生物化学实验课件全册配套完整精品课件.ppt

1、生物化学实验课件全册配套生物化学实验课件全册配套 完整精品课件完整精品课件 生生 物物 化化 学学 实实 验验 1、课前必须预习，、课前必须预习，写好预习报告写好预习报告。 2、了解实验的基本原理和主要步骤，做到心中有数。、了解实验的基本原理和主要步骤，做到心中有数。 3、上实验课、上实验课必须穿实验服，带实验讲义必须穿实验服，带实验讲义。 4、不许大声喧哗，有问题及时请教老师。、不许大声喧哗，有问题及时请教老师。 5、器材、药品等严格按规定使用，严禁乱用乱放。、器材、药品等严格按规定使用，严禁乱用乱放。 6、实验过程中因个人未能按着实验要求操作而导致器材、实验过程中因个人未能按着实验要求操作

2、而导致器材 的损坏，按规章制度进行赔偿。的损坏，按规章制度进行赔偿。 7、遵守实验制度，爱护仪器，注意安全（如，水、电、遵守实验制度，爱护仪器，注意安全（如，水、电、 煤气、强酸、强碱等）。煤气、强酸、强碱等）。 二、实验要求二、实验要求 8、实验过程要正规操作，动手、动脑主动进行实验；掌握关、实验过程要正规操作，动手、动脑主动进行实验；掌握关 键，力求得出准确结果；键，力求得出准确结果；仔细观察，认真思考仔细观察，认真思考，及时做好记，及时做好记 录；综合分析得出正确的实验结论。录；综合分析得出正确的实验结论。 9、因故不能按时上实验者应有请假手续。、因故不能按时上实验者应有请假手续。 10

3、、实验结束后将相关器材要彻底清洗干净，放到指定位置。、实验结束后将相关器材要彻底清洗干净，放到指定位置。 11、废弃物严格按要求分类收集、处理。、废弃物严格按要求分类收集、处理。 12、值日生要按规定要求将实验室打扫干净，检查门窗、水、值日生要按规定要求将实验室打扫干净，检查门窗、水、 电、煤气等。电、煤气等。 三、实验内容三、实验内容 实验一、核酸的比色定量分析实验一、核酸的比色定量分析紫外分光光度法紫外分光光度法 实验二、蛋白质的比色定量分析实验二、蛋白质的比色定量分析 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 实验四、血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳实验四、血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳 实验五、用纸层析法鉴

4、定转氨酶的转氨基作用实验五、用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用 实验七、实验七、 DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白纤维素离子交换层析法分离血清蛋白 实验六、猪肝（小牛肠）碱性磷酸酶的提纯及比活力测定实验六、猪肝（小牛肠）碱性磷酸酶的提纯及比活力测定 实验三、实验三、3, 5 - 二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖 实验八、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量实验八、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 实验九、酶联免疫吸附试验实验九、酶联免疫吸附试验 实验预习：实验预习：20分分 实验操作：实验操作：30分分 实验报告：实验报告：50分分 四、实验成

5、绩评定四、实验成绩评定 实验一实验一 核酸的比色定量分析核酸的比色定量分析 紫外分光光度法紫外分光光度法 掌握紫外分光光度计的基本原理和使用方法掌握紫外分光光度计的基本原理和使用方法 掌握紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法掌握紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法 实验目的：实验目的： 1核酸包括哪些？核酸包括哪些？ 2分光光度计的基本原理？分光光度计的基本原理？ 3. 紫外分光光度法测定核酸含量的原理？有何优点及缺点？紫外分光光度法测定核酸含量的原理？有何优点及缺点？ 4. 何时用石英比色皿？何时用玻璃比色皿？为什么？何时用石英比色皿？何时用玻璃比色皿？为什么？ DNA或或RNA

6、分子在分子在260nm处有特异的紫外吸收峰，其吸收处有特异的紫外吸收峰，其吸收 强度与强度与DNA或或RNA的浓度成正比。核酸分子的形状，双链和单的浓度成正比。核酸分子的形状，双链和单 链之间的转换，也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用链之间的转换，也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用 特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便。特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便。 地衣酚显色法（地衣酚显色法（RNA） ：在三氯化铁及盐酸存在下，在三氯化铁及盐酸存在下，RNA与与3,5-二羟基甲苯二羟基甲苯 （地衣酚）反应，生成绿色物质，其最大光吸收值在（地衣酚）反应，生成绿色物质，其最大光吸

