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1、生物物理学全册配套生物物理学全册配套 完整精品课件完整精品课件 2 3 4 5 Folding-无序到有序 driving force(驱动力)? 6 Folding configurations(折叠构象) ? 7 How many accessible configuration for a protein consisting of 100AA (amino acids) during folding? (23)100=8100 ! Folding time: 数十毫秒 ms 8 蛋白质折叠是世界难题 l 已经有四个诺贝尔奖与蛋白质折叠问题相关， 但还远未解决 9 Folding mod

2、els (折叠模型) u Framework model (框架模型): 折叠单元作为一个核心吸引和稳定其它摆动着的二 级结构单元形成折叠框架,其它的侧链将适应这个 框架。 u Hydrophobic model (疏水模型) 10 Funnel model (漏斗模型) Energy Landscape theory (能量地貌理论) Entropy (熵) 天然折叠态 11 Funnel model (漏斗模型) 漏斗的斜率 代表折叠速率 12 Protein unfolding (蛋白质的去折叠) 13 14 Christian Boehmer Anfinsen (克里斯琴克里斯琴 B

3、安芬森安芬森) 1972年诺贝尔化学奖获得者 u 蛋白质可由加热或加入某些化学试剂 而变性，三级结构解体； u 而当环境回复到原本的状态时， 蛋白质可于不到一秒的时间折叠至 原先的立体结构，且不论试验几次， 蛋白质都仅此一种立体结构， u 结论：蛋白质分子的一级结构 决定其立体结构 15 牛的核糖核酸酶A (RNase A)的变性与复性 安芬森实验安芬森实验 16 Protein renaturation (蛋白质的复性) 17 安芬森实验安芬森实验 18 同时透析掉变性剂与巯基乙醇 安芬森实验安芬森实验 19 先透析掉巯基乙醇，允许形成双硫键， 最后再透析掉变性剂 UC-Berkeley分校

4、研究生生物物理试题 为什么？ 20 双硫键自由成键过程中，能形成多少种构象？双硫键自由成键过程中，能形成多少种构象？ 21 Conclusion: u 蛋白质折叠是多种途径共同作用的结果， 动力学和热力学因素共同决定 22 蛋白质折叠的平衡反应 23 Watching the protein fold (观察折叠) 24 Two-state and three-state folding u Two-state folding protein (两态折叠蛋白): 有些蛋白质在折叠过程中没有明显的中间状态，只 存在完全未折叠态与完全折叠态，称为“两态”蛋 白; u Three-state fol

5、ding protein (三态折叠蛋白): 另外一些蛋白需要经过中间体的不断积累才能完成 折叠过程，被称为“三态”蛋白 25 Contact order (CO, 接触序) CO = ? CO = ? UC-Berkeley分校研究生生物物理试题 26 Folding rates correlate well with CO 实验发现，对于两态两态折叠蛋白，接触序(CO) 与折叠速率k的对数呈反比。 27 CO模型的提出表明蛋白质的折叠速 率主要由它的天然态结构天然态结构 (native state) 所决定 Conclusion: 28 Rules: 一般来说,螺旋蛋白要比螺旋蛋白要比蛋白

6、折叠得快蛋白折叠得快， 用CO的理论解释，是因为螺旋蛋白中含有 大量的局部有效接触，所以有较低的CO值， 较高的折叠速率。 29 Some proteins fold through transient intermediates u 一部分蛋白通过过渡态(intermediates) 来实现折叠过程 过渡态Unfolded Native (folded) 30 How do you determine structural information on intermediate? u NMR (核磁共振技术) u Single-molecular technique (单分子技术) u Op

7、tical-tweezer (光学镊子技术） 31 32 the C-C distance cut-off is 4 即产生局部有效接触的氨基酸基团的C 原子不超过这个距离范围 Contact order (CO, 接触序) 33 CO模型指出，对于两态折叠蛋白, 局部有效接触(CO)越多，接触序的 值越小，折叠速率(k)越快. Conclusion 01: 34 CO模型的提出表明蛋白质的折叠速 率主要由它的天然态结构天然态结构 (native state) 所决定 Conclusion 02: 35 一般来说,螺旋蛋白要比螺旋蛋白要比蛋白折叠得快蛋白折叠得快， 用CO的理论解释，是因为螺旋

