生物分离工程全册配套完整精品课件.ppt
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1、 生物分离工程 (第二版) 孙彦编著 Bioseparation Process Science Antonio A. Garca et al编著编著 l平时成绩:30分 课堂测验、作业、出勤情况 l期末考试:闭卷考试,70分 l绪论绪论 2 2学时学时 l细胞分离与破碎细胞分离与破碎 2 2学时学时 l初级分离初级分离 2 2学时学时 l膜分离技术膜分离技术 6 6学时学时 l生物产品萃取技术生物产品萃取技术 8 8学时学时 l色层分离技术色层分离技术 1010学时学时 l蛋白质复性蛋白质复性 2 2学时学时 l沉淀与结晶沉淀与结晶 2 2学时学时 重要性重要性 l生物分离过程生物分离过程
2、特点特点 一般步骤一般步骤 l工业生物分离过程工业生物分离过程 典型的生物分离过程典型的生物分离过程 过程的选择依据过程的选择依据 生物分离工程: 从粗原料中获得合乎使用要求的目标产 物的过程,包括目标产物的提取、浓 缩 、分离纯化及成品化等。 多学科的交叉多学科的交叉 多种分离技术的集成多种分离技术的集成 生物工程生物工程 科学研究的科学研究的 (Engineering) 合乎使用合乎使用 最新成果最新成果 要求的产品要求的产品 (Science) (Product) Upstream Technology Downstream Processing Genetic Engineering
3、Bioreaction Engineering Bioseparation Engineering l在基础研究领域, 生物分离技术的发展在某 种程度上决定人类对生命、对自然的认知程度; l在工业生物技术领域,决定了生物产业的成本 和经济效益。 生物工程的基本过程生物工程的基本过程 生产生产生产生产 大多数酶:大多数酶:7070 医用酶如天门冬酰胺酶:医用酶如天门冬酰胺酶:8585 基因工程表达产物:基因工程表达产物:8585一一9090以上以上 青霉素:青霉素:5050 乙醇:乙醇:1414 传统产品传统产品 小分子(少数工业用粗酶)小分子(少数工业用粗酶) 理化性质清楚理化性质清楚 易于放
4、大易于放大 基因产品基因产品 大分子大分子 胞内胞内 不稳定不稳定 放大困难放大困难 生物分离过程的特点生物分离过程的特点 u目标产物含量低目标产物含量低 u待分离物组成复杂待分离物组成复杂 u稳定性差,容易失活稳定性差,容易失活 u对最终产品的质量要求严格对最终产品的质量要求严格 发酵液中:青霉素发酵液中:青霉素 4.2% 庆大霉素庆大霉素 0.2% 动物细胞培养液:动物细胞培养液: 目标物含量目标物含量 5 50 g/ml Back 细胞组成(占干重百分比) 类 型 蛋白质 % 核 酸 % 多 糖 % 类脂物 % 细 菌 40-70 13-34 2-10 10-15 酵 母 40-50 4
5、-10 小于15 1-6 丝状真菌 10-15 1-3 小于10 2-9 藻 类 10-60 1-5 小于15 4-80 动物细胞 小于10 小于50 小于50 小于50 植物细胞 小于70 小于30 小于50 小于80 Back 产物失活的主要机制是化学降解或微生物产物失活的主要机制是化学降解或微生物 引起的降解。引起的降解。 影响因素包括:影响因素包括: pH 温度温度 浓度浓度 蛋白水解酶等蛋白水解酶等 要求:分离条件温和,并采用快速的分离纯化要求:分离条件温和,并采用快速的分离纯化 方法除去影响目标产物稳定性的杂质。方法除去影响目标产物稳定性的杂质。 Back 目前对医药、生物制剂的要
6、求:无菌、无目前对医药、生物制剂的要求:无菌、无 热源,对于蛋白类药物,一般要求杂蛋白含量热源,对于蛋白类药物,一般要求杂蛋白含量 2%。 例如:例如: 对医用青霉素,噻唑蛋白类的含量必须要对医用青霉素,噻唑蛋白类的含量必须要 1.5 10-6; 原亲酶素和重组胰岛素,杂蛋白含量应原亲酶素和重组胰岛素,杂蛋白含量应 0.01%。 对有些产品还要求呈稳定的无色晶体对有些产品还要求呈稳定的无色晶体 u 高效生物分离技术缺乏高效生物分离技术缺乏 u目标产物的回收率低目标产物的回收率低 u 分离的成本高分离的成本高 生物分离过程中存在的主要问题 破碎、萃取破碎、萃取 沉淀、吸附沉淀、吸附 层析、色谱层