7、收值在670nm处。地衣酚反应处。地衣酚反应 特异性较差，戊糖均可与地衣酚反应，特异性较差，戊糖均可与地衣酚反应，DNA及其他杂质也能给出类似颜色。及其他杂质也能给出类似颜色。 二苯胺显色法二苯胺显色法 ：DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断 裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中脱氧核糖在酸性环境中 加热脱水生成加热脱水生成-羟基羟基-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在 595nm波长处有最大吸收。波长处

8、有最大吸收。 仪器及耗材：仪器及耗材： 紫外分光光度计，石英比色皿，离心管。紫外分光光度计，石英比色皿，离心管。 试剂：试剂： 质粒质粒DNADNA，蒸馏水。，蒸馏水。 （1）用蒸馏水，将待测样品以）用蒸馏水，将待测样品以1:10稀释。稀释。 （2）取）取2只石英比色杯，加蒸馏水至只石英比色杯，加蒸馏水至2/3，在，在260nm下调零。下调零。 （3）取出比色槽外侧的比色杯，去掉蒸馏水，加待测样品）取出比色槽外侧的比色杯，去掉蒸馏水，加待测样品 DNA，在，在260nm、280nm及及310nm处读取处读取OD值。值。 （4）小心取出比色杯，用蒸馏水清洗，将水吸干，放入比色）小心取出比色杯，用

9、蒸馏水清洗，将水吸干，放入比色 杯盒内。杯盒内。 操作步骤操作步骤: （5） 纯度分析：纯度分析： （6）计算浓度：）计算浓度： 纯纯DNA或或RNA浓度可用下列公式计算：浓度可用下列公式计算： dSDNA=50(OD260-OD310) 稀释倍数（稀释倍数（ g /ml） SSDNA=33(OD260-OD310)稀释倍数（稀释倍数（ g /ml） SSRNA=40(OD260-OD310) 稀释倍数（稀释倍数（ g /ml） 注意事项：注意事项： 1. OD310值是背景，若盐浓度高，值是背景，若盐浓度高， OD310值也高。值也高。 2. OD260/OD280 对对DNA而言其值约为而

10、言其值约为1.8，高于，高于1.8 可能有可能有 RNA污染，低于污染，低于1.8 可能有蛋白质污染。可能有蛋白质污染。 3. OD260/OD280 对对RNA而言其值约为而言其值约为2.0 结 束 ！ 生生 物物 化化 学学 实实 验验 1、课前必须预习，、课前必须预习，写好预习报告写好预习报告。 2、了解实验的基本原理和主要步骤，做到心中有数。、了解实验的基本原理和主要步骤，做到心中有数。 3、上实验课、上实验课必须穿实验服，带实验讲义必须穿实验服，带实验讲义。 4、不许大声喧哗，有问题及时请教老师。、不许大声喧哗，有问题及时请教老师。 5、器材、药品等严格按规定使用，严禁乱用乱放。、器

11、材、药品等严格按规定使用，严禁乱用乱放。 6、实验过程中因个人未能按着实验要求操作而导致器材、实验过程中因个人未能按着实验要求操作而导致器材 的损坏，按规章制度进行赔偿。的损坏，按规章制度进行赔偿。 7、遵守实验制度，爱护仪器，注意安全（如，水、电、遵守实验制度，爱护仪器，注意安全（如，水、电、 煤气、强酸、强碱等）。煤气、强酸、强碱等）。 二、实验要求二、实验要求 8、实验过程要正规操作，动手、动脑主动进行实验；掌握关、实验过程要正规操作，动手、动脑主动进行实验；掌握关 键，力求得出准确结果；键，力求得出准确结果；仔细观察，认真思考仔细观察，认真思考，及时做好记，及时做好记 录；综合分析得出

12、正确的实验结论。录；综合分析得出正确的实验结论。 9、因故不能按时上实验者应有请假手续。、因故不能按时上实验者应有请假手续。 10、实验结束后将相关器材要彻底清洗干净，放到指定位置。、实验结束后将相关器材要彻底清洗干净，放到指定位置。 11、废弃物严格按要求分类收集、处理。、废弃物严格按要求分类收集、处理。 12、值日生要按规定要求将实验室打扫干净，检查门窗、水、值日生要按规定要求将实验室打扫干净，检查门窗、水、 电、煤气等。电、煤气等。 三、实验内容三、实验内容 实验一、核酸的比色定量分析实验一、核酸的比色定量分析紫外分光光度法紫外分光光度法 实验二、蛋白质的比色定量分析实验二、蛋白质的比色