8、蛋白中含有 大量的局部有效接触，所以有较低的CO值， 较高的折叠速率。 Conclusion 03: 36 接触序的理论说明, 折叠成有效接触多的三维折叠成有效接触多的三维 结构结构, 这样的蛋白质三维结构能量稳定, 折叠 速率快。 Conclusion 04: 37 其他的基于有效接触序(Contact Order, CO)思想的模型 38 Long-range Order (LRO, 长程有效 接触序) where i and j are two residues for which the C-C distance is 8 () Nr is the total number of re

9、sidues in a protein Dr. M. Michael Gromiha (Japan) 39 Total contact distance (TCD, 总接触 距离) Prof. Zhou, Yaoqi (Indiana Purdue) TCD =CO (接触序) x LRO (长程接触序) *在CO与LRO所取参数相当的情况下 Li,j 考虑了长长、短程有效接触短程有效接触对折叠速率产生的共同作用 40 CO LRO TCD预测28个蛋白质 41 H-P Lattice Model H-P 晶格模型 42 H-P 晶格模型晶格模型- 疏水疏水(hydrophobic)-极性极性

10、 (polar) 2D-lattice model3D-lattice model Prof. Ken Dill, UCSF lattice model (晶格点模型） 43 如果i和j在格点空间中处于最近邻位置且在序列上不相邻 则(ri rj)等于1,否则等于0; evivj for H-H = -2.3; for H-P = -1; for P-P = 0; H = ?H = ? 疏水残基表示为黑色，极性残基表示为白色疏水残基表示为黑色，极性残基表示为白色 晶格体系能量 44 Conclusion: 晶格点模型提出: 最优的蛋白质折叠构象，为 所有可能的构象中具有最多最多H和和H有效接触有

11、效接触的 那个构象。(H: 疏水氨基酸) 45 A ball on a funnel always rolls directly to the bottom, no matter where it starts. Correspondingly, protein always reaches its single native state 46 47 48 更为精化的更为精化的H-P 晶格模型晶格模型: Toy模型模型 H = ? 氨基酸基团之间的夹角是任意的 49 Experimental Methods 蛋白折叠的实验方法 50 CD (圆二色谱) 51 CD (圆二色谱) 光学活性物质对

12、左、右旋圆偏振光的吸收光学活性物质对左、右旋圆偏振光的吸收 率不同率不同,其光吸收的差值A (Al - Ad) 称为该 物质的圆二色性(circular dichroism ,简写作 CD) 52 旋光物质对左旋和右旋圆偏振光的吸收不同, 造成 传播速度不同, 振幅不同, 合成光矢量叠加后将不合成光矢量叠加后将不 是线偏振光而是椭圆形是线偏振光而是椭圆形。 53 用CD研究细胞色素C的折叠 a-helix formation is more rapid than tertiary structure rearrangements of aromatic sidechains in the fo

13、lding of cytochrome c. The kinetics of these changes were determined by CD at 222 and 289 nm 54 色谱 (Chromatography) 55 利用色谱捕获双硫键形成的中间态 利用 iodoacetate (alkylating agent). The S-carboxymethyl derivative of cysteine is stable, which be determined using chromatographic separation. 56 Structure of BPTI B

14、ovine pancreatic typsin inhibitor (BPTI) has three disulfide bonds. 57 FRET (荧光共振能量转移) 58 donor-acceptor的激发光谱相重叠时, donor 诱发acceptor发出荧光， 同时donor荧光分 子自身的荧光强度衰减。 FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密 相关， 一般为一般为710 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长， FRET呈显著减弱。 FRET (荧光共振能量转移) 59 FRET原理示意图 60 荧光共振仪 61 FRET (荧光共振能量转移) Probing the fr

