医学微生物学课件：8.细菌的检查方法.ppt

1、细菌学诊断细菌学诊断标本采集和标本采集和送检六原则送检六原则避免杂菌污染避免杂菌污染不同期不同标本不同期不同标本用抗生素以前用抗生素以前采集病变明显部位采集病变明显部位标本作好标记标本作好标记标本必须新鲜标本必须新鲜4显微镜放大法：显微镜放大法： 普通光学显微镜普通光学显微镜 ：0.25um 0.25mm 电子显微镜：透射电镜、扫描电镜电子显微镜：透射电镜、扫描电镜4染色法染色法病原菌检测病原菌检测细菌形态与结构检查结晶紫结晶紫1min1min卢戈碘卢戈碘 1min1min95%95%乙乙醇醇30s30s稀释复稀释复红红 30s30s 的意义的意义1.1.将细菌区分为将细菌区分为2 2大类大类

2、2.2.指导选择抗菌药物指导选择抗菌药物3.3.用于细菌致病性等方面的研究用于细菌致病性等方面的研究 直接涂片镜检直接涂片镜检 形态和染色性具有特征的致病菌，直接涂片形态和染色性具有特征的致病菌，直接涂片染色后镜检有助初步诊断。染色后镜检有助初步诊断。 痰液痰液 抗酸性细长杆菌抗酸性细长杆菌 结核杆菌结核杆菌 脑脊液脑脊液 淤血点淤血点 肾形肾形,G-,G-双球菌双球菌 脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌 脓液脓液 G+G+葡萄串状球菌葡萄串状球菌 葡萄球菌葡萄球菌 病原菌检测病原菌检测 分离培养和鉴定分离培养和鉴定 确诊细菌感染性疾病最可靠的方法确诊细菌感染性疾病最可靠的方法（金标准（金标准),有助于

3、选用抗菌药物及评有助于选用抗菌药物及评价疗效。价疗效。 普通培养法（需氧培养法）普通培养法（需氧培养法） 高渗培养法高渗培养法 厌氧培养法厌氧培养法病原菌检测病原菌检测临床标本预处理增 菌接种培养基，分离单个菌落各种鉴定试验涂片染色快速诊断试验生化试验血清学实验涂片染色药敏试验动物试验初步诊断报告最终诊断报告一般检验程序一般检验程序 病原学诊断病原学诊断 分离培养和鉴定分离培养和鉴定 培养特征：培养特征：营养、生长条件、营养、生长条件、 菌落特征菌落特征 形态特征：形态特征：细菌形态、排列、细菌形态、排列、 染色性染色性 生化反应：生化反应：检测细菌对各种基质（糖检测细菌对各种基质（糖类和蛋白

4、质）的代谢作用和代谢产物的差类和蛋白质）的代谢作用和代谢产物的差异，借以区别和鉴定细菌。异，借以区别和鉴定细菌。病原菌检测病原菌检测 生化反应生化反应 如如: :幽门螺杆菌尿素酶分解尿素产氨幽门螺杆菌尿素酶分解尿素产氨, ,使培养液变碱使培养液变碱,pH,pH指示剂变色。指示剂变色。 微量、快速、半自动或自动细菌生微量、快速、半自动或自动细菌生化鉴定和细菌药敏分析系统，使病化鉴定和细菌药敏分析系统，使病原菌检出水平提高，时间缩短。原菌检出水平提高，时间缩短。 病原菌检测病原菌检测 病原菌检测病原菌检测 血清学试验血清学试验 用含已知用含已知特异性抗体特异性抗体的免疫血清，可有效检的免疫血清，可

5、有效检出标本中极微量细菌特异出标本中极微量细菌特异抗原抗原，或与分离培，或与分离培养出的未知纯种细菌进行血清学试验，确定养出的未知纯种细菌进行血清学试验，确定致病菌的种或型。致病菌的种或型。 常用方法有常用方法有玻片凝集试验、酶联免疫吸玻片凝集试验、酶联免疫吸附试验（附试验（ELISAELISA）、协同凝集、乳胶凝）、协同凝集、乳胶凝集、免疫电泳、间接血凝集、免疫电泳、间接血凝等试验。等试验。 病原菌检测病原菌检测 动物试验动物试验利用实验动物可进行病原菌的分离鉴利用实验动物可进行病原菌的分离鉴定，检测细菌毒力等。定，检测细菌毒力等。 常用实验动物有常用实验动物有小鼠小鼠, ,豚鼠和家兔豚鼠和

6、家兔等。等。 接种途径有接种途径有皮内、皮下、腹腔、肌皮内、皮下、腹腔、肌肉、静脉肉、静脉等。等。 病原菌检测病原菌检测 药物敏感试验药物敏感试验 纸片法纸片法 试管稀释法试管稀释法 病原菌检测病原菌检测 其他方法其他方法 分子生物学技术分子生物学技术 核酸杂交技术核酸杂交技术 PCR 生物芯片技术生物芯片技术 4聚合酶链反应是一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，其基本原理如下：加热使双链DNA解开螺旋在退火温度条件下引物同模板杂交4在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物4重复上述变性退火引物延伸过程至25-40个循环。靶序列被扩增上百万倍，4达到体外扩

7、增核酸序列的目的。 PCR技术技术 核酸杂交技术核酸杂交技术 杂交方法是一种分子生物学的标准技杂交方法是一种分子生物学的标准技术，用于检测术，用于检测DNADNA或或RNARNA分子的特定序列分子的特定序列（靶序列）。（靶序列）。 DNADNA或或RNARNA先转移并固定到硝酸纤维先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链素或尼龙膜上，与其互补的单链DNADNA或或RNARNA探针用放射性或非放射性标记。探针用放射性或非放射性标记。 在膜上杂交时，探针通过氢键与其互在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或

8、显色反应检测特异结后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。合的探针。 生物芯片技术生物芯片技术 该技术系指将大量（通常每平方厘米点该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于阵密度高于 400 400 ）探针分子固定于支持物）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。样品分子的数量和序列信息。 血清学诊断血清学诊断 用已知抗原检测病人血清抗体用已知抗原检测病人血清抗体直接凝集试验直接凝集试验补体结合试验补体结合试验 中和试验中和试验 乳胶凝集乳胶凝集 ELISA