13、定量分析 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 实验四、血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳实验四、血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳 实验五、用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用实验五、用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用 实验七、实验七、 DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白纤维素离子交换层析法分离血清蛋白 实验六、猪肝（小牛肠）碱性磷酸酶的提纯及比活力测定实验六、猪肝（小牛肠）碱性磷酸酶的提纯及比活力测定 实验三、实验三、3, 5 - 二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖 实验八、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量实验八、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 实验九、酶联免疫吸附

14、试验实验九、酶联免疫吸附试验 实验十、蛋白纯化系统实验十、蛋白纯化系统AKTA Prime plus分离混合蛋白分离混合蛋白 实验预习：实验预习：20分分 实验操作：实验操作：30分分 实验报告：实验报告：50分分 四、实验成绩评定四、实验成绩评定 实验一实验一 核酸的比色定量分析核酸的比色定量分析 紫外分光光度法紫外分光光度法 掌握紫外分光光度计的基本原理和使用方法掌握紫外分光光度计的基本原理和使用方法 掌握紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法掌握紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法 实验目的：实验目的： 1核酸包括哪些？核酸包括哪些？ 2分光光度计的基本原理？分光光度计的基本原

15、理？ 3. 紫外分光光度法测定核酸含量的原理？有何优点及缺点？紫外分光光度法测定核酸含量的原理？有何优点及缺点？ 4. 何时用石英比色皿？何时用玻璃比色皿？为什么？何时用石英比色皿？何时用玻璃比色皿？为什么？ DNA或或RNA分子在分子在260nm处有特异的紫外吸收峰，其吸收处有特异的紫外吸收峰，其吸收 强度与强度与DNA或或RNA的浓度成正比。核酸分子的形状，双链和单的浓度成正比。核酸分子的形状，双链和单 链之间的转换，也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用链之间的转换，也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用 特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便。特定的公式来校正。该法的特点是准

16、确、简便。 地衣酚显色法（地衣酚显色法（RNA） ：在三氯化铁及盐酸存在下，在三氯化铁及盐酸存在下，RNA与与3,5-二羟基甲苯二羟基甲苯 （地衣酚）反应，生成绿色物质，其最大光吸收值在（地衣酚）反应，生成绿色物质，其最大光吸收值在670nm处。地衣酚反应处。地衣酚反应 特异性较差，戊糖均可与地衣酚反应，特异性较差，戊糖均可与地衣酚反应，DNA及其他杂质也能给出类似颜色。及其他杂质也能给出类似颜色。 二苯胺显色法二苯胺显色法（DNA） ：DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的 糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而糖苷键断裂，生成嘌

17、呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸脱氧核糖在酸 性环境中加热脱水生成性环境中加热脱水生成-羟基羟基-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质， 在在595nm波长处有最大吸收。波长处有最大吸收。 仪器及耗材：仪器及耗材： 紫外分光光度计，石英比色皿，离心管。紫外分光光度计，石英比色皿，离心管。 试剂：试剂： 小牛胸腺小牛胸腺DNADNA，蒸馏水。，蒸馏水。 （1）用蒸馏水，将待测样品稀释（本次实验不需稀释）。）用蒸馏水，将待测样品稀释（本次实验不需稀释）。 （2）取）取2只石英比色杯，加蒸馏水至只石英比色杯，加蒸馏水至2/3，在，在260n

18、m下调零。下调零。 （3）取出比色槽外侧的比色杯，去掉蒸馏水，加待测样品）取出比色槽外侧的比色杯，去掉蒸馏水，加待测样品 DNA，在，在260nm、280nm及及310nm处读取处读取OD值。值。 （4）小心取出比色杯，用蒸馏水清洗，将水吸干，放入比色）小心取出比色杯，用蒸馏水清洗，将水吸干，放入比色 杯盒内。杯盒内。 操作步骤操作步骤: （5） 纯度分析：纯度分析： （6）计算浓度：）计算浓度： 纯纯DNA或或RNA浓度可用下列公式计算：浓度可用下列公式计算： dSDNA=50(OD260-OD310) 稀释倍数（稀释倍数（ g /ml） SSDNA=33(OD260-OD310)稀释倍数（

19、稀释倍数（ g /ml） SSRNA=40(OD260-OD310) 稀释倍数（稀释倍数（ g /ml） 注意事项：注意事项： 1. OD310值是背景，若盐浓度高，值是背景，若盐浓度高， OD310值也高。值也高。 2. OD260/OD280 对对DNA而言其值约为而言其值约为1.8，高于，高于1.8 可能有可能有 RNA污染，低于污染，低于1.8 可能有蛋白质污染。可能有蛋白质污染。 3. OD260/OD280 对对RNA而言其值约为而言其值约为2.0 结 束 ！ 实验二实验二 蛋白质的比色定量分析蛋白质的比色定量分析 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 实验目的实验目的 l熟悉分光光度计的基本

