天冬冬氨氨酸酸的的两两侧侧，极极少少作作用用于于天天冬冬酰酰胺胺、谷谷氨氨酸酸、谷谷氨氨酰酰胺胺 甲甲酸酸(70) 最最适适于于天天冬冬氨氨酸酸脯脯氨氨酸酸键键 羟羟胺胺 天天冬冬酰酰胺胺甘甘氨氨酸酸键键 酶酶法法降降解解 胰胰蛋蛋白白酶酶 赖赖氨氨酸酸、精精氨氨酸酸的的羧羧基基端端(赖赖氨氨酸酸脯脯氨氨酸酸，精精氨氨酸酸脯脯氨氨酸酸例例外外，酶酶解解较较少少) 内内肽肽

11、酶酶 Lys-C 赖赖氨氨酸酸(和和 S氨氨乙乙基基半半胱胱氨氨酸酸)的的羧羧端端 内内肽肽酶酶 Arg-C 精精氨氨酸酸的的羧羧基基端端 内内肽肽酶酶 Glu-C 谷谷氨氨酸酸的的羧羧基基端端 内内肽肽酶酶 Asp-N 天天冬冬氨氨酸酸和和氧氧化化蛋蛋白白中中的的氨氨基基末末端端 胰胰凝凝乳乳蛋蛋白白酶酶 最最适适位位点点是是苯苯丙丙氨氨酸酸、色色氨氨酸酸、酪酪氨氨酸酸和和亮亮氨氨酸酸的的羧羧基基端端 嗜嗜热热菌菌蛋蛋白白酶酶 最最适适位位点点是是疏疏水水残残基基(亮亮氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸、苯苯丙丙氨氨酸酸、颉颉氨氨酸酸、甲甲硫硫氨氨酸酸、色色氨氨酸酸)的的羧羧基基端端 肽键和二面角肽

12、键和二面角两个氨基酸连接成的二肽。图中表示了和的定义：代表绕CC单键的转动；代表绕CN单键的转动 肽键具有部分双键性质（0.132nm），不能自由旋转 肽单位是刚性平面结构 在肽单位上，CO 与NH或两个C呈反式排布构象构象蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构蛋白质二级结构：蛋白质二级结构： 多肽链主链骨架中的若干肽段， 各自延着某多肽链主链骨架中的若干肽段， 各自延着某个轴盘旋或折叠， 并主要以氢键维系。个轴盘旋或折叠， 并主要以氢键维系。 其涉及按主链相互接近其涉及按主链相互接近的氨基酸残基的空间关系，而不涉及氨基酸残基的侧链构象的氨基酸残基的空间关系，而不涉及氨基酸残基的侧链构象 螺旋螺旋

13、( -helix)：棒状结构。蛋白质中发现的均为右手型螺棒状结构。蛋白质中发现的均为右手型螺旋旋 折叠折叠 ( -sheet)： 片状物。 相邻的两条链可以是走向相同 （平片状物。 相邻的两条链可以是走向相同 （平行），也可相反（反平行）行），也可相反（反平行） 转折转折 ( -turn)：可使多肽链扭转走向可使多肽链扭转走向 无规线团无规线团 (random coil)：没有规则的那部分肽链构象没有规则的那部分肽链构象 螺旋螺旋helix 的具体参数的具体参数 折叠折叠平行和反平行平行和反平行 折叠折叠Hydrogen bond patterns in beta sheets. Here a

14、 four-stranded sheet is drawn schematically which contains three anti-parallel and one parallel strand. Hydrogen bonds are indicated with red lines (anti-parallel strands) and green lines (parallel strands) connecting the hydrogen and receptor oxygen. 转折（转折（I型和型和II型）型）Turns are classified into Types

15、 according to the (, ) angles of the two central residues (residue 2 and 3). The main types are Type I and Type II which have mirror images in Types I and II (because the mirror image types require positive (, ) angles the most common residue in these turns is Gly). The Pro residue is very common in

16、 -turns, as it always has the correct angle (-60) and it has one less unsaturated hydrogen donor. Since a -turn has several unsaturated back-bone hydrogen bond donors and acceptors, it is polar, and is usually found near the surface of the protein.A -turn is a short secondary structure, only 4 resid

