1、1.基因工程的四个步骤基因工程的四个步骤 P76页第一段。页第一段。2.目的基因的筛选和获取：目的基因的筛选和获取：PCR的条件、过程。的条件、过程。3.基因表达载体的构建：基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤是？该步骤的作用是？基因工程的核心步骤是？该步骤的作用是？-P80 基因表达载体的组成部基因表达载体的组成部分？每一部分的作用？分？每一部分的作用？构建基因表达载体的过程？构建基因表达载体的过程？-P80页和图页和图 同种限制酶或是能产生相同末端的限制酶同种限制酶或是能产生相同末端的限制酶切割基因表达载体和含目的基因的切割基因表达载体和含目的基因的DNA片段，片段，DNA连接酶连接酶连
2、接。连接。4.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞导入植物细胞的方法有？导入植物细胞的方法有？P80-81花粉管通道法：花粉管通道法：P81农杆菌转化法：农杆菌转化法：导入动物细胞的方法有？导入动物细胞的方法有？P82 受体细胞一般为受精卵，全能性高受体细胞一般为受精卵，全能性高-显微注射法显微注射法 导入微生物细胞的方法有？导入微生物细胞的方法有？P82-Ca2+处理大肠杆菌细胞处理大肠杆菌细胞转化的定义转化的定义-P81页资料卡，页资料卡，农杆菌农杆菌转化法：转化法：T-DNA的定义和特点？农杆菌转化法的过程的定义和特点？农杆菌转化法的过程 5.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与
3、鉴定 分子水平的检测分子水平的检测-如何如何检测染色体检测染色体DNA上是否插入外源基因？上是否插入外源基因？如何检测是否转录出了如何检测是否转录出了mRNA？如何检测是否翻译成了蛋白质？如何检测是否翻译成了蛋白质？个体水平如何检测？个体水平如何检测？-P82 性状测定、抗性检测性状测定、抗性检测6.基因工程的应用：获得乳腺生物反应器生产药物的过程？基因工程的应用：获得乳腺生物反应器生产药物的过程？-P90 基因工程菌的定义基因工程菌的定义-P91相关信息相关信息 7.蛋白质工程的定义蛋白质工程的定义-P93 基础是？通过什么手段？目的是？基础是？通过什么手段？目的是？基因工程只能基因工程只能
4、生产出自然界已有的蛋白质生产出自然界已有的蛋白质,蛋白质工程对目的基因进行实质性的改造，从而蛋白质工程对目的基因进行实质性的改造，从而改造现有蛋白改造现有蛋白质或制造新的蛋白质质或制造新的蛋白质蛋白质工程的基本思路蛋白质工程的基本思路-P94-P94 第三段和图。第三段和图。标记基因的作用机制？标记基因的作用机制？仅仅用标记基因来鉴定受体细胞中是否含有目的基因，仅仅用标记基因来鉴定受体细胞中是否含有目的基因，一定可靠吗？一定可靠吗？-P98T1答案：答案：D目的基因载体连接物载体载体连接物目的基因目的基因连接物下图为某种质粒表达载体的简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoR、BamH的酶
5、切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR、BamH在内的多种酶的酶切位点。（2）若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行_。用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是_分离纯化目的基因载体连接物、载体-载体连接物载体载体连接物（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是_，其合成的产物是_。（4）在上述实
6、验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_。启动子mRNAEcoR和BamH（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_、_、_三种。1.基因工程的四个步骤基因工程的四个步骤 P76页第一段。页第一段。2.目的基因的筛选和获取：目的基因的筛选和获取：3.基因表达载体的构建：基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤是？该步骤的作用是？基因工程的核心步骤是？该步骤的作用是？-P80 基因表达载体的组成部基因表达载体的组成部分？每一部分的作用？分？每一部分的作用？构建基因
7、表达载体的过程？构建基因表达载体的过程？-P80页和图页和图 同种限制酶或是能产生相同末端的限制酶同种限制酶或是能产生相同末端的限制酶切割基因表达载体和含目的基因的切割基因表达载体和含目的基因的DNA片段，片段，DNA连接酶连接酶连接。连接。4.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞导入植物细胞的方法有？导入植物细胞的方法有？P80-81花粉管通道法：花粉管通道法：P81农杆菌转化法：农杆菌转化法：导入动物细胞的方法有？导入动物细胞的方法有？P82 受体细胞一般为受精卵，全能性高受体细胞一般为受精卵，全能性高-显微注射法显微注射法 导入微生物细胞的方法有？导入微生物细胞的方法有？P82-