20、原理和使用方法熟悉分光光度计的基本原理和使用方法 l掌握利用考马斯亮蓝定量分析蛋白质的方法掌握利用考马斯亮蓝定量分析蛋白质的方法 思考题思考题 1.考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋自质含量的原理是什么？法测定蛋自质含量的原理是什么？ 还有哪些蛋自质定量法？还有哪些蛋自质定量法？ 2.考马斯亮蓝法测定蛋自质含量时，应该注意些什么？考马斯亮蓝法测定蛋自质含量时，应该注意些什么？ 实验器材实验器材 主要试剂主要试剂 一、制定标准曲线一、制定标准曲线常量法标准曲线常量法标准曲线 实验操作实验操作 试管编号试管编号012345 1mg/ml标准蛋白溶液标准蛋白溶液(ml)0.00.010.02

21、0.030.040.05 蒸馏水蒸馏水(ml)0.10.090.080.070.060.05 考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝试剂(ml)各各5ml 摇匀，摇匀，1h内以内以0号管为空白对照，在号管为空白对照，在595nm处比色处比色 OD595nm 取取6支支10ml干净试管干净试管 按下表取样，混匀，放置按下表取样，混匀，放置2min。在。在 595nm 下比色，纪录数据。以下比色，纪录数据。以OD值为纵坐标、标准蛋白含量（值为纵坐标、标准蛋白含量（mg/ml） 为横坐标作图，得到标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未为横坐标作图，得到标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未 知样品的知样品的OD值，即

22、可查出未知样品的蛋白含量。值，即可查出未知样品的蛋白含量。 制备待测样品：已准备好。制备待测样品：已准备好。 二、未知样品蛋白质浓度测定二、未知样品蛋白质浓度测定 测定：取测定：取1 支支10mL 试管，按下表取样。试管，按下表取样。 管管 号号1 待测样品提取液（待测样品提取液（ml）0.1 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250试剂（试剂（ml）5 OD595nm 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml ） 测定中，蛋白测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁 上，实验证明此复合物的吸附量可以忽略。测定结束后，上，实验证明此复合物的吸附量可以忽略。测定结束后，

23、 可用乙醇将比色杯壁上的蓝色洗干净。可用乙醇将比色杯壁上的蓝色洗干净。 注意事项注意事项 计算结果计算结果 OD595nm值对应的标准曲线蛋白质含量（值对应的标准曲线蛋白质含量（mg/ml） 样品蛋白质浓度样品蛋白质浓度(mg/ml)=稀释倍数稀释倍数 结 束 ！ 实验二实验二 蛋白质的比色定量分析蛋白质的比色定量分析 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 实验目的实验目的 l熟悉分光光度计的基本原理和使用方法熟悉分光光度计的基本原理和使用方法 l掌握利用考马斯亮蓝定量分析蛋白质的方法掌握利用考马斯亮蓝定量分析蛋白质的方法 思考题思考题 1.考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋自质含量的原理是什么？

24、法测定蛋自质含量的原理是什么？ 还有哪些蛋自质定量法？还有哪些蛋自质定量法？ 2.考马斯亮蓝法测定蛋自质含量时，应该注意些什么？考马斯亮蓝法测定蛋自质含量时，应该注意些什么？ 实验器材实验器材 主要试剂主要试剂 一、制定标准曲线一、制定标准曲线常量法标准曲线常量法标准曲线 实验操作实验操作 试管编号试管编号012345 1mg/ml标准蛋白溶液标准蛋白溶液(ml)0.00.010.020.030.040.05 生理盐水生理盐水(ml)0.10.090.080.070.060.05 考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝试剂(ml)各各5ml 摇匀，摇匀，1h内以内以0号管为空白对照，在号管为空白对照，在59

25、5nm处比色处比色 OD595nm 取取6支支10ml干净试管干净试管 按下表取样，混匀，放置按下表取样，混匀，放置2min。在。在 595nm 下比色，纪录数据。以下比色，纪录数据。以OD值为纵坐标、标准蛋白含量（值为纵坐标、标准蛋白含量（mg/ml） 为横坐标作图，得到标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未为横坐标作图，得到标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未 知样品的知样品的OD值，即可查出未知样品的蛋白含量。值，即可查出未知样品的蛋白含量。 制备待测样品：已准备好。制备待测样品：已准备好。 二、未知样品蛋白质浓度测定二、未知样品蛋白质浓度测定 测定：取测定：取1 支支10mL 试管，按下