7、析、色谱 超滤、冷冻干燥超滤、冷冻干燥 离心、过滤离心、过滤 萃取、超滤萃取、超滤 电泳电泳 喷雾干燥、结晶喷雾干燥、结晶 粗提粗提初分离初分离精分离精分离成品化成品化 每步的回收率: Yi = mi2 / mi1 mi2 第i步分离后得到产品的总量, mi1 第i步分离前产品的总量 总回收率: i i T YY l提高每步操作的回收率 l减少操作步骤 对分离技术及设备进行系统研究,努力开发新型高效 的分离纯化方法是实现降低目标产物的成本、提高经济 效益的必由之路。 例如:对人干扰素的分离 总回收率:16% 离子交换离子交换 (62.7%)62.7%) 硫酸盐盐析硫酸盐盐析 (96.2%)(9
8、6.2%) 铜亲合层析铜亲合层析 (46.0%)(46.0%) 疏水层析疏水层析 (78.3%)78.3%) 凝胶电泳凝胶电泳 (88.9%)(88.9%) 仅三步产品的回收率就达到仅三步产品的回收率就达到81%,且产品的,且产品的 纯纯 化程度与上述纯化过程相当。化程度与上述纯化过程相当。 分离路径的选择非常重要!分离路径的选择非常重要! 硫酸盐盐析硫酸盐盐析免疫亲合层析免疫亲合层析阳离子交换层析阳离子交换层析 方法:方法: 1 寻找差异 u物理性质:重力,分子大小,溶解度 u化学性质:分子的亲疏水特性及其所带电荷性质的差异 u生物学性质:生物分子间的特异性识别作用 性质上最大的差异将导致最
9、有效的分离性质上最大的差异将导致最有效的分离 2 对于生物活性物质,必须考虑分离方法对其生 物活性的影响 生物分离产品的类型: 小分子类小分子类:MWMW 10001000MW 1000,酶、抗体、重组蛋白、,酶、抗体、重组蛋白、 核酸等核酸等. . 利用分子间相互作用力的差异实现分离 l利用生物分子的化学和生物学性质的差异 l沉淀、萃取、吸附、色谱等 利用分子间物性上的差异实现分离 l如分子量、沉降系数、挥发度等 l膜过滤、凝胶筛分、电泳、离心、蒸馏等 单单 元元 操操 作作 分分 离离 机机 理理 分分 离离 对对 象象 举举 例例 膜分离膜分离 微滤微滤 压力差、拆分压力差、拆分 菌体、
10、细胞菌体、细胞 超滤超滤 压力差、筛分压力差、筛分 蛋白质、多糖、抗生素蛋白质、多糖、抗生素 反渗透反渗透 压力差、筛分压力差、筛分 水、盐、糖、氨基酸水、盐、糖、氨基酸 透析透析 浓度差、筛分浓度差、筛分 尿素、盐、蛋白质尿素、盐、蛋白质 电渗析电渗析 电荷、筛分电荷、筛分 氨基酸、有机酸、盐、水氨基酸、有机酸、盐、水 渗透汽化渗透汽化 汽液相平衡汽液相平衡 乙醇乙醇 萃取萃取 有机溶剂萃取有机溶剂萃取 液液相平衡液液相平衡 有机酸、抗生素有机酸、抗生素 双水相萃取液液相平衡双水相萃取液液相平衡 液液相平衡液液相平衡 蛋白质、抗生素蛋白质、抗生素 液膜萃取液膜萃取 液液相平衡液液相平衡 氨基
11、酸、有机酸、抗生素氨基酸、有机酸、抗生素 反胶团萃取相平衡反胶团萃取相平衡 液液相平衡液液相平衡 氨基酸、抗生素氨基酸、抗生素 超临界流体萃取超临界流体萃取 相平衡相平衡 香料、脂质香料、脂质 层析层析 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 浓度差、筛分浓度差、筛分 脱盐、分子分级脱盐、分子分级 反相层析反相层析 分配平衡分配平衡 甾醇类、维生素、脂质、肽甾醇类、维生素、脂质、肽 离子交换层析离子交换层析 电荷、浓度差(电荷、浓度差(pHpH、 蛋白质、氨基酸、抗生素、蛋白质、氨基酸、抗生素、 离子强度)离子强度) 核酸、有机酸核酸、有机酸 亲和层析亲和层析 生物亲和作用生物亲和作用 蛋白质、核酸蛋白质、
12、核酸 疏水相互作用疏水相互作用 疏水作用疏水作用 蛋白质蛋白质 层析聚焦层析聚焦 电荷、浓度差(电荷、浓度差(pHpH) 蛋白质蛋白质 电泳电泳 凝胶电泳凝胶电泳 筛分、电荷筛分、电荷 蛋白质、核酸蛋白质、核酸 等电点电泳等电点电泳 筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸 等速电泳等速电泳 筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差 蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸 区带电泳区带电泳 筛分、电荷、浓度差筛分、电荷、浓度差 蛋白质、核酸蛋白质、核酸 离心离心 离心过滤离心过滤 离心力、筛分离心力、筛分 菌体、菌体碎片菌体、菌体碎片 离心沉降离心沉降 离心力离心力 菌体、细胞、血
