生物化学与分子生物学课件：血清清、球蛋白分离(录像）.ppt

1、南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定生物化学与分子生物学实验教学中心2内 容实验目的实验目的1实验原理实验原理2实验材料实验材料3实验过程实验过程45注意事项注意事项生物化学与分子生物学实验教学中心3实验目的1.掌握掌握盐析法盐析法分离蛋白质的原理和基本方法分离蛋白质的原理和基本方法2.掌握掌握凝胶层析法凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法分离蛋白质的原理和基本方法3.掌握掌握离子交换层析法离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法分离蛋白质的原理和基本方法4.掌握掌握醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法的原理和基本方法5.了解

2、柱层析技术了解柱层析技术生物化学与分子生物学实验教学中心4实验流程盐析法进盐析法进行粗分离行粗分离DEAEDEAE纤维素离纤维素离子交换层析子交换层析醋酸纤维素醋酸纤维素薄膜电泳薄膜电泳葡聚糖凝葡聚糖凝胶胶G-25G-25层层析析生物化学与分子生物学实验教学中心5实验原理v蛋白质的蛋白质的分离和纯化分离和纯化是研究蛋白质化学及是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。其生物学功能的重要手段。v不同蛋白质的不同蛋白质的分子量分子量、溶解度溶解度及及等电点等电点等等都有所不同。利用这些性质的差别，可分都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。离纯化各种蛋白质。生物化学与分子生物学实验教

3、学中心6 蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质常用的纯化方法常用的纯化方法分子质量分子质量透析、超滤透析、超滤凝胶层析凝胶层析离心离心溶解度溶解度调整调整pH调整离子强度调整离子强度降低介电常数降低介电常数电荷电荷电泳电泳等电聚焦等电聚焦离子交换层析离子交换层析特异结合部位特异结合部位亲和层析亲和层析其他性质其他性质吸附层析吸附层析液相层析液相层析气相层析气相层析生物化学与分子生物学实验教学中心7球球 蛋蛋 白白 1 2 g g等电点等电点相对分子量相对分子量（104）含量（）含量（）4.886.957675.0620255.0630495.129156.212

4、6.857.315.6301220血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量清蛋白清蛋白 Av在在pH6.5溶液中，清蛋白解离而带负电荷，溶液中，清蛋白解离而带负电荷， 同时同时 1、 2、 -球蛋白也会解离而带负电。球蛋白也会解离而带负电。 v由于清蛋白的等电点、分子量最小所以解离而带的负电荷量最多。由于清蛋白的等电点、分子量最小所以解离而带的负电荷量最多。vg g-球蛋白的等电点高于球蛋白的等电点高于pH6.5所以解离而带正电荷。所以解离而带正电荷。生物化学与分子生物学实验教学中心8实验材料v样品：样品：人混合血清人混合血清v试剂：试剂：v葡聚糖凝胶葡聚糖

5、凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱层析柱v二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱纤维素离子交换层析柱v饱和硫酸铵溶液饱和硫酸铵溶液v各不同浓度的各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液醋酸铵缓冲溶液v20%磺基水杨酸溶液磺基水杨酸溶液v1%BaCl2溶液溶液vpH8.6巴比妥缓冲溶液巴比妥缓冲溶液v氨基黑氨基黑10B染色液、漂洗液染色液、漂洗液v器材：器材：层析柱、电泳仪、电泳槽等层析柱、电泳仪、电泳槽等生物化学与分子生物学实验教学中心1. 粗提原理-盐析法9v盐析法：盐析法：在蛋白质溶液中在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度，加入无机盐至一定浓度， 或达饱和状

6、态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而 分离出来。分离出来。v水化膜减弱、消失。水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后，蛋白质溶液中加入中性盐后， 由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白 质分子周围的水化膜减弱乃至消失。质分子周围的水化膜减弱乃至消失。v蛋白质表面的电荷大量被中和。蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白中性盐加入蛋白 质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分大量被中和，更加导

7、致蛋白质溶解度降低，蛋白质分 子之间聚集而沉淀。子之间聚集而沉淀。生物化学与分子生物学实验教学中心10粗提-盐析法v由于血清中各种蛋白质分子的由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、颗粒大小、所带电荷的多少所带电荷的多少和和亲水程度亲水程度不同，故盐析不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。所需的盐浓度也不一样。v调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。达到分离的目的。血清清蛋白血清清蛋白球蛋白球蛋白半饱和硫酸铵半饱和硫酸铵清蛋白不沉淀，上清清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸馏水溶解球蛋白沉淀，蒸馏水溶解生物化学与分子生物学实验教学中心112. 脱盐原理-凝