8、Ca2+处理大肠杆菌细胞处理大肠杆菌细胞转化的定义转化的定义-P81页资料卡，页资料卡，农杆菌农杆菌转化法：转化法：T-DNA的定义和特点？农杆菌转化法的过程的定义和特点？农杆菌转化法的过程 5.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定 分子水平的检测分子水平的检测-如何如何检测染色体检测染色体DNA上是否插入外源基因？上是否插入外源基因？如何检测是否转录出了如何检测是否转录出了mRNA？如何检测是否翻译成了蛋白质？如何检测是否翻译成了蛋白质？个体水平如何检测？个体水平如何检测？-P82 性状测定、抗性检测性状测定、抗性检测6.基因工程的应用：获得乳腺生物反应器生产药物的过程？基因工程的应用：
9、获得乳腺生物反应器生产药物的过程？-P90 基因工程菌的定义基因工程菌的定义-P91相关信息相关信息 7.蛋白质工程的定义蛋白质工程的定义-P93 基础是？通过什么手段？目的是？基础是？通过什么手段？目的是？基因工程只能基因工程只能生产出自然界已有的蛋白质生产出自然界已有的蛋白质,蛋白质工程对目的基因进行实质性的改造，从而蛋白质工程对目的基因进行实质性的改造，从而改造现有蛋白改造现有蛋白质或制造新的蛋白质质或制造新的蛋白质蛋白质工程的基本思路蛋白质工程的基本思路-P94-P94 第三段和图。第三段和图。三、将目的基因导入受体细胞：三、将目的基因导入受体细胞：1.植物细胞植物细胞P80-81花粉
10、管通道法：花粉管通道法：我国独创；多种操作方法（我国独创；多种操作方法（微量注射器微量注射器将含目的基因的将含目的基因的DNA溶液直接注入溶液直接注入子房子房中；中；植物受粉后剪去柱头，将植物受粉后剪去柱头，将DNA溶液滴加到花柱切面，使溶液滴加到花柱切面，使目的基因借助花粉管通道目的基因借助花粉管通道进入进入胚囊胚囊）P81农杆菌转化法：农杆菌转化法：转化转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。农杆菌特点农杆菌特点：土壤微生物；侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。：土壤微生物；侵
11、染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌侵染植物细胞后，农杆菌侵染植物细胞后，Ti质粒的质粒的T-DNA转移转移到被侵染细胞，并且将其整合到该细胞的到被侵染细胞，并且将其整合到该细胞的染染色体色体DNA上。上。方法方法：将目的基因插入到：将目的基因插入到Ti质粒的质粒的T-DNA中，通过农杆菌的中，通过农杆菌的转化转化作用，使目的基因进入植物细胞。根据作用，使目的基因进入植物细胞。根据受体细胞不同，具体转化方法不同。叶片、花序等与农杆菌混合，筛选、培养受体细胞不同，具体转化方法不同。叶片、花序等与农杆菌混合，筛选、培养2.动物细胞动物细胞P82 受体细胞一般为受精卵，全能
12、性高受体细胞一般为受精卵，全能性高-显微注射法显微注射法 3.原核生物原核生物P82 大肠杆菌应用最广泛。大肠杆菌应用最广泛。-Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理分子的生理状态，然后将重组的基因表达载体导入。状态，然后将重组的基因表达载体导入。农杆菌农杆菌转化转化法：法：1.1.侵染对象？侵染对象？导入的导入的受体细胞：体细胞、受精卵受体细胞：体细胞、受精卵2.2.原理？原理？TiTi质粒与质粒与T-DNAT-DNA的特点？的特点？3.3.目的基因插入的位置？目的基因插入的位置？4.4.两次拼接（两次基因重组
13、）、两次拼接（两次基因重组）、两次转入（方法？）两次转入（方法？）5.5.转基因的植物细胞如何获得最终转基因的植物细胞如何获得最终的新品种？的新品种？具体原理：在农杆菌的具体原理：在农杆菌的TiTi质粒上存在质粒上存在T-DNAT-DNA，T-DNA T-DNA可转移至受体细胞，可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体并整合到受体细胞的染色体DNADNA上，上，因此只要将目的基因插入到因此只要将目的基因插入到TiTi质粒质粒的的T-DNAT-DNA中，通过农杆菌的转化作用，中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞就可以使目的基因进入植物细胞稳定存在和表达的关键：稳定存在和表达的
14、关键：TDNA携带目的基因转移至携带目的基因转移至植物细胞染色体植物细胞染色体DN A上上小本小本P3729(2020山东青岛模拟山东青岛模拟)下图为农杆菌下图为农杆菌Ti质粒的质粒的TDNA区段结构示意图。农杆菌附着植区段结构示意图。农杆菌附着植物细胞后，物细胞后，TDNA首先在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制，然后进入植物细胞并首先在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制，然后进入植物细胞并整合到染色体整合到染色体DNA上，继而诱发细胞异常生长和分裂，形成植物肿瘤。以下有关叙述正确上，继而诱发细胞异常生长和分裂，形成植物肿瘤。以下有关叙述正确的是的是()ATi质粒存在于农杆菌的拟核质粒存