13、球菌体、细胞、血球 超离心超离心 离心力离心力 蛋白质、核酸、糖类蛋白质、核酸、糖类 u溶解度溶解度:受受 pHpH、盐等影响,将指导沉淀过程或、盐等影响,将指导沉淀过程或 萃取过程萃取过程 u分子电荷分子电荷:将指导如何有效地进行离子交换等将指导如何有效地进行离子交换等 u分子大小分子大小:指导凝胶过滤和膜过滤指导凝胶过滤和膜过滤 u疏水性疏水性:指导沉淀过程和疏水分离指导沉淀过程和疏水分离 u功能团功能团:功能团为稳定条件、提取剂及亲和吸功能团为稳定条件、提取剂及亲和吸 附剂的选择提供依据附剂的选择提供依据 u稳定性稳定性:适宜的适宜的pHpH值范围、温度范围、半衰期值范围、温度范围、半衰
14、期 u挥发性挥发性:是小分子物质选择分离过程的依据是小分子物质选择分离过程的依据 1 1氨基酸氨基酸: 两性电解质,具有等电点,溶解度受溶两性电解质,具有等电点,溶解度受溶 液液pHpH影响显著的特点。影响显著的特点。 常采用的分离纯化方法常采用的分离纯化方法 结晶结晶 离子交换离子交换 2 2蛋白质和多肽蛋白质和多肽: 特点:两性电解质,具有带电性、疏水性特点:两性电解质,具有带电性、疏水性 和生物亲和性,分子量差异较大。和生物亲和性,分子量差异较大。 常用的分析方法:常用的分析方法: 离心离心 沉淀沉淀 膜分离膜分离 萃取:双水相萃取、反胶团萃取萃取:双水相萃取、反胶团萃取 层析层析 电泳
15、等电泳等 3 3、糖类、糖类: 单糖、低聚糖、多糖单糖、低聚糖、多糖 分离纯化方法以吸附层析为主 4、脂质脂质: 脂肪酸、不饱和脂肪酸、卵磷脂等。 分离纯化方法: 有机溶剂萃取 超临界流体萃取 层析等方法 5 5抗生素抗生素: 分离纯化主要采用: 有机溶剂萃取 离子交换 结晶 吸附层折 6 6其他其他 天然植物及中药中的药用成分。 分离纯化: 萃取:溶剂萃取和超临界萃取 吸附层析等 对于生物产品,消费者 更看重的是产品的价格、 质量和实用性。所以,工 业生物分离过程选择的标 准应该是以获得高质量、 低价格的产品为目标。影 响产品成本的除了分离步 骤和效率外,还有一个重 要的因素就是产品的浓度。
16、 根据热力学第二定律,混合过程熵增大,是自发过 程。所以,两种互溶的物质相互混合时,不需要外界能 量。但是,要使混合的物质得到分离,必须补充使熵减 小所需的能量。在恒温条件下使混合物中的各组分提纯 为纯粹的物质所需的最小功 与吉布斯自由能变化 相等,即 在稀溶液中: 即得到单位质量物质 所需的能耗与 成正 比。所以,原料中目标产物浓度越低,所需能耗越高, 分离回收的成本越大。 min WG ii i i xRTxGWln min iii xRTxWln min, i )/1ln( i x 采取的方法: 1)增加产品在发酵液或细胞内的浓度; 2)将浓缩过程尽可能地放在分离的最初阶 段。 评价一个
17、分离过程对目标产物的分离效率主要有 下面三个标准: 浓缩率浓缩率 m(concentration factor): 表征以浓缩为目的的分离过程的最重要指标 分离因子分离因子 (separation factor or purification factor) 表征目标产物的分离纯化程度的重要指标 回收率回收率 R (recovery factor) FC FP 原料 产品 CTC,CXC CTP,CXP FW CTW,CXW 废料 其中,F表示流速,C表示浓度,下标T和X分别表示目 标产物和杂质,C、P和W分别表示原料、产品和废料。 浓缩率 mT = CTP/CTC mX = CXP/CXC
18、如果 mT = mX ,则目标产物未得到分离纯化 分离器 分离因子 = 分离因子越大,分离效率越高 回收率R R = 100% = 100% TC TP CV CV c p xm mT TC TP CF CF c p 1 单克隆抗体的生产(monoclonal antibodies) 用途:临床治疗、检测及实验研究 生产规模: 1m3/day,小规模批量生产,属于高附加值 产品,反应器的体积一般为35L左右。 类型:IgG:分子量160,000Da,能够分泌到胞外; IgM:分子量是IgG的5倍,存在于细胞膜表面。 生产的方式:杂交瘤细胞生产的融合蛋白(血清培养). IgG product C
19、ells Supernatant IgG eluted Unbound material 单克隆抗体的回收和纯化(单克隆抗体的回收和纯化(John Wiley 等,等,1995) Bioreactor fluid with cell Continuous centrifugation 100,000MW membrane Affinity chromatograph Sterile filtration Formulation Membrane concentration 2. 人胰岛素(人胰岛素(human insulin) 生产方式:基因工程 E.coli;以包含体的形式存在于胞内; 细胞