26、表取样。试管，按下表取样。 管管 号号1 待测样品提取液（待测样品提取液（ml）0.1 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250试剂（试剂（ml）5 OD595nm 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/ml ） 测定中，蛋白测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁 上，实验证明此复合物的吸附量可以忽略。测定结束后，上，实验证明此复合物的吸附量可以忽略。测定结束后， 可用乙醇将比色杯壁上的蓝色洗干净。可用乙醇将比色杯壁上的蓝色洗干净。 注意事项注意事项 计算结果计算结果 OD595nm值对应的标准曲线蛋白质含量（值对应的标准曲线蛋白质含量（mg/ml） 样品蛋白质浓度样

27、品蛋白质浓度(mg/ml)=稀释倍数稀释倍数 结 束 ！ 实验三实验三 3, 5 - 二硝基水杨酸二硝基水杨酸(DNS)法法 测定总糖和还原糖测定总糖和还原糖 l 掌握还原糖和总糖测定的基本原理掌握还原糖和总糖测定的基本原理 l 掌握比色法测定还原糖的操作方法和分光光度掌握比色法测定还原糖的操作方法和分光光度 计的使用。计的使用。 实验目的实验目的 1.1.还原糖包括哪些糖？测试还原糖的方法有哪些？还原糖包括哪些糖？测试还原糖的方法有哪些？ 2.2.总糖包括哪些化合物？如何测定？总糖包括哪些化合物？如何测定？ 3.3.3,53,5二硝基水杨酸二硝基水杨酸(DNS)(DNS)法的基本原理是什么？

28、优点？法的基本原理是什么？优点？ 4.4.3,53,5二硝基水杨酸二硝基水杨酸(DNS)(DNS)法测定时为什么要设计空白管？法测定时为什么要设计空白管？ 思考题思考题 还原糖与非还原糖还原糖与非还原糖 还原性糖（还原性糖（Reducing sugarReducing sugar） 与斐林、土伦、本氏试剂呈正反应的糖与斐林、土伦、本氏试剂呈正反应的糖 非还原性糖（非还原性糖（Nonreducing sugarNonreducing sugar） 无变旋、还原、成脎性质无变旋、还原、成脎性质 在在NaOH和丙三醇存在下，和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（二硝基水杨酸（DNS）与还原糖）与还原

29、糖 共热后被还原生成氨基化合物。在过量的共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此碱性溶液中此 化合物呈桔红色，在化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度波长处有最大吸收，在一定的浓度 范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测 定样品中的含糖量。定样品中的含糖量。 本方法操作简便，快速，杂质干扰较少。本方法操作简便，快速，杂质干扰较少。 试管和试管架试管和试管架 碱滴定管（碱滴定管（50ml50ml） 铁架台铁架台 滴定管夹滴定管夹 吸量管（吸量管（1ml1ml和和2ml2ml） 容量瓶（容量瓶

30、（100ml100ml） 水浴锅水浴锅 玻璃漏斗和烧杯。玻璃漏斗和烧杯。 三脚架三脚架 量筒量筒 白瓷板白瓷板 玻璃棒玻璃棒 762 分光光度计分光光度计 756 分光光度计分光光度计 电子天平电子天平 恒温水浴恒温水浴 3,5-二硝基水杨酸（二硝基水杨酸（DNS）试剂：）试剂：称取称取6.5g DNS溶于少量热蒸溶于少量热蒸 馏水中，溶解后移入馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶氢氧化钠溶 液液325ml，再加入，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。 葡萄糖标准溶液：葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖

31、准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量，加少量 蒸馏水溶解后，再定容至蒸馏水溶解后，再定容至100ml，即含葡萄糖为，即含葡萄糖为1.0mg/ml。 6 M HCl：取取250ml浓浓HCl(3538%) 蒸馏水稀释到蒸馏水稀释到500ml。 碘碘-碘化钾溶液：碘化钾溶液：称取称取5g碘，碘，10g碘化钾溶于碘化钾溶于100ml蒸馏水中。蒸馏水中。 6N NaOH：称称120g NaOH溶于溶于500ml蒸馏水中。蒸馏水中。 0.1% 酚酞指示剂酚酞指示剂。 实验材料实验材料 ：玉米粉玉米粉 实验试剂实验试剂 管号管号 葡萄糖标准液葡萄糖标准液 （mlml） 蒸馏水蒸馏水 （mlml） 最