17、ues in length, which enables the overall structure to have 180 degree turns. Turns are characterized by a hydrogen bond between the CO group of residue n and the NH group of residue n+3. 维持蛋白质分子构象的化学键维持蛋白质分子构象的化学键1. 氢键：氢键：XH Y，XH 为质子供体，Y 为质子受体 2. 疏水键：疏水键：两个非极性基团（疏水基团）为避开水相而群集在一起的作用力 3. 范德华引力（键）：范德华引

18、力（键）：一类静电引力（取向力、诱导力、色散力），与距离六次方成反比，相互吸引，但不碰撞。氢键是一种特殊的范德华引力 4. 离子键：离子键：由于正负离子之间的静电吸引所形成的化学键 5. 配位键：配位键：两个原子之间，由单方面提供共用电子对所形成的共价键 6. 二硫键（桥）：二硫键（桥）：两个硫原子之间的化学键，键能很大（30100 千卡/克分子） 维持构象化学键的形式维持构象化学键的形式蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构蛋白质三级结构：蛋白质三级结构：一条多肽链在二级结构的基础上，由于其顺序上相隔较远的氨基酸残基侧链的相互作用，而进行广泛的盘旋和折叠，从而产生特定的很不规则的球状构象。其不涉及

19、一条多肽链上的原子与另一条多肽链的关系。此定义仅适用于球状蛋白维持蛋白质分子三级结构的化学键主要也是次级键，但二硫键和疏水键的作用大大提高硫氧还蛋白的二、三级结构硫氧还蛋白的二、三级结构The protein thioredoxin (2TRX) contains a five-stranded -sheet comprised of three parallel strands and three antiparallel strands. The entire protein is shown as a cartoon with the -strands (three parallel s

20、trands and three antiparallel strands) colored red and -helices colored yellow.蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构蛋白质四级结构：蛋白质四级结构：各亚单位在寡聚蛋白中的空间排布及亚单位之间的相互作用。不考虑亚单位本身的构象。由相同亚单位构成的四级结构均一四级结构；由不同亚单位构成的四级结构非均一四级结构亚单位（亚单位（Subunit）：）：有些球蛋白含有两条或更多条多肽链，并彼此以非共价键相连，每条肽链有自己的三级结构，此多肽链即为蛋白质分子的亚单位（亚基）寡聚蛋白（寡聚蛋白（Multimeric protein）：）

21、：由亚单位聚集而成的蛋白质分子谷氨酸脱氢酶的四级结构谷氨酸脱氢酶的四级结构分子量为313 , 000的六聚体（相同的亚单位）蛋白质的变性和复性蛋白质的变性和复性牛胰核糖核酸酶(Rnase)的复性，活性恢复95以上蛋白质（多肽）的合成蛋白质（多肽）的合成蛋白质的合成化学合成生物合成由不同氨基酸按一定顺序的控制合成蛋白质（多肽）的化学合成由一种或几种氨基酸聚合或共聚合液相合成法：液相合成法：在有机溶剂中进行的均相反应固相合成法：固相合成法：以不溶性高聚物为载体，尽可能以统一的自动化方法在短时间内合成意义和基本步骤意义和基本步骤 多肽的全合成可验证新的多肽结构设计新的多肽，用于研究结构和功能的关系

22、为多肽生物合成反应机理提供重要信息 建立模型酶 合成新的多肽药物 氨基、羧基和侧链基团的保护 羧基的活化和形成酰胺键的缩合反应 重复上述反应以形成更多的酰胺键 脱除保护基团，得到最终产物目标多肽氨基酸之间反应的复杂性氨基酸之间反应的复杂性DCC：N,N-二环己基碳二亚胺（N,N-dicyclohexylcarbodiimide）对暂时勿需参与反应的活性基团的保护和对参与形成酰胺键的羧基进行活化，是成功合成具有特定氨基酸顺序的多肽的两个基本条件。保护基团的原则保护基团的原则能与被保护基团结合除去时不影响肽链氨基的保护氨基的保护氨基的亲核性很强，其经酰化后，亲核性消失。因此对游离氨基实施酰基化，是