8、胶层析v盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。先脱盐后才能进一步纯化。v脱盐有多种方法，本实验采用脱盐有多种方法，本实验采用凝胶层析法。凝胶层析法。v凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大分子大小的不同小的不同而将其分离的技术。而将其分离的技术。凝胶层析分离示意图凝胶层析分离示意图v蛋白质分子大，无机盐分子小。通过凝胶层析即可将大小不同的物质分离开来。蛋白质分子大，无机盐分子小。通过凝胶层析即可将大小不同的物质分离开来。生物化学与分子生物学实验教学中心133.纯化原理-离子交换层析v离

9、子交换层析离子交换层析是指流动相中的离子和固定是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的的电荷性质电荷性质及及电荷量不同电荷量不同进行分离。进行分离。R-SO3-H+ + Pr+R-SO3-Pr+ + H+阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换R-N+R3OH- + Pr -R-N+R3Pr - + OH-生物化学与分子生物学实验教学中心140.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白清蛋白pI 4.9，带，带负电荷多负电荷多 、 球蛋白球蛋白pI 5.05.2，带带负电荷少负电荷少 、 球蛋白被洗脱球蛋白被洗脱,清蛋白

10、仍被吸附清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE带正电荷清蛋白及清蛋白及 、 球蛋白的球蛋白的pI6.5 ，带，带负电荷负电荷g g球蛋白球蛋白pI 6.5，带带正电荷正电荷清蛋白及清蛋白及 、 球蛋白球蛋白被层析柱吸附被层析柱吸附,g g-球蛋白被洗脱球蛋白被洗脱0.3mol/LNH4Ac pH6.5DEAE带正电荷缓冲液离子强度增加缓冲液离子强度增加清蛋白被洗脱清蛋白被洗脱生物化学与分子生物学实验教学中心164.纯度鉴定-醋酸纤维素薄膜电泳 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在。它们在pH8.6的缓冲液中均解

11、离带负电荷，的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清清蛋白（蛋白（Albumin)、1-球蛋白、球蛋白、2-球蛋白、球蛋白、-球蛋球蛋白、白、-球蛋白球蛋白5条区带。条区带。生物化学与分子生物学实验教学中心17血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果纯度鉴定标准：在膜条上相应位置只出现单一条带纯度鉴定标准：在膜条上相应位置只出现单

12、一条带生物化学与分子生物学实验教学中心18实验过程盐析法进盐析法进行粗分离行粗分离DEAEDEAE纤维素离纤维素离子交换层析子交换层析醋酸纤维素醋酸纤维素薄膜电泳薄膜电泳葡聚糖凝葡聚糖凝胶层析胶层析用用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清缓冲液清洗层析柱内壁洗层析柱内壁,继续用继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液缓冲液(2ml)洗脱，洗脱，流出液量约流出液量约1ml时开始检测蛋白质时开始检测蛋白质取血清取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置混匀室温放置10min，4000r/min离心离心10min沉淀（含

13、球蛋白）加水沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解溶解上清液（含清蛋白、少量上清液（含清蛋白、少量球蛋白和球蛋白和球蛋白）约球蛋白）约0.8ml用用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清缓冲液清洗层析柱内壁洗层析柱内壁,继续用继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液缓冲液(2ml)洗脱，洗脱，流出液量约流出液量约1ml时开始检测蛋白质时开始检测蛋白质凝凝 胶胶 柱柱 层层 析析 除除 盐盐磺基水杨酸磺基水杨酸检测蛋白质检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液收集含有蛋白质的峰液12d继续用继续用2ml 0.02mol/L NH4AC缓缓冲液洗涤冲液洗涤BaCl2检测 至SO42-阴性

14、用用23ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡缓冲液再生平衡过葡聚糖凝胶过葡聚糖凝胶G-25层析柱层析柱（1.07cm）过葡聚糖凝胶过葡聚糖凝胶G-25层析柱层析柱（1.07cm）磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的峰液收集含有蛋白质的峰液12d继续用继续用0.02mol/L NH4AC缓冲液缓冲液洗涤约洗涤约2mlBaCl2检测至SO42-阴性用用23ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡缓冲液再生平衡盐盐析析操作流程操作流程离子交换柱层析纯化离子交换柱层析纯化加样加样加样加样生物化学与分子生物学实验教学中心20样品 加样加样洗内壁洗内壁0.02M 醋酸铵醋酸铵 计算