32、终浓度最终浓度 （mg/mlmg/ml） ODOD540nm 0 00.00.01.01.00.00.0 1 10.20.20.80.80.20.2 2 20.40.40.60.60.40.4 3 30.60.60.40.40.60.6 4 40.80.80.20.20.80.8 5 51.01.00.00.01.01.0 1. 取取6个试管，按下表加入个试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水葡萄糖标准液和蒸馏水 （二）还原糖的制备（二）还原糖的制备 (三三) 样品总糖的水解和提取样品总糖的水解和提取 1. 取取1g玉米粉，放在玉米粉，放在100ml三角瓶中，加三角瓶中，加15m

33、l水溶解，再加水溶解，再加 10ml 6mol/L 盐酸，混匀。盐酸，混匀。 2. 将三角瓶置于沸水浴中加热煮沸将三角瓶置于沸水浴中加热煮沸30 min。 3.取出取出12滴置于白瓷板上，加滴置于白瓷板上，加1滴滴I-KI溶液检查水解是否完全。溶液检查水解是否完全。 如已水解完全，则不呈现蓝色。如已水解完全，则不呈现蓝色。 4.拿出三角瓶，冷却，加入拿出三角瓶，冷却，加入1滴酚酞指示剂，混匀，用滴酚酞指示剂，混匀，用6mol/L的的 NaOH中和至溶液呈微红色。中和至溶液呈微红色。 5. 将中和后的溶液转入将中和后的溶液转入100ml的容量瓶中：过滤，定溶，充分混的容量瓶中：过滤，定溶，充分混

34、 合合 1. 取取5支试管，编号，按下表向每支试管中加入试剂。支试管，编号，按下表向每支试管中加入试剂。 2. 用管用管1做对照，测定每管在做对照，测定每管在540nm下的下的OD值。将结果记录在表中。值。将结果记录在表中。 试试 剂剂管管 号号 12345 还原糖抽提液（还原糖抽提液（ml）0.00.50.50.00.0 总糖抽提液（总糖抽提液（ml）0.00.00.00.50.5 DNS（ml）0.50.50.50.50.5 加热加热在沸水浴中加热在沸水浴中加热5分钟，然后冷却之。分钟，然后冷却之。 蒸馏水（蒸馏水（ml）4.54.04.04.04.0 OD540 3. 根据还原糖和总糖的

35、根据还原糖和总糖的OD值，使用葡萄糖的标准工作曲线，计值，使用葡萄糖的标准工作曲线，计 算还原糖和总糖的百分含量，即：算还原糖和总糖的百分含量，即： 还原糖还原糖= （从曲线中查出的还原糖的浓度（从曲线中查出的还原糖的浓度N V/样品重）样品重）100% 总糖总糖= （从曲线中查出的总糖的浓度（从曲线中查出的总糖的浓度N V/样品重）样品重） 100% N：稀释倍数；：稀释倍数； V：提取液体积：提取液体积 结 束 ！ 生物科学与工程系生物 化学教研室 实验四实验四 血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳 生物科学与工程系生物 化学教研室 实验目的实验目的 1.1.掌握电泳法

36、分离蛋白质的原理、操作方法。掌握电泳法分离蛋白质的原理、操作方法。 2.2.了解电泳法分离蛋白质的临床意义。了解电泳法分离蛋白质的临床意义。 生物科学与工程系生物 化学教研室 醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜： 醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构， 渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具 有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、 脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。脂蛋白、糖蛋白、酶的分离

37、和免疫电泳等方面。 醋酸纤维素薄膜经醋酸纤维素薄膜经1,41,4二氧六环、透明液或液体石蜡处二氧六环、透明液或液体石蜡处 理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。 生物科学与工程系生物 化学教研室 实验原理实验原理 n电泳电泳: :带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现 象。在一定象。在一定pHpH条件下，不同的质点由于等电点不同而带不同性条件下，不同的质点由于等电点不同而带不同性 质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也 不同，

38、即它们的电泳迁移率不同，因此可使它们分离。不同，即它们的电泳迁移率不同，因此可使它们分离。 n 影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的影响电泳迁移率的外界因素：电场强度、溶液的pHpH值、溶液值、溶液 的离子强度和电渗现象。的离子强度和电渗现象。 n影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量、质点的 大小和形状。大小和形状。 n醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对 样品无拖尾和吸附现象等优点。样品无拖尾和吸附现象等优点。 生物科学与工程系生物 化学教研室 n采用醋酸纤维