23、保护氨基的基本方法1. 叔丁氧基羰基(tert-butoxycarbonyl group, 简称t-Boc)t-Boc基团可以在温和的酸性条件下被除去，产物容易分离氨基的保护氨基的保护2. 苄氧羰基(carbobenzoxy group, 简称CBz)氨酯结构CBz基在弱酸性条件下比较稳定，在催化氢解时可被除去，产物也容易分离注意CBz的除去条件与t-Boc的不同!常用的氨基保护基团常用的氨基保护基团保护基保护基缩写名称缩写名称在以下条件稳定在以下条件稳定除去条件除去条件t-BocH2/Pd 或碱或碱HBr+CH3COOH 或或CF3COOHCBzCF3COOH 或碱或碱HBr+CH3COOH

24、或或 H2/PdBPoc碱碱CH3COOH+HCOOH,CF3COOH 或或 HBrNa-NH3, H2/Pd, HCl或或 HBr+CH3COOHNH2NH2-H2O常用的氨基保护基团常用的氨基保护基团保护基保护基缩写名称缩写名称在以下条件稳定在以下条件稳定除去条件除去条件TosylHBr+CH3COOH 或碱或碱Na-NH3Trityl碱碱H2/Pd 或或CH3COOH(80%)H2/Pd 或或 Na-NH3NH2NH2+醇醇+酸酸温和碱性条件温和碱性条件羧基的保护羧基的保护氨基酸中的羧基一般是以成盐（钾盐、钠盐、三乙胺盐等，临时性）或成酯的方式被保护。氨基酸甲酯和乙酯是将氨基酸与甲醇或乙

25、醇在盐酸存在下反应制得。氨基酸苯甲醇酯（benzyl ester, 苄酯）：先生成氯亚硫酸酯羧基的保护羧基的保护叔丁醇酯（t-butyl ester）的制备一般采用酯交换法保保护护基基缩缩写写名名称称在在以以下下条条件件稳稳定定除除去去条条件件BzlCF3COOHH2/Pd或或碱碱（有有副副反反应应）t-BuH2/PdCF3COOHH2/Pd或或酸酸NH2NH2-H2O或或碱碱（有有副副反反应应，易易消消旋旋和和肽肽键键断断裂裂）侧基的保护侧基的保护, -COOH of Glu and AspGlu(OMe)Glu(OBut)Glu(OBzl), Asp(OBzl)-OH of Ser and

26、 ThrSer(Bzl)Ser(But)Thr(Bzl)His的咪唑基：His(CBz), His(Tos, 对甲苯磺酸基)保护至最后-NH2 of Lys：Tos；在Na-NH3中除去，在催化氢化或HBr/HAc除-NH2的保护基CBz时不受影响-SH of Cys：Bzl (Na-NH3中除去); MBzl(对甲氧苄基，HF、0C、30min除去); Trt(三苯甲基) 羧基的活化羧基的活化正常条件下，氨基酸的羧基和氨基之间不会自发形成肽键，故两者必须有一转变为更活泼的形式。由于活化氨基的反应激烈，且常常产生消旋化，通常将羧基活化。其共同的驱动力为碳原子亲电性的加强：由于活化取代基X的负诱

27、导效应，被活化基团中原来的低电子密度进一步降低，形成的亲电中心允许亲核的非离子化氨基对它进行攻击。合成肽的常规方法是从C端向N端进行肽键的形成肽键的形成1. 羧基活化法酰氯法实际中很少应用，因为容易引起氨基酸消旋化酸酐法由于有两个亲电中心，形成肽键时有等量的副产物解决方法：仍有氨基酸消旋化的问题酰基叠氮法优点是不易引起氨基酸的消旋化缺点是？酰基叠氮在使用和储存时易分解，但可进一步将其变为活性酯活性酯法另一种重要的活性酯活性酯与氨基反应形成的酰胺键偶联剂和肽键的形成偶联剂和肽键的形成偶联剂：偶联剂：一种能帮助羧基和氨基之间脱水和缩合的试剂碳二亚胺(carbodiimides)：一类偶联剂的总称，