15、ee-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy; Nature (2002) : 419 Donor (供体) Acceptor (受体) 62 NMR (核磁共振) 63 Labeling method (标记方法) 同位素交换反应同位素交换反应 64 Pulsed-labeled NMR 同位素交换反应 NMR is used to detect the exchanged NH groups. 65 蛋白质折叠是21世纪的世 界性难题！ 如何预测蛋白质折叠？ 66 F

16、oldit, a game? 蛋白质折叠的电游 67 蛋白质折叠的电游蛋白质折叠的电游 David Baker及其同事发展了一种由多人来 玩的网络游戏, 被称为“Foldit”。 这项工作表明，即便是很复杂的科学问题 也能利用互动多人游戏有效地通过发动群 众的办法来解决。 68 Dr. David Baker (Washington University) Rosetta program for protein folding 例如，当一个疏水性氨基酸从蛋白质表面 浮现时，人类能很容易发现它。他们会重 新排列内部结构，使逃到外部的氨基酸能 重新回到内部。这种大范围重排的做法超 出了Rosett

17、a算法的能力，因为涉及到的能 量变化非常多。 69 现在Foldit宣布，一位名叫Vakobo的玩家可能创造出一种 抗流感蛋白质。研究人员计划在未来几周在实验室内测试 这种蛋白质，观察它是否能用于治疗。Nature (2010) Aug. 70 The End 71 Let us play Foldit ! 蛋白质折叠为正确的三维空间结构 S1 DNA RNA Proein 翻译过后的质量控制 S2 质量控制是王道！ S3 质量控制 (Quality Control) 通过分子伴侣分子伴侣与错误折叠的蛋白质上暴露 的疏水面疏水面结合，防止聚合、促进蛋白质的 折叠和组装； 通过蛋白酶蛋白酶来清除

18、不可逆损伤的蛋白质， 来保持细胞的正常功能。 S4 分子伴侣(chaperone) S5 High-resolution imaging of chaperone S6From Stanford University, School of Medicine 2006 S7 分子伴侣(分子保姆) 分子伴侣广泛存在于原核生物和真核生物 中: 其中最大一类分子伴侣是热休克蛋白热休克蛋白 (Heat Shock Protein, HSP) 主要功能: 1. 促进大分子折叠和组装; S8 分子伴侣(热休克蛋白) S8 HSP40，HSP70 蛋白 Scientific American, June 20

19、08 分子伴侣(热休克蛋白) S8 HSP90 蛋白 Scientific American, June 2008 主要功能: 2. 参与机体的应激反应参与机体的应激反应, 使生物逆境耐受使生物逆境耐受 能力大大增强能力大大增强; HSP在高温、重金属、炎 症等条件下均可保护蛋白质折叠; S8 Scientific American, June 2008 分子伴侣(热休克蛋白) 注射HSP70基因转化的细胞, 小鼠耐热力明显增强 S8 Scientific American, June 2008 分子伴侣(热休克蛋白) 主要功能: 3. 参与机体免疫反应参与机体免疫反应; 主要功能: 4. 参

20、与细胞周期与凋亡的调控参与细胞周期与凋亡的调控; l 如HSP70、HSP90为抗凋亡蛋白, 重要的 肿瘤药物靶点; l 果蝇、老鼠中HSP70过度表达引起寿命延 长; S8 Scientific American, June 2008 分子伴侣(热休克蛋白) l 增强机体免疫反应; l 增强机体应激反应; l 辅助蛋白复性; l 肿瘤药物靶点； l 长生不老药? S8 Scientific American, June 2008 分子伴侣的应用前景 分子伴侣的特点 分子伴侣对靶蛋白没有高度专一性，同一 分子伴侣可以促进多种氨基酸序列完全不 同的多肽链折叠成为空间结构、性质和功 能都不相关的蛋