15、在于农杆菌的拟核DNA之外之外B植物肿瘤的形成与植物肿瘤的形成与A、B两个基因的表达两个基因的表达有有关关C清除植物肿瘤组织中的农杆菌后肿瘤不再生长清除植物肿瘤组织中的农杆菌后肿瘤不再生长D利用利用TDNA进行转基因时需保进行转基因时需保留留LB、RB序列序列ABD目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定分子水平分子水平检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定一、检测与鉴定的目的：一、检测与鉴定的目的：检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。检测目的基因是
16、否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNA检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因二、检测与鉴定的方法：二、检测与鉴定的方法：方法：方法：PCR技术、核酸分子杂交技术、核酸分子杂交抗原抗原抗体杂交：抗原与抗体特异性结合抗体杂交：抗原与抗体特异性结合方法：方法：PCR技术、核酸分子杂交技术、核酸分子杂交 性状检测、抗性检验性状检测、抗性检验 1.PCR技术基本原理：根据目的基因两端的碱基序列特点设计特定引物，然后进行PCR，看是否扩增出目的基因。如果有扩增产物,表明被测的DNA中含有目的基因,如果没有的话,就表明没有成功转入目的基因.2.如何用
17、PCR检测是否转录出了目的基因的mRNA？提取细胞中的总提取细胞中的总mRNA，逆转录获得总，逆转录获得总cDNA，利用，利用目的基因特点设计的特定引物，进行目的基因特点设计的特定引物，进行PCR1.基本原理核酸分子杂交技术 互补的核酸单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异互补的核酸单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。的，即严格按照碱基互补配对进行。当用一段已知目的基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因或当用一段已知目的基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因或mRNAmRNA进行接触，若两者进行接触，若两者的碱基完全
18、配对成双链，则表明被测基因或的碱基完全配对成双链，则表明被测基因或mRNAmRNA中含有已知的目的基因序列。中含有已知的目的基因序列。2.过程3.基因探针 用用放射性同位素放射性同位素(如如3232P)P)、荧光分子等标记、荧光分子等标记的、与的、与目的基因互补目的基因互补的特异核苷酸序列。的特异核苷酸序列。基因探针可以包括整个目的基因，或目的基因探针可以包括整个目的基因，或目的基因的一部分。基因的一部分。如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。【详解】A、根据分析“引子”是一段DNA序列，彻底水解产物有磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基，共6种产物，A错误；B、由于线粒体中
19、也含有DNA，因此设计“引子”的 DNA 序列信息还可以来自线粒体DNA，B错误；C、根据题干信息“利用现代人的 DNA 序列设计并合成了引子”，说明设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列，C正确；D、土壤沉积物中的古人类双链 DNA 需要经过提取，且在体外经过加热解旋后，才能与“引子”结合，而不能直接与引子结合，D错误。植物基因工程植物基因工程动物基因工程动物基因工程基因工程药物基因工程药物食品工业食品工业基因工程的应用1 1、用于、用于提高提高动物动物生长速率：导入外源生长激素基因生长速率：导入外源生长激素基因2 2、用于、用于改善改善畜产品的畜产品的品质品质基因工程菌基因工程菌-
20、定义，定义，P91P91 生产酶等生产酶等2.2.生产人胰岛素的工艺流程：生产人胰岛素的工艺流程：1.1.工程菌：工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系称为用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系称为“工程菌工程菌”用用PCRPCR获取获取人胰岛素人胰岛素基因基因将人胰岛素基因将人胰岛素基因插入质粒插入质粒，构建基因表达载体；，构建基因表达载体；用用CaCa+处理大肠杆菌，使之成为处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞感受态细胞，将重组质粒导入大肠杆菌；，将重组质粒导入大肠杆菌；检测筛选检测筛选出成功转化的大肠杆菌，出成功转化的大肠杆菌，进行发酵培养（菌种扩大培