28、结构通式为分子的中心碳原子具有亲电性，容易受亲核试剂进攻，因而碳二亚胺可与各种弱酸加成类似酸酐结构类似酸酐结构碳二亚胺与羧基反应，形成不稳定的类酸酐中间产物，可进一步发生三种类型的反应碳二亚胺与羧基反应，形成不稳定的类酸酐中间产物，可进一步发生三种类型的反应由第二分子酸由第二分子酸进攻形成酸酐进攻形成酸酐（脲）与胺直接反应形成酰胺键与胺直接反应形成酰胺键最常用的是N,N-二环己基碳二亚胺(DCC):DCC作为偶联剂合成作为偶联剂合成二肽的反应过程二肽的反应过程在温和反应条件在温和反应条件(0 C)下，第二分子氨基酸（羧基已被保护）与下，第二分子氨基酸（羧基已被保护）与DCC不发生作用，但不发生

29、作用，但可以与类酸酐中间产物反应，生成肽键。可以与类酸酐中间产物反应，生成肽键。DCU不溶于大多数有机溶剂，易与多肽产物不溶于大多数有机溶剂，易与多肽产物分离。分离。Woodward试剂：本身是一种脱水剂。先在碱的作用下开环，形成一类似于碳二亚胺的活性碳原子：Woodward 试剂的应用范围比DCC小。优点是方法简便，产率高；缺点是容易产生消旋化。多肽合成的策略多肽合成的策略 肽肽链链逐逐渐渐增增加加法法 片片段段组组合合法法 g-h a-b c-d e-f g-h f-g-h a-b-c-d e-f-g-h e-f-g-h, , a-b-c-d-e-f-g-h a-b-c-d-e-f-g-h

30、 产产率率： 7（81） （8 为多肽中氨基酸残基数； 为偶联反应的平均产率） 3（log28） 保保护护基基团团去去除除 每加入一个新氨基酸残基前须除去一个氨基保护基 两个肽段缩合前，须除去一个肽段的氨基和另一肽段的羧基保护基 消消旋旋化化 可能性较小，可用各种偶联剂 可能性较大，必须选择 DCC 等不易引起消旋化的偶联剂 对对偶偶联联反反应应的的要要求求 每一步偶联反应较易进行，但要求高产率 片段多肽之间偶联较难进行，但对每一步反应产率要求不高 对合成相对分子质量不大的多肽，两种方法均可采用；而若合成相对分子质量大的多肽，一般采用片段组合法：合成含有32个氨基酸残基的多肽，若要求总产率为3

31、0%，对于片段组合法和逐步增长法，其每一步的产率分别要求为78%和96%左右。多肽固相合成法多肽固相合成法Merrifield合成法：合成法：所要合成的目标多肽的C端氨基酸的羧基（氨基被保护）以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连；脱除氨基保护基后，以此氨基酸的氨基为多肽合成的起点，同其它氨基酸（氨基被保护）已活化的羧基作用形成肽键。不断重复此过程，即可得目标多肽产物。优点反应时间短易实现自动化蛋白质自动合成仪无需溶解（选择溶剂）和精制中间体缺点适合于合成1520肽；当合成肽较大时，纯度不高。常选择PS为载体，在树脂的苯基上引入氯甲基，将目标多肽的C端羧基与苄氯作用形成苄酯，第二个氨基酸的氨

32、基用叔丁氧羰基保护后，以DCC为缩合剂而形成肽键。重复此程序。合成的最后一步，是将树脂悬浮在无水三氟乙酸中，通入干燥HBr，即可将多肽从树脂上解脱，同时残存的保护基也被去掉。多肽固相合成和液相合成的比较多肽固相合成和液相合成的比较羧基递增方式羧基递增方式：把氨基酸N端的氨基以共价键连于固相载体，活化其羧基与下一个氨基酸的氨基缩合。将侧链功能基团连于固相载体：将侧链功能基团连于固相载体：i.e.二硝基苯为桥将组氨酸的咪唑基连于固相载体。此法既可以双向伸长肽链，又有利于肽的环化（二硫键的生成），同时也可在温和条件下从载体上裂下肽段。组合合成法合成多肽组合合成法合成多肽组合合成法：组合合成法：由于多