21、白质。 它的催化效率不高，行使功能需要水解 ATP，以改变其构象，释放底物，进行再 循环。 具有进化保守性。 S8 为什么进化过程中会产生分子伴侣？ S9 地球很拥挤，细胞内也很拥挤！ (protein crowding) S10 Hydrophobic interactions(疏水作用) S11 由于细胞内的拥挤环境， 新生肽链在未完成合成之前容易发生错误 折叠，例如相邻肽链上的疏水氨基酸间相 互作用而发生的聚集。 还有一些蛋白质的结构域折叠比较缓慢， 时有大量的疏水表面暴露，有聚集及错误 折叠的风险。 S12 分子伴侣- 蛋白折叠的避风港湾S13 S14 什么是朊病毒？ 朊病毒的发现历史

22、 库鲁病与“食人族” S15 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1976 for their discoveries concerning new mechanisms for the origin and dissemination of infectious diseases Baruch S. Blumberg D. Carleton Gajdusek( 加德赛克)S16 Stanley B. Prusiner (普鲁西纳) The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1997 for his di

23、scovery of Prions - a new biological principle of infection S17 朊病毒(prion) 蛋白病毒 正常的朊蛋白(prion protein)存在于人与动 物的脑组织细胞中，主要呈螺旋结构，是 水溶性蛋白，可以被蛋白酶水解 ； 但当朊蛋白中氨基酸发生突变(mutation), 哪怕仅是一个位点的突变，朊蛋白会变异 成具有片状结构，不溶于水，不能被蛋白 酶水解，具有传染性的蛋白病毒结构。 传统病毒的定义？ S18 传统病毒 vs. 朊病毒 S19 乙肝病毒(HBV)结构 变性的朊蛋白病毒 S20 朊病毒蛋白有什么特性？ 朊病毒蛋白(pr

24、ion)的特性 与正常朊蛋白相比，朊病毒蛋白有43%左 右的折叠结构 S21 朊病毒蛋白的传染性极强，食用患病组织 蛋白粉末，或脑外科手术器械均可传染； 朊病毒蛋白对多种因素的灭活作用有极强 的抗性，如紫外线，超声波，高温，化学 试剂等； 朊病毒蛋白由于多含折叠结构，溶解度低， 且抗蛋白酶的分解。 朊病毒蛋白(prion)的特性 S22 朊病毒的可能致病机制 第一种学说:朊病毒蛋白可以自我编码遗传 信息,从而复制繁殖；(与传统的中心法则相 违背) S23 自我复制 无核酸参与 第二种学说: 蛋白质构象相互胁迫假说，即 正常朊蛋白在朊病毒蛋白的胁迫下，构象 发生变化； 朊病毒的可能致病机制 S2

25、4 相互作用 朊病毒蛋白正常朊蛋白 胁迫 蛋白构象发生变化 “胁迫”构象假说 S25 “胁迫”构象假说的新证据 美国俄亥俄州立大学Science. 2010 Feb 26;327(5969):1132-5 利用蛋白重组技术把正常朊蛋白结构进行 了修饰，与致病性朊蛋白结构类似； S26 “胁迫”构象假说的新证据 驼背 萎靡不振 S27 朊病毒的致病机理(可雅氏综合症) 富含折叠结构的蛋白质容易形成积聚，并 形成淀粉样(fibrils)沉淀 S28 其他错误折叠相关疾病 疯牛病 (Mad-cow disease) 羊瘙痒病 帕金森病 (Parkinson disease) 阿尔兹海默病 (Alzh

26、eimer disease) 21世纪与艾滋病并列的病毒！ S29 Alzheimer disease (阿尔兹海默病) 又称“老年痴呆症” (AD): 由-amyloid聚集 引起 S30 蛋白质错误折叠的治疗？ 针对错误折叠的治疗途径(1) 稳定天然蛋白的折叠构象 需要化学伴侣(chemical chaperones)辅助 S31 针对错误折叠的治疗途径(2) 利用化合物抑制或者反转错误折叠蛋白 破坏片层结构的稳定性 S32 针对错误折叠的治疗途径(3) 阻止蛋白质相互作用，抑制蛋白质聚集 S33 protein-protein interface (PPI) inhibitor 针对错误