21、养、配置培养基、灭菌、接种、发酵、产物的分离和提纯）进行发酵培养（菌种扩大培养、配置培养基、灭菌、接种、发酵、产物的分离和提纯）思考：目前除了可以利用大肠杆菌生产人胰岛素，还可以用酵母菌来生产人胰岛素，请从细胞的结构与功能相适应的角度考虑，二者生产的人胰岛素有何不同？大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，无法对合成的胰岛素肽链进行加工，需后期人大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，无法对合成的胰岛素肽链进行加工，需后期人为加工为加工酵母菌是真核生物，有酵母菌是真核生物，有内质网和高尔基体，可以对合成的胰岛素肽链进行一定的加工和修饰。内质网和高尔基体，可以对合成的胰岛素肽链进行一定的加工
22、和修饰。乳腺生物反应器乳腺生物反应器1.乳腺生物反应器的制备过程2.获得乳腺生物反应器的步骤和培育普通转基因动物的步骤有什么区别？在构建基因表达载体时，在编码目的蛋白的基因序列前，在构建基因表达载体时，在编码目的蛋白的基因序列前，加上在乳腺中特异性表达的基因的启动子加上在乳腺中特异性表达的基因的启动子3.利用乳腺生物反应器生产蛋白质，有什么局限性？4.如何改进？涉及的生物学技术？3.受受性别性别和和发育时期发育时期的限制，只有在泌乳的限制，只有在泌乳期的雌性个体中，转入的基因才能表达期的雌性个体中，转入的基因才能表达4.制备膀胱生物反应器，不受性别和发育时制备膀胱生物反应器，不受性别和发育时期
23、的限制。期的限制。蛋白质工程1.1.对蛋白质分子结构的设计和改造是通过蛋白质工程实现的。对蛋白质分子结构的设计和改造是通过蛋白质工程实现的。2.2.蛋白质工程的概念，定位蛋白质工程的概念，定位-第二代基因工程第二代基因工程基础基础：蛋白质的结构规律和及其与生物功能的关系蛋白质的结构规律和及其与生物功能的关系途径：途径：目的：目的：改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的生产或生活的需要改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的生产或生活的需要改造基因或合成基因（基因修饰或基因合成）改造基因或合成基因（基因修饰或基因合成）3.3.蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？蛋白质工程操作
24、程序的基本思路与基因工程有什么不同？.基因工程是遵循中心法则，基因工程是遵循中心法则，DNAmRNADNAmRNA蛋白质蛋白质折叠产生功能，折叠产生功能，基本上是基本上是生产出自然界已有的蛋白质生产出自然界已有的蛋白质,基因工程仅仅对目的基因进行基因工程仅仅对目的基因进行DNADNA片段的切割和连接，片段的切割和连接，不改变基因的遗传信息不改变基因的遗传信息.蛋白质工程是按照以下思路进行的：蛋白质工程是按照以下思路进行的：预期蛋白质功能预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列找到对应的脱氧核苷酸序列找到对应的脱氧核苷酸序列合成新基因合成新基
25、因获得所需要的蛋白质获得所需要的蛋白质蛋白质工程对目的基因进行实质性的改造（如碱基对的增添、缺失、替换等）或者根据蛋白质预期功能设蛋白质工程对目的基因进行实质性的改造（如碱基对的增添、缺失、替换等）或者根据蛋白质预期功能设计合成全新基因，计合成全新基因，改变基因的遗传信息改变基因的遗传信息蛋白质工程与基因工程蛋白质工程与基因工程的区别和联系的区别和联系DNADNA的粗提取和鉴定的粗提取和鉴定 新坐标新坐标P275P275三三 、1.提取提取的原理：的原理：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，可用这一原理初步分离不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，可用这一原理初步分离DNA与蛋白质与蛋白质 D
26、NA在不同浓度的在不同浓度的2mol/L 的的NaCl中溶解度不同，能溶于中溶解度不同，能溶于2mol/L 的的NaCl鉴定鉴定的原理？的原理？DNA溶液溶液+二苯胺，沸水加热变蓝二苯胺，沸水加热变蓝3.材料选择的依据，能否用哺乳动物成熟的红细胞？材料选择的依据，能否用哺乳动物成熟的红细胞？4.方法步骤：方法步骤：研磨后，研磨后，DNADNA存在于上清液，还是下层液体中？存在于上清液，还是下层液体中？上清液中含有上清液中含有DNA和蛋白质，加和蛋白质，加预冷酒精的作用？出现的白色丝状物是？如何获取预冷酒精的作用？出现的白色丝状物是？如何获取DNA？如何鉴定如何鉴定DNA？2mol/L 的的Na