39、薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄 膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋 酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酸酯，将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙 酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具 有均一的泡沫状的结构，厚度约为有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，有很强的通透性， 对分子移动阻力很小。对分子移动阻力很小。 n本实验以醋酸纤维素为电泳支

40、持物，分离各种血清蛋白。血本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血 清中含有清蛋白、清中含有清蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋球蛋白和各种脂蛋 白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不 同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物，同，在电场中的迁移速度不同。以醋酸纤维素薄膜为支持物， 正常人血清在正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。条区带。 其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为1-、2-

41、、-及及-球蛋球蛋 白白 生物科学与工程系生物 化学教研室 蛋白质名称蛋白质名称等电点（等电点（pIpI）相对分子质量相对分子质量/Mr/Mr 白蛋白白蛋白 1 1球蛋白球蛋白 2 2球蛋白球蛋白 球蛋白球蛋白 球蛋白球蛋白 4.80 5.06 5.06 5.12 6.857.5 69000 200000 300000 90000150000 156000300000 血清蛋白血清蛋白 生物科学与工程系生物 化学教研室 实验器材及试剂实验器材及试剂 一、器材：一、器材： 醋酸纤维素薄膜（醋酸纤维素薄膜（2cm2cm8cm8cm）、培养皿、滤纸、无齿镊、剪）、培养皿、滤纸、无齿镊、剪 子、加样器

42、（可用盖玻片或子、加样器（可用盖玻片或X X胶片或微量加样器）、直尺、胶片或微量加样器）、直尺、 铅笔、玻璃板（铅笔、玻璃板（8cm8cm12cm12cm）、烧杯、试管、试管架、吸管、）、烧杯、试管、试管架、吸管、 电泳仪、电泳槽。电泳仪、电泳槽。 生物科学与工程系生物 化学教研室 二、试剂二、试剂 生物科学与工程系生物 化学教研室 实验步骤实验步骤 1.1. 准备准备 将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两侧的液面等高。将缓冲液加入电泳槽的两槽内，并使两侧的液面等高。 裁剪尺寸合适的滤纸条，叠成四层贴在电泳槽的两侧支架上，裁剪尺寸合适的滤纸条，叠成四层贴在电泳槽的两侧支架上， 一端与支架前沿对齐

43、，另一端侵入电泳槽的缓冲液内，使滤一端与支架前沿对齐，另一端侵入电泳槽的缓冲液内，使滤 纸全部湿润，此即纸全部湿润，此即 “滤纸桥滤纸桥” 。 1：滤纸桥：滤纸桥 2：电极缓冲液：电极缓冲液 3：醋酸纤维素薄膜：醋酸纤维素薄膜 生物科学与工程系生物 化学教研室 将醋酸纤维素薄膜切成将醋酸纤维素薄膜切成2cm2cm8cm8cm大小，在无光泽面的一大小，在无光泽面的一 端约端约1.5cm1.5cm处，用铅笔轻划一直线，作为点样位置。然后将处，用铅笔轻划一直线，作为点样位置。然后将 无光泽面向下无光泽面向下，置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中浸泡，待，置于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中浸泡，待 充分浸透（约

44、充分浸透（约20min20min）即无白色斑点后取出，用洁净滤纸轻）即无白色斑点后取出，用洁净滤纸轻 轻吸去表面的多余缓冲液。轻吸去表面的多余缓冲液。 生物科学与工程系生物 化学教研室 2. 2. 点样点样 用加样器取少量血清用加样器取少量血清( (约约2 23 3 l)l)，加在点样线上，待血清，加在点样线上，待血清 渗入膜内，移开加样器。点样时应注意血清要适量，应形成均渗入膜内，移开加样器。点样时应注意血清要适量，应形成均 匀的直线，并避免弄破薄膜匀的直线，并避免弄破薄膜. . 生物科学与工程系生物 化学教研室 3.3. 平衡与电泳平衡与电泳 将点样后的将点样后的薄膜有光面朝上薄膜有光面朝

45、上，点样的一端靠近负极，点样的一端靠近负极， 平直地贴于电泳槽支架的滤纸上，平衡约平直地贴于电泳槽支架的滤纸上，平衡约5 5分钟。盖上电泳分钟。盖上电泳 槽盖，通电进行电泳。调节电压为槽盖，通电进行电泳。调节电压为100100160160伏，电流伏，电流 0.40.40.6mA/cm0.6mA/cm宽，夏季通电宽，夏季通电4545分钟，冬季通电分钟，冬季通电6060分钟，分钟， 待电泳区带展开待电泳区带展开2.52.53.5cm3.5cm时断电。时断电。 4.4. 染色染色 用无齿镊小心取出薄膜，浸于染色液中用无齿镊小心取出薄膜，浸于染色液中1 13 3分钟（以分钟（以 清蛋白带染透为止）。染