33、肽及蛋白质在生命过程中的特殊作用，特别是在药物化学和分子生物学等领域的研究中，需要获得大量的不同结构的多肽，以便进行结构与活性关系研究和生物活性的筛选。因此，合成单一产物的传统合成方法已经不能满足要求。近十年来，化学家们在多肽固相合成法基础上，发展成一种新的多肤组合合成法建立肽库。组合合成法合成多肽主要有两条途径：并行合成法并行合成法(parallel synthesis)和均分合成法均分合成法(split synthesis)。前者合成速度较慢，合成容量小，现在已经很少应用。均分合成法的基本原理基本原理是：每一个合成步骤分别合成出x组中间体，混合均匀后再平均分成x份，分别延长一个结构单元。反

34、应产物再混合均分成x份，再延长一个结构单元，直至完成全部合成。合成目标：合成目标：C-端为Ala，其他三个氨基酸组成为G1u，Phe和Lys的四肽。这种类型的四肽库共有异构体数目应为3327个。近年来，均分法合成多肽的技术发展很快。现在已经可以应用该技术同步合成上百万个多肽分子，并同时进行生物活性筛选。例如应用改进的均分法成功地合成了五肽库。首先将19种氨基酸(由于Cys容易氧化形成交联二硫键，在该合成中未采用)分别连接在树脂上，得到19个树脂-氨基酸。将其混合均匀并脱除保护基后，均分成19份，分别与19种氨基酸(氨基和侧链必须保护)进行缩合反应，可以得到1919=361个树脂-二肽。重复上述

35、步骤三次(混合、脱保护基、均分和与19种氨基酸缩合)，即可合成出195=2,476,099个树脂-五肽。在脱除保护基后，多肽不必从树脂上分离，即可直接进行生物活性筛选与受体分子反应。其中与受体分子作用的树脂-多肽能够形成显色络合物，可以在显微镜下将它们分检出来。由于此法可以保证在同一个树脂株上合成的多肽是完全相同的，因此，筛选出来的树脂-多肽，用8mo1/L的盐酸胍将多肽与树脂分离后，可用微量多肽测序仪测出该肽的氨基酸顺序。这样，我们就能够从上百万个多肽异构体中，快速筛选出有希望的多肽。组合合成法与传统的合成方法相比较，最大的特点是可同时制备大量不同结构的多肽异构体，而且简化了百分之八十以上的

36、操作步骤，是一个高效率低成本的理想合成法。蛋白质的分离和提纯蛋白质的分离和提纯蛋白质分离提纯的一般原则蛋白质分离提纯的一般原则蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的基础和起点。蛋白质在组织或细胞中通常都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。目前为止，还没有一个单独的方法能把任何的一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序以获得高纯度的制品。蛋白质提蛋白质提纯的总目标是增加制品纯度或比活性。纯的总目标是增加制品纯度或比活性。为了成功地分离和纯化一种蛋白质，需要有一个根据背景知识和下述准则建立起来的合适策略 什么是最好的来源

37、？需考虑来源是否方便得到和来源的量，以及所需蛋白质是否丰富等。过去在实验室中常从动物的肝脏中得到大量的蛋白质；现在，大多数生化学家则是采用培养的细胞如细菌、酵母或哺乳动物细胞。目前，利用基因克隆的长处，所需的蛋白质可以通过表达来大量得到，从而使纯化方法更具有意义。 关于蛋白质我们已知什么？如果一个蛋白质过去已从不同的来源纯化得到，它的很多信息可应用到新来源的蛋白质。例如：分子的大小、定位、等电点、疏水性及翻译后的修饰等，应该保持相同。如果蛋白质是一个酶或受体，则根据该蛋白质与底物或配体的关系可以制定出一个成功的纯化策略。 蛋白质需要有多纯？蛋白质纯化的程度通常取决于它最后的用途。如果蛋白质是供