27、Cl的作用？的作用？二苯胺的作用和使用条件？二苯胺的作用和使用条件？新坐标新坐标 279页案例导引页案例导引下列利用洋葱进行下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是实验的叙述，正确的是A将研磨液加入将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤要弃去上清液切碎的洋葱，充分研磨后过滤要弃去上清液B采用体积分数为采用体积分数为95%酒精溶液析出酒精溶液析出DNA的方的方法可去除部分杂质法可去除部分杂质C用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损D将白色丝状物溶解在将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化溶液中，
28、加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色变化没有细胞核和细胞器，无没有细胞核和细胞器，无DNA13.粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（）A.加入适量的木瓜蛋白酶B.3740的水浴箱中保温 1015 分钟C.加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精D.加入 NaCl 调节浓度至 2mol/L过滤调节滤液中 NaCl 浓度至 014mol/L【详解】【详解】A、木瓜蛋白酶可以水解、木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解
29、中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物，相对含量较高的白色丝状物，A正确；正确；B、3740的水浴箱中保温的水浴箱中保温 1015 分分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在钟不能去除滤液中的杂质，应该放在6075的水浴箱中保温的水浴箱中保温 1015 分钟，使蛋白质变性析出，分钟，使蛋白质变性析出，B错误；错误；C、向鸡、向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤
30、液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒的冷却的酒精，此时精，此时DNA析出，不会进入滤液中，析出，不会进入滤液中，C错误；错误；D、加入、加入 NaCl 调节浓度至调节浓度至 2mol/L过滤过滤调节滤液中调节滤液中 NaCl 浓度至浓度至 014mol/L，DNA在在014mol/L的的NaCl溶液中溶解度小，溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，析出，不会进入滤液中，D错误。错误。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳DNA片段的扩增和电泳鉴定片段的扩增和电泳鉴定1.PCR的原理，电泳的原理。的原理，电泳的原理。-P84第二段第二段 凝胶中凝胶中DNA的迁移速率的影响因素？的迁
31、移速率的影响因素？如何检测如何检测DNA琼脂糖凝胶电泳是用于琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯分离、鉴定和提纯DNADNA片段片段(双链双链)的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNADNA在碱性条件下（在碱性条件下（pH8.0pH8.0的缓冲液）带负电荷的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质，在电场中通过凝胶介质向正极移动向正极移动，不同不同DNADNA分子片段由于分子量大小分子片段由于分子量大小和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。和构型不同，
32、在电场中的泳动速率液不同。分子量大的迁移速率慢分子量大的迁移速率慢溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）可嵌入）可嵌入DNADNA分子碱基对间形成分子碱基对间形成荧光络合物荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。量，筛选重组子的目的。取出凝胶，取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min30min，即可在即可在254nm254nm的紫外灯下观察，的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为有橙红色荧光条带的位置，即为DNADNA条带条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。