46、色过程中应轻轻晃动染色皿，使清蛋白带染透为止）。染色过程中应轻轻晃动染色皿，使 薄膜与染色液充分接触，薄膜量较多时，应避免彼此紧贴薄膜与染色液充分接触，薄膜量较多时，应避免彼此紧贴 而影响染色效果。而影响染色效果。 生物科学与工程系生物 化学教研室 5.5. 漂洗漂洗 准备准备3 3个培养皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜，依个培养皿，装入漂洗液。从染色液中取出薄膜，依 次在漂洗液中连续浸洗数次，直至背景无色为止。将漂净的次在漂洗液中连续浸洗数次，直至背景无色为止。将漂净的 薄膜用滤纸吸干，从正极端起依次为清蛋白（薄膜用滤纸吸干，从正极端起依次为清蛋白（A A）、）、1 1、2 2、 及及-球

47、蛋白。球蛋白。 生物科学与工程系生物 化学教研室 6. 定量定量 （1）洗脱法：）洗脱法：取取6支试管，编号，分别为支试管，编号，分别为A、1、2、 和空白管。于清蛋白管加入和空白管。于清蛋白管加入0.4mol/L NaOH溶液溶液4ml,其余其余5管管 加加2ml。剪下各条蛋白区带，另于空白部分剪一条与各蛋白。剪下各条蛋白区带，另于空白部分剪一条与各蛋白 区带宽度近似的薄膜作为空白，分别浸入各管中，振摇数次，区带宽度近似的薄膜作为空白，分别浸入各管中，振摇数次， 置置37水浴水浴20分钟，使色泽完全浸出。用分钟，使色泽完全浸出。用620nm波长以空白波长以空白 管调零比色，读取各管吸光度，按

48、下式计算：管调零比色，读取各管吸光度，按下式计算： T = A2 + 1 + 2 + + 清蛋白清蛋白% 清蛋白管吸光度清蛋白管吸光度2/T100 1-球蛋白球蛋白% 1-球蛋白管吸光度球蛋白管吸光度/T100 2-球蛋白球蛋白% 2-球蛋白管吸光度球蛋白管吸光度/T100 -球蛋白球蛋白% -球蛋白管吸光度球蛋白管吸光度/T100 -球蛋白球蛋白% -清蛋白管吸光度清蛋白管吸光度/T100 生物科学与工程系生物 化学教研室 （2）扫描法：）扫描法： 待染色的醋酸纤维素薄膜待染色的醋酸纤维素薄膜 完完 全干燥，置透明液中约全干燥，置透明液中约3分分 钟，取出贴于玻片上，薄膜完钟，取出贴于玻片上

49、，薄膜完 全透明。将已透明的薄膜放入全透明。将已透明的薄膜放入 全自动光密度计中，对蛋白区全自动光密度计中，对蛋白区 带进行扫描，自动绘出电泳图，带进行扫描，自动绘出电泳图， 并直接打印出各区带的百分含并直接打印出各区带的百分含 量。量。 正常参考值正常参考值百分比百分比% 清蛋白清蛋白57.4571.73 1-球蛋白球蛋白1.764.48 2-球蛋白球蛋白4.048.28 -球蛋白球蛋白6.7911.39 -球蛋白球蛋白11.8522.97 A/G1.242.36 生物科学与工程系生物 化学教研室 临床意义：临床意义： 急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭时，清蛋白降低，急慢性肾炎、肾病综合征

50、、肾功能衰竭时，清蛋白降低， 1 1、2 2和和-球蛋白升高；球蛋白升高； 慢性活动性肝炎、肝硬化时，清蛋白降低，慢性活动性肝炎、肝硬化时，清蛋白降低，、-球球 蛋白升高；蛋白升高； 急性炎症时，急性炎症时，1 1、2 2- -球蛋白升高；慢性炎症时，清蛋球蛋白升高；慢性炎症时，清蛋 白降低，白降低，2 2、-球蛋白升高；球蛋白升高； 红斑狼疮、类风湿关节炎时，清蛋白降低，红斑狼疮、类风湿关节炎时，清蛋白降低，-球蛋白球蛋白 显著升高；显著升高； 多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，多发性骨髓瘤时，清蛋白降低，-球蛋白升高，于球蛋白升高，于 和和-球蛋白区带之间出现球蛋白区带之间出现“M M”带。带。