27、折叠的治疗途径(4) 错误折叠和聚集蛋白质的清除 刺激免疫系统产生抗体来清除聚集蛋白质 S34 展望 /转换有多大的普遍性, 其诱发因素是什 么？ 由蛋白质错误折叠造成的疾病，老年痴呆， 阿尔海默病，白内障，疯牛病等将在未来 持续威胁人类健康！ S35 116 117 23294 Single molecule 118 less faste r Impetus to single molecule 119 Why we conduct single molecule or what single molecule can tell us? 什么是？ 为什么？ 怎么样？ 120 在单分子水平上对

28、生物分子行为（包括在单分子水平上对生物分子行为（包括 ）的）的 检测以及在此基础上的检测以及在此基础上的 等，是分子生物物理学的延伸和趋势。等，是分子生物物理学的延伸和趋势。 121 生命单元的基本功能主要取决于生命单元的基本功能主要取决于单个大分单个大分 子子。与测量分子集合体整体性质的传统方。与测量分子集合体整体性质的传统方 法相比，单分子技术具有法相比，单分子技术具有直接，准确，实直接，准确，实 时时等优点。等优点。 整体整体个体个体 122 ultrasensitive sensitivity 123 主要的研究手段有两种：主要的研究手段有两种： 1. 单分子光谱学单分子光谱学（Sin

29、gle-molecule spectroscopy 和和Single-molecule FRET） 2. 单分子力谱（单分子力谱（AFM和光镊）和光镊） 124 Techniques to study the single molecule Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) 全内反射荧光显微镜 Near field Scanning Optical Microscopy (NSOM or SNOM) 近场光学显微镜 125 工作原理: 采用激光为光源，在传统荧光显微镜成像的 基础上，附加了激光扫描和共轭聚焦装置，

30、通过计算机 控制来进行图像采集和处理的系统。 126 激光共聚焦工作原理 127 128 1. 动态扫描和三维图像重组; 2. 高质量数字图像; 4.点对点扫描去除了杂散光的影响 129 Scanning Tunneling Microscope STM 扫描隧道显微镜 Atom Force Microscope ( AFM ) 原子力显微镜 Optical tweezer/ optical trap OP or OT 光学镊子 130 Atom Force Microscope ( AFM ) 原子力显微镜 工作原理:利用微悬臂感受和放大悬臂上尖细探针 与受測样品原子之间的作用力，从而达到检

31、测的目的 131 132 AFM image: 蓝细菌图像 133 大肠杆菌 E. coli 134 Scanning Electron Microscope ( SEM ) 扫描电子显微镜 工作原理: 扫描电子显微镜的制造是依据电子与物质的相互作用。 当一束高能的入射电子扫描并轰击物质表面时, 物质表面将产生 二次电子、特征x射线和透射电子以及电磁辐射。利用电子和 物质的相互作用, 可以获取被测样品本身的各种物理、化学性质 的信息，如形貌、组成、晶体结构等等。 135 1. 真空系统; 2. 电子束系统; 3. 成像系统; 136 137 138 139 140 Optical Tweeze

32、r (光学镊子) 原理: 利用激光与物质间 进行动量传递时的力学 效应形成三维光学势阱。 141 Optical Tweezer (光学镊子) 142 Single-Molecule Biophysics Scientists 143 The Nobel Prize in Physics 1997 发明了用激光冷却和俘获原子发明了用激光冷却和俘获原子 的方法的方法 Steven Chu USA Claude Cohen- Tannoudji France William D. Phillips USA 144 在获得诺贝尔奖的第二天，在获得诺贝尔奖的第二天， 他骑着自行车，朝着目标往他骑着自行

33、车，朝着目标往 山路上攀爬，达到了目的地。山路上攀爬，达到了目的地。 这种攀登高峰的踏实感受这种攀登高峰的踏实感受: 也只有在努力过之后，才能也只有在努力过之后，才能 真切地感受到真切地感受到 朱棣文朱棣文(江苏太仓江苏太仓) 145 朱棣文视自己为一名科学家，最大的希望是无论在未来十年、 二十年，甚至上百年以后，自己在实验室中的成果，能够对人类产生贡献，与人类 的生活真正的结合在一起。 146 庄晓薇庄晓薇 利用单分子技术研利用单分子技术研 究病毒入侵宿主细究病毒入侵宿主细 胞的过程胞的过程 在哈佛大学工作以来，她一周七天，每天都从早上10时工作 到半夜12时。她说：“除了吃饭和睡觉，剩下的