33、，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。2用用XhoI和和SalI两种限制性核酸内切酶分别处理同一两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（）酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（）A如图中两种酶识别的核苷酸序列不同如图中两种酶识别的核苷酸序列不同 B如图中酶切产物可用于构建重组如图中酶切产物可用于构建重组DNADNAC泳道中是用泳道中是用SalI处理得到的酶切产物处理得到的酶切产物 D图中被酶切的图中被酶切的DNA片段是单链片段是单链DNA
34、电泳是常用的分离、鉴定技术，在生物中的应用也非常的广泛某病是一种单基因遗传病（用电泳是常用的分离、鉴定技术，在生物中的应用也非常的广泛某病是一种单基因遗传病（用A、a表示），表示），其家庭系谱图如图其家庭系谱图如图1所示，对各家庭成员该对等位基因进行电泳如图所示，对各家庭成员该对等位基因进行电泳如图2请回答下列问题：请回答下列问题：（1）该病遗传方式是）该病遗传方式是常染色体的隐性病常染色体的隐性病，判断依据，判断依据是？是？产生该病的根本原因是产生该病的根本原因是基因突变基因突变（4）对）对3的不同细胞蛋白质的不同细胞蛋白质进行了分离（如图进行了分离（如图3），产生细），产生细胞胞1、2、3
35、的根本原因是的根本原因是基因的选择性表达基因的选择性表达，其中细胞，其中细胞3的名称是的名称是胰岛胰岛B细胞细胞基因编辑基因编辑CRISPR/Cas9系统类似于哪种酶的作用？系统类似于哪种酶的作用？哪一部分负责识别目标哪一部分负责识别目标DNA？哪一部分负责切割哪一部分负责切割目标目标DNA？基因编辑基因编辑（1）从）从CRISPR/Cas9系统作用示意图看，能够行使系统作用示意图看，能够行使特异特异性识别性识别DNA序列序列并并切割特定位点切割特定位点功能的分子是功能的分子是_，其类似于基因工程中其类似于基因工程中_的作用。该分子在发挥作用的作用。该分子在发挥作用时，必须先有向导时，必须先有
36、向导RNA与与特定的特定的DNA发发生生 。催化。催化 断裂。若向导断裂。若向导RNA的的识别序列为识别序列为UCAGAAUC,则被切割的则被切割的DNA碱基序列碱基序列为为 。相比于早期基因工程的优。相比于早期基因工程的优点：点：。（2）CRISPR/Cas9系统广泛存在于原核生物，其存在的意义：系统广泛存在于原核生物，其存在的意义：。真核细胞中没有编码真核细胞中没有编码Cas9的基因，可以利用基因工程的方法建构的基因，可以利用基因工程的方法建构 ，将基因导入，将基因导入真核细胞，目的是真核细胞，目的是 ;.Cas9是在细胞中的是在细胞中的 合成的，而向合成的，而向导导RNA的合成需要的合成
37、需要 酶的催化。目标酶的催化。目标DNA编辑后重新连接需要编辑后重新连接需要 酶的链酶的链接。接。（1）向导）向导RNA(sgRNA)分子和分子和Cas9蛋白蛋白 限制酶限制酶 碱基互补配对碱基互补配对 磷酸二酯键磷酸二酯键 AGTCTTAG 可以人为选择目的可以人为选择目的DNA的切割位点，目的的切割位点，目的性强性强 （2）切割破坏外源）切割破坏外源DNA防止外源防止外源DNA的入侵的入侵 基因表达载体基因表达载体 使目的基因在受体细胞稳定存在并且使目的基因在受体细胞稳定存在并且遗传和表达遗传和表达 核糖体核糖体 RNA聚合酶聚合酶 DNA连接酶连接酶25.水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，
38、直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。（1）将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是_，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为_。（2）根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了_，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列_ (填：发生或不发生)改变，原因是_。（3）为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRN
39、A（Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是_。（4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为_，原因是_。【答案】【答案】(1).(1).限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNADNA连接酶连接酶 (2).(2).转化转化 (3).RNA (3).RNA聚合酶与启动子的识别和结合聚合酶与启动子的识别和结合 (4).(4).不不发生发生 (5).(5).编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 (6).(6).