20、培养产生的是胰岛素前体,需进一步进行 化学转化为胰岛素 含量:小于1g/L(相当低); 用途:临床注射用,要求的纯度相当高; 3. 狂犬病疫苗(狂犬病疫苗(Rabies vaccine) 病毒性疫苗的生产一般是在动物体内、单层培养或悬浮 培养,在病毒溶解细胞后在将其收集。 生产方式:使用猿猴细胞作为微载体悬浮培养,反应体积 上百立升。动物细胞被固定在珠状的微载体上。 病毒(0.3m)首先感染细胞并在其内复制。其 后被收集分离。 Product Product B-chain Cell debris A-chain Supernatant Cyanogen 人胰岛素的回收和纯化人胰岛素的回收和纯
21、化 Bromide (San Diego等,等,1998) Bioreactor fluid with cells Precipitation Chromatography 阴离子、体积排阻阴离子、体积排阻 Cell disruption Centrifugal extraction Dialysis Cleaning pro insulin Precipitation pH=5.0 Chromatography 弱阴、反向弱阴、反向HPLC Extraction Sulfonation Dialysis 狂犬疫苗的下游分离过程狂犬疫苗的下游分离过程 (John Wiley等等, 1994)
22、Cells Permeate Concentrated virus -Propiolactone 丙酸内脂丙酸内脂 4 C 37 C HSA Nonantigenic material Product Bioreactor fluid with cells Membrane UF membrane 10-100kDa Virus inactivation Hydrolysis(24 hr) Zonal(蔗糖)蔗糖) Centrifugation 除菌除菌 青霉素(青霉素(penicillin):用青霉菌生产,主要提取步骤为萃 取。 蛋白酶(蛋白酶(protease) 用途:洗涤剂,所以对纯度要
23、求不高 目的:高浓度、高产率,而非高纯度 L-赖氨酸(赖氨酸(L-lysine) 可用于动物和人使用,不同用途,不同的纯化方式。 主要分离方式为吸附。 柠檬酸(柠檬酸(citric acid) 由Aspergillus niger(曲霉)生产,酸性菌,在低pH值 下生长。主要分离方式为萃取(用煤油和叔氨)。 青霉素的分离及纯化(青霉素的分离及纯化(Macmillan,1983) Product CaCl and Polyelectrolyte T=5 C Spent solvent Filtrate Spent Isopropanol Amyl acetate solvent or butan
24、ol 乙酸戊酯乙酸戊酯 Extract Spent solvent Acetone and water and Carbon and sodium or Impurities potassium acetate Bioreactor fluid with cells Filtration Extractions pH 2-3 Activated carbon treatment Filtration Drying Filtration Washing Filtration Precipitation 蛋白酶的分离纯化蛋白酶的分离纯化 (Shuler ML等等, 1992) Solid Prod
25、uct Cool to 4-5 C Filter aid Liquid Product Cells Precoat Bioreactor fluid pretreatment Filtration or centrifugation Two-stage ultrafiltration Ultrafiltration Sterile ultrafiltration Polishing ultrafiltration Formulation Formulation Drying Rotary filter Precipitation Liquids or solids 赖氨酸的回收和分离(赖氨酸的
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