38、研究用的，则它应该是非常纯的，如果蛋白质是用于工业的，部分纯化就足够了。 纯化蛋白的量要多少?对于活性研究用的，只需要比较少量的活性蛋白质；而对于进行结构研究用的蛋白质来说，则需要比较大量的高纯度蛋白质。 蛋白质应该如何进行鉴定?在蛋白质纯化过程中，为了进行蛋白质的追踪，必须有一个快速、重复性好而且灵敏的鉴定方法。此鉴定方法还应该是经济的，能在小体积下进行操作，而且不要求采用昂贵的仪器。 纯化时间应该多长?纯化步骤应该很快，以减少蛋白质活力的丧失和蛋白质降解等。一般来说蛋白质的量在纯化过程的各步中均会有损失，因此应当尽量减少纯化步骤，以期获得最大的产率。 什么是最终花费?对于商用蛋白质来说费用

39、和时间非常重要。蛋白质分离提纯的一般程序蛋白质分离提纯的一般程序分离提纯某一特定蛋白质的一般程序可分为前处理、粗分级和细分级三步：前处理：前处理：分离提纯蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不至于丢失其生物活性。不同的组织或细胞可用不同的方法破碎；组织或细胞破碎以后，选择适当的介质（一般用低浓度的缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。有时在肌肉组织中抽提时也用稀碱（肌肉中含有乳酸）；在提取膜蛋白或包含在体内的蛋白质时，可加入表面活性剂以增加溶解度。由于在细胞中普遍存在各种蛋白质水解酶，有时需低温操作和加一些相应的蛋白酶抑制剂、螯合剂可防止蛋白质的降

40、解。粗分级：粗分级：当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白质分离开来。一般这类的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。其特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。细分级：细分级：即样品的进一步提纯。一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦电泳等作为后续的提纯步骤。 结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。结晶是蛋白质分离提纯的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯，而重结晶又可除去

41、少量的夹杂蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质的纯度越高、溶液浓度越浓就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，这可以借控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH等方法来达到。蛋白质的分离蛋白质的分离根据蛋白质在溶液中的性质分离蛋白质混合物的方法根据蛋白质在溶液中的性质分离蛋白质混合物的方法根据根据分子大小不同分子大小不同的分离方法的分离方法透析和超过滤：透析和超过滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。常用的半透膜是赛璐玢纸、赛璐啶纸或其它合成以及天

42、然材料。超过滤是利用压力或离心力强行使水和其它小溶质分子通过半透膜。密度梯度（区带）离心：密度梯度（区带）离心：蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，也取决于它的密度。如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到于自身密度相等的介质梯度时，就停滞不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带，并于离心管的底部被收集。凝胶过滤，即凝胶过滤层析：凝胶过滤，即凝胶过滤层析：这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构而被排阻在凝胶珠外，

43、随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离。利用利用溶解度差别溶解度差别的分离方法的分离方法利用蛋白质的溶解度差别来分离各种蛋白质是实践中最常用的方法。影响蛋白质溶解度的因素很多，但在同一的特定外界条件下，不同蛋白质应具有不同的溶解度，因为溶解度归根结底取决于蛋白质本身的分子结构。适当地改变外界因素，就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度。等电点沉淀和等电点沉淀和pH控制：控制：蛋白质是带有正电荷和负电荷的两性电解质，带电基团的电荷数量则因pH的不同而变化。当蛋白质处于等电点pH时，蛋

44、白质的净电荷为零，以至于蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于集聚、沉淀，因此其溶解度达到最低点，由此可将蛋白质混合物彼此分开。如此沉淀出来的等电蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。蛋白质的盐溶和盐析：蛋白质的盐溶和盐析：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。低浓度时，中性盐可增加蛋白质的溶解度盐溶，其机理为蛋白质分子吸附某种盐离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子间的相互作用却增强。当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度开始下降，离子强度足够高时，很多蛋白质可从水溶液中沉淀出来盐析。主要是大量的中性盐的加入，使水的活度降低，原来的大部分自由