34、时间都在工作。 147 Imaging virus-cell interactions in live cells 病毒入侵宿主细胞的过程病毒入侵宿主细胞的过程 148 Stochastic Optical Reconstruction Microscopy STORM (随机光学重建显微技术 ) 激发荧光Wavelength: 几百nm 生物单分子尺寸，例如细胞，只有3nm 传统荧光光学显微 149 STORM (随机光学重建显微技术 ) Trick (诀窍): l 先用一束激光把连接有荧光物质的生物样品荧光物质点亮 l 然后开启另一束激光，这束激光比如说把其能级调整到某个 不发光态。反复开

35、和关第二束激光，连接有荧光物质的样品 被不断地点亮和熄灭。 l 也就是说此刻亮的点，下一也就是说此刻亮的点，下一 刻可能就是暗的刻可能就是暗的。 l 如此这般，就可以对每个点进行精确定位。 通过对所得的点进行整合，就得到一个全新的图像。 150 传统荧光显微 STORM荧光显微 151 Seeing is believing （眼见为实) 152Virus-Cell Interactions (流感病毒入侵流感病毒入侵) 153Virus-Cell Interactions (流感病毒入侵流感病毒入侵) 154 做 “名女人” 155 STORM技术 Nature: 2008 Method o

36、f the Year 156 Molecule motor (分子马达分子马达) 157 分子马达，是对一大类广泛分子马达，是对一大类广泛 存在于细胞内部的能够把存在于细胞内部的能够把化化 学能（学能（ATP）直接转换为直接转换为机机 械能械能的蛋白分子的总称的蛋白分子的总称 158 分子马达的种类及其生物学模型分子马达的种类及其生物学模型 驱动蛋白（驱动蛋白（kinesin） 线性马达线性马达 动力蛋白动力蛋白（dynein） 肌球蛋白（肌球蛋白（myosin） F1-ATP合酶合酶 旋转马达旋转马达 细菌的鞭毛马达细菌的鞭毛马达 DNA或或RNA马达马达 159 马达结构示意图马达结构示意

37、图 160 线性推进式分子马达是把化学能直接转化为线性推进式分子马达是把化学能直接转化为 机械能，从而使得马达分子自身能够沿着一条线机械能，从而使得马达分子自身能够沿着一条线 性轨道作定向移动性轨道作定向移动。 161 1 1、驱动蛋白（、驱动蛋白（kinesin） KinesinKinesin发现于发现于19851985 年，主要存在于真核细胞年，主要存在于真核细胞 内，内，以微管蛋白为轨道，以微管蛋白为轨道， 沿微管沿微管(microtubule)(microtubule)的的 负极向负极向正极运动正极运动。 驱动蛋白驱动蛋白Kinesin Note: 正极,“生长”速度快 162 通过两

38、个头部分别结合和水解通过两个头部分别结合和水解ATPATP，导致颈部，导致颈部 发生构象改变，使两个头部交替与微管结合发生构象改变，使两个头部交替与微管结合， 从而沿微管从而沿微管“行走行走”，将尾部结合的，将尾部结合的“货物货物” （运输泡或细胞器）转运到其它地方。（运输泡或细胞器）转运到其它地方。 “行走行走”(walking) 机制机制 163 驱动蛋白的行走驱动蛋白的行走 164 Kinesin的作用的作用 将细胞器和各种细胞内物质沿着微管将细胞器和各种细胞内物质沿着微管 从细胞核移向细胞膜从细胞核移向细胞膜，完成各种细胞，完成各种细胞 内外传质功能内外传质功能. . 参与细胞的有丝分