15、流出量计算流出量洗脱检测洗脱检测凝胶层析脱盐过程凝胶层析脱盐过程生物化学与分子生物学实验教学中心210.02M 醋酸铵醋酸铵 计算流出量磺基水扬酸磺基水扬酸0.02M 醋酸铵醋酸铵 收集收集检测检测 再生平衡再生平衡氯化钡氯化钡0.02M 醋酸铵醋酸铵凝胶层析脱盐过程凝胶层析脱盐过程离子交换柱再生和蛋白纯度鉴定用用1ml 0.0mol/L NH4AC缓冲缓冲液清洗层析柱内壁液清洗层析柱内壁,用约用约mL 0.06mol/L NH4AC缓冲液流洗，缓冲液流洗，除去除去球蛋白和球蛋白和球蛋白球蛋白离 子 交 换 柱 层 纯 化除盐后收集的清蛋白除盐后收集的清蛋白用用1ml 0.02mol/L NH

16、4AC缓冲液清缓冲液清洗层析柱内壁洗层析柱内壁,继续用继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液缓冲液(3ml)洗脱，洗脱，流出液量约流出液量约1ml开始检测蛋白质开始检测蛋白质取浓度最高的取浓度最高的1管作纯度鉴定管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）（醋酸纤维素薄膜电泳法）磺基水杨酸检测蛋白质收集含有蛋白质的洗脱液收集含有蛋白质的洗脱液每管每管10d，连续收集，连续收集3管管DEAE-纤维素柱不用再生，纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白可直接用于纯化清蛋白除盐后收集的球蛋白除盐后收集的球蛋白过过DEAE-纤维素层析柱纤维素层析柱（1.06cm）过过DEAE-纤维素层析柱纤维素

17、层析柱（1.06cm）用用0.3mol/L NH4AC缓冲液缓冲液(约约3ml)洗脱，洗脱，流出液量流出液量约约2ml开始检测蛋白质开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质收集含有清蛋白的洗脱液收集含有清蛋白的洗脱液每管每管10d，连续收集，连续收集2管管DEAE-纤维素柱先用纤维素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4AC溶液流洗，再用溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4AC缓缓冲液流洗再生平衡冲液流洗再生平衡2管均作纯度鉴定管均作纯度鉴定(醋酸纤维素薄膜电泳法醋酸纤维素薄膜电泳法)操作流程操作流程生物化学与分子生物学实验教学中心23注意事项v所用血清

18、应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。v使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。v上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。v洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并并注意层析柱不要流干，进入空气注意层析柱不要流干，进入空气。v切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO42-的的BaCl2混淆，混淆，因二者与相应物质生

19、成的沉淀均为白色。因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。v葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生, ,避免损耗，避免损耗，严禁倒掉严禁倒掉! !生物化学与分子生物学实验教学中心24醋酸纤维素薄膜电泳 1. 点样点样(粗面粗面)8cm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）小组标记小组标记样品标记样品标记生物化学与分子生物学实验教学中心25醋酸纤维素薄膜电泳2. 电泳电泳薄膜薄膜粗面向下粗面向下点样端点样端置阴极端置阴极端两端紧贴在滤纸盐桥上，两端紧贴在滤纸盐桥上，注意：注意：切勿使点样处与电泳槽接触切勿使点样处与电泳槽接触电压：电压：120V时间：时间：50min。生物化学与分

20、子生物学实验教学中心26 3. 染色和漂洗染色和漂洗 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中直接浸于染色液中5min。 取出膜，取出膜，尽量沥净染色液尽量沥净染色液，移入漂洗，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换液中浸洗脱色（一般更换2次），次），至背景颜至背景颜色脱净为止色脱净为止。 取出膜，用滤纸吸干即可。取出膜，用滤纸吸干即可。醋酸纤维素薄膜电泳生物化学与分子生物学实验教学中心27 实验结果-+血清血清清蛋白第清蛋白第1管管清蛋白第清蛋白第2管管-球蛋白管球蛋白管点点样样线线A-12生物化学与分子生物学实验教学中心28思考题v1.硫酸铵盐析一步硫酸铵盐析一步,为什么是为什么是0.8ml血清加血清加0.8ml饱饱和硫酸铵和硫酸铵?v2.为什么实验中为什么实验中DEAE纤维素柱分离纤维素柱分离-球蛋白后不球蛋白后不用再生用再生,可直接用于纯化清蛋白可直接用于纯化清蛋白?v3.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和清清蛋白和-球蛋白的纯度球蛋白的纯度,根据什么来确定它是根据什么来确定它是清蛋白还是清蛋白还是-球蛋白球蛋白?判定它们纯度的依据是什么判定它们纯度的依据是什么?南方医科大学南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心