45、水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。有机溶剂分级法：有机溶剂分级法：与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若将溶剂冷却到40C60C，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂以防局部浓度过高，变性问题可在很大程度上得以解决。在一定温度、pH和离子强度下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度会有差别，由此控制有机溶剂浓度也可以分离蛋白质。有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因有二，一是改变了介质的介电常数，即导致了两个相反电荷之间吸引力的变化；二是与蛋白质争夺水化

46、水（同盐析现象类似），促使蛋白质集聚并沉淀。温度对蛋白质溶解度的影响：温度对蛋白质溶解度的影响：在一定的温度范围内（约040C之间），大部分球状蛋白的溶解度随温度的升高而增加，但也有例外。在4050C以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解能力。根据携带根据携带电荷不同电荷不同的分离方法的分离方法根据蛋白质的电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物的方法通常有两种电泳：电泳：在外电场的作用下，带电颗粒，如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象被称为电泳或离子泳；或者说，电泳是在外电场存在下，利用分子携带的净电荷不同分离分子混合物的一种实验

47、技术。带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。离子交换层析：离子交换层析：这是一种用离子交换树脂（在蛋白质和核酸的分离中，常用离子交换纤维素和离子交换交联葡聚糖作为支持介质）作为支持剂的层析法。阴离子交换树脂含有碱性基团，可解离出OH，能和溶液中的阴离子发生交换而使之结合在树脂上。在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力取决于彼此间相反电荷基团的静电吸引，而后者又于溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋白质的电离程度。蛋白质混合物的的分离可以由改变溶液中的盐离子强度和pH来完成，对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先由层析柱中洗脱出来。蛋白质的选择吸附分离

48、蛋白质的选择吸附分离某些物质，如极性的硅胶和氧化铝以及非极性的活性炭等粉末具有吸附能力，能将其它种类的分子吸附在其粉末颗粒的表面，而吸附力的强弱又随被吸附的物质性质不同而异。吸附层析法就是利用这种吸附力的强弱不同而达到分离的目的。蛋白质分子与各种吸附剂结合的真实性被了解得很少：认为与非极性吸附剂作用可能主要是靠范德华力和疏水相互作用，而与极性吸附剂作用可能是离子吸引和（或）氢键键合。蛋白质提纯中使用最广泛和最有效的吸附剂是结晶磷酸钙Ca10(PO4)6(OH)2。具推测，蛋白质中带负电荷的基团与其的钙离子结合。根据对配基的生物学特异性的分离方法亲和层析根据对配基的生物学特异性的分离方法亲和层析

49、 这是分离蛋白质的一种极为有效的方法，是基于某种蛋白质所具有的生物学特异性，即它与另一种被称为配基的分子能特异而非共价地结合（有别于前面所讨论的各种分离方法，它们都是根据混合物中蛋白质间的化学和物理性质上的差别而达到分离的目的）。基本点为：先把待提纯的某一蛋白质的特异配基，通过适当的化学反应共价地连接到象琼脂糖凝胶一类载体表面的功能基上。当混合样品经过这种多糖材料的层析柱时，待提纯的蛋白质将于其特异的配体结合而吸附在配体的载体琼脂糖颗粒的表面上，而其它的蛋白质，因对此配体不具有特异的结合位点，将通过柱子流出。被特异地结合在柱子上的蛋白质可用自由配体分子溶液洗脱下来。蛋白质的纯度分析蛋白质的纯度

50、分析蛋白质制品的纯度鉴定通常采用分辨率高的物理化学方法，如电泳分析、沉降分析和扩散分析等。如果制品是纯的，在这些分析的图谱上只呈现一个峰或一条带。必须指出，任何单独的一种鉴定只能认为是蛋白质分子均一性的必要条件而不是充分条件。遗传工程产品蛋白质的纯度是一个重要的指标，也是一个相对的指标，纯度要求需根据实际要求而制定。蛋白质的纯度一般指是否含有其它杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内。一些蛋白质在硫酸铵糊中相当安定，一些酶在甘油中保存则很稳定。而在遗传工程产品中据中国生物制品检定所要求，却要考虑这些小分子的存在与否。蛋白质纯度如用百分数表示，有时还和检测、定量方法、所选用仪器的参数