39、裂参与细胞的有丝分裂，在有丝分裂的，在有丝分裂的 过程中，驱动蛋白使中心粒分开，导过程中，驱动蛋白使中心粒分开，导 致纺锤体极性的形成。致纺锤体极性的形成。 165 Dynein发现于发现于19631963 年，因与鞭毛和纤毛的年，因与鞭毛和纤毛的 运动有关而得名。它主运动有关而得名。它主 要存在于真核细胞内以要存在于真核细胞内以 及鞭毛和纤毛中。及鞭毛和纤毛中。 动力蛋白（动力蛋白（Dynein） 2、动力蛋白动力蛋白（dynein） 166 动力蛋白动力蛋白(Dynein)的作用的作用 u 沿微管负向运动运送物质沿微管负向运动运送物质, 将细胞膜的将细胞膜的 物质移向细胞核物质移向细胞核；

40、 u 驱动蛋白驱动蛋白(Kinesin)将细胞核的物质移将细胞核的物质移 向细胞膜向细胞膜; u 驱动蛋白和动力蛋白并不发生竞争，虽驱动蛋白和动力蛋白并不发生竞争，虽 然它们想要将货物向相反的方向运送。然它们想要将货物向相反的方向运送。 2005, Apr 7 167 3. 3. 肌球蛋白肌球蛋白(myosin)(myosin)家族家族 肌球蛋白肌球蛋白(myosin)(myosin)，对它的研究可以，对它的研究可以 追溯到追溯到18641864年，它是人们最早研究的分年，它是人们最早研究的分 子马达之一，主要存在于肌肉纤维和真子马达之一，主要存在于肌肉纤维和真 核细胞内，核细胞内，它属于马达

41、蛋白，可利用它属于马达蛋白，可利用 ATP产生机械能。产生机械能。 168 当每个ATP 被它水解之后它可以拉动 肌动蛋白丝行走一步，大量的肌动球 蛋白的协同作用最终导致了肌肉的 收缩现象。 169 沿微管运动的Myosin 170 u 最典型的旋转式分子马达是最典型的旋转式分子马达是F1-ATP酶。酶。 u 它由两部分组成，一部分镶嵌在线粒体膜上，它由两部分组成，一部分镶嵌在线粒体膜上， 另一部分暴露在膜外。另一部分暴露在膜外。 u 镶嵌在膜上的部分有三个亚基构成质子通过镶嵌在膜上的部分有三个亚基构成质子通过 线粒体膜的通道，当质子流经这样的通道时产线粒体膜的通道，当质子流经这样的通道时产

42、生力矩，从而推动暴露在膜外的亚基的旋转，生力矩，从而推动暴露在膜外的亚基的旋转， 成为线粒体重要的运输工具成为线粒体重要的运输工具 171 F1-ATP酶 旋转的分子马达 一一. . 澄清分子马达的动力学机制，解释与澄清分子马达的动力学机制，解释与 此有关的生命现象本质此有关的生命现象本质, , 研究分子马达的控制机理研究分子马达的控制机理 对于发现在众多疾病状态中基本细胞的出错过程有对于发现在众多疾病状态中基本细胞的出错过程有 着重要的意义着重要的意义 ( (癌症、先天性生理缺陷、耳聋、呼癌症、先天性生理缺陷、耳聋、呼 吸系统紊乱以及神经衰弱吸系统紊乱以及神经衰弱) ) 例如：紫杉醇就是由于

43、对微管蛋白分子马达的例如：紫杉醇就是由于对微管蛋白分子马达的 运动有干扰运动有干扰, ,而成为抗癌药物的明星。而成为抗癌药物的明星。 研究分子马达的意义？ 173 The End What is the coolest biophysical technique? 什么是最炫的生物物理技术？ 174 175 2008年诺贝尔奖获得者主要贡献 176 下村修，Osamu Shimomura 主要贡献： 1962年发现，一种名为 “维多利亚” 水母的 体内有一种叫水母素的物质，在与钙离子 结合时会发出蓝光，而这道蓝光未经人所见 就已被一种蛋白质吸收，改发绿色的荧光。 这种捕获蓝光并发出绿光的蛋白质