40、逆转录（或：反转录）逆转录（或：反转录）(7).(7).引物是根据引物是根据WxWx基因的基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与一段已知序列设计合成的（或：引物能与WxWx基因的基因的cDNAcDNA特异特异性结合）性结合）(8).(8).品系品系3 (9).3 (9).品系品系3 3的的WxWx mRNA mRNA最少，控最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强最强v（1）反转录法（）反转录法（1分）（分）（2）基因的两条反向平行的链都做模板，其碱基序列不同（）基因的两条反向平行的链都做模板，其碱基序列不同（2分
41、）分）不同限制不同限制酶酶切位点（酶酶切位点（2分）分）复性（复性（1分）（分）（3）启动子（）启动子（2分）分）RNA聚合酶（聚合酶（1分）（分）（4）DNA疫苗注入体疫苗注入体内后内后,可能整合到宿主基因组上可能整合到宿主基因组上,导致细胞发生变异导致细胞发生变异,使细胞功能异常（使细胞功能异常（2分）分）.血管内皮生长因子血管内皮生长因子(VEGF)是在肿瘤细胞中通过表达，分泌到血液中的蛋白类生长因是在肿瘤细胞中通过表达，分泌到血液中的蛋白类生长因子，促进肿瘤血管的生成，进而为肿瘤组织生长提供足够的氧气和营养物质。研究人子，促进肿瘤血管的生成，进而为肿瘤组织生长提供足够的氧气和营养物质。
42、研究人员利用员利用pVAX1质粒和质粒和VEGF基因构建了基因构建了PVAX1VEGF的的DNA疫苗，为肿瘤免疫治疗疫苗，为肿瘤免疫治疗奠定基础。回答下列问题：奠定基础。回答下列问题：(1)首先从人的肺癌细胞株首先从人的肺癌细胞株A549中提取中提取mRNA，通过，通过 法获得法获得VEGF基因。基因。(2)对获取的对获取的VEGF基因进行基因进行PCR扩增前，需要根据扩增前，需要根据VEGF基因序列设计两种引物，其基因序列设计两种引物，其原因是原因是 。为便于。为便于VEGF基因与质粒基因与质粒pVAX1连接，引物中要增加适当的连接，引物中要增加适当的 。扩增时，每个循环一般需要经过扩增时，
43、每个循环一般需要经过“变性、复性、延伸变性、复性、延伸”三个过程，其中三个过程，其中 过程过程的温度设定是扩增成败的关键。的温度设定是扩增成败的关键。(3)构建的构建的PVAX1VEGF上应含有特定的上应含有特定的 (填填“复制原点复制原点”或或“启动子启动子”或或“标记基因标记基因”)，它能被受体细胞的，它能被受体细胞的 所识别，以便于催化转录过程。所识别，以便于催化转录过程。(4)DNA疫苗制备简单，价格低廉，且免疫强度高，应答持久，但同时也可能存在着疫苗制备简单，价格低廉，且免疫强度高，应答持久，但同时也可能存在着不可忽视的潜在危险。你认为可能存在的潜在危险是不可忽视的潜在危险。你认为可能存在的潜在危险是 。1.完成大本上完成大本上P278-282内容内容2.小本的习题小本的习题P371 基因工程基因工程3.三二三二 小本第小本第36讲基因工程讲基因工程 T1、2、3、6、7、8、9、12