44、， 就是绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白。 l 没有自己的实验室，做了20年的博士后工作； l 2001年退休后还在用自己的家庭地址发表文章！ 177 178 下村修从大量的维多 利亚水母中分离出的 蛋白，在UV照射下 发出绿色荧光绿色荧光 水母素与钙离子结合-发出蓝光 蓝光被GFP吸收，发出荧光 179 钱永健，Roger Tsien Professor，美国科学院院士 Department of Chemistry, UCSD 主要贡献主要贡献: 系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理， 并对它进行了大刀阔斧的化学改造， 不但大大增强了它的发光效率， 还发展出了红色红色、蓝色蓝色、黄色黄色、青色青色荧

45、光蛋白 180 工程师家族工程师家族 父亲：钱学榘，工程师 舅舅：麻省理工学院的工程学教授 哥哥：钱永佑、神经生物学家，美国科学院院士， 斯坦福大学教授、曾任生理系主任 叔叔：钱学森、中国原子弹之父 堂兄：钱永刚（钱学森的长子），解放军某研究 所高级工程师、上海交通大学兼职教授 181 青年时的钱学森陈坤扮演的钱学森 182 获奖后获奖后 他说：他说：“我不是中国科学家。我在美国长我不是中国科学家。我在美国长 大，并一直在这里生活大，并一直在这里生活但是希望奖项但是希望奖项 能鼓舞中国的学生和科学家。能鼓舞中国的学生和科学家。” 颁奖后的答记者问 183 184 小典故: Prasher(普拉

46、兹)1992年发表GFP的cDNA 后，他申请美国国家科学基金时，评审者说 没有蛋白质发光的先例、就是他找到了，没 任何价值，普拉兹实验室没有经费难以维 继只好关门，一气之下，普拉兹离开学术界 不再做科研。但普拉兹把cDNA无偿赠给了 钱永健和查尔非。现在职业：出租车司机出租车司机 185 Chalfie，查尔非 Professor, Columbia University 线虫体内表达了绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白 186 187 荧光蛋白的结构解析荧光蛋白的结构解析 188 维多利亚水母GFP由238个AA组成，分子量约27kD 189 190 Topology structure (拓扑结构

47、分析） 191 荧光生色AA为65,66,67 192 荧光产生的原理 193 GFP的发光性质 194 195 Fluorophore(生色团)的化学结构 196 Chemical transformation 197 Surroundings of Fluorophore Mainly hydrophobic groups 198 GFP作为标记蛋白的优点 199 GFP生色团的改进 200 201 202 Rogers contribution 203 204 GFP在生命医学研究中应用 GFP作为新型报告基因用于转基因研 究 GFP标记用于研究蛋白质定位、移动 及蛋白相互作用 GFP标

48、记物在植物学、医学上的广泛 应用 205 病毒介导的GFP在烟草表达 GFP相对较小，只有238个AA， 将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能 206 GFP用于药物筛选 207 GFP用于肿瘤研究 208 GFP用于细胞定位研究 209 210 利用GFP观察病毒入侵宿主 211 212 213 214 215 216 可用于检测重金属离子污染 217 218 219 中国首例有GFP转基因荧光猪 220 221 能发绿色荧光的油菜(UV light) 222 GFP“调色板” 223 224 225 Molecular Imaging 分子成像 Editorial Board 编委 2

49、26 The early detection of tumor by molecular imaging 肿瘤的荧光探测与提前诊断 227 EMCIT: Enzyme Mediated Cancer Therapy and Imaging Overexpression of hydrolase by cancer cells *P- *D CANCER CELL HEALTHY CELL *P-: radiolabeled, negatively charged and water-soluble probe *D: radiolabeled, fluorescent and water-in

50、soluble probe “Methods for tumor diagnosis and therapy” US Patent 20030021791228 Extracellular PAP (Prostatic Acid Phosphatase) N NH O I O POO- O IQ2-P/PAP, G = -12.67 kcal/mol Molecular Probes Library N NH O I O H 用前列腺肿瘤作为例子 计算机辅助设计的探针分子 229 Image Different Tumor Cells No hydrolysis is seen with no