1、基因工程：是指按照人们的愿望，通过基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术转基因等技术，赋予生物，赋予生物新的遗新的遗传特性传特性，创造出更符合人们需要的，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品新的生物类型和生物制品。从技术操。从技术操作层面看，由于基因工程是在作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平分子水平上进行设计和施工的，因此上进行设计和施工的，因此又叫又叫 重组重组DNA技术技术1.操作环境：操作环境：2.原理：原理：3.操作对象：操作对象：4.操作水平：操作水平：5.结果：结果：体外环境体外环境基因基因分子水平分子水平基因重组基因重组赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们
2、需要赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品的新的生物类型和生物制品科技探索之路科技探索之路定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍6.意义意义：例1.人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质-胰岛素的理论基础是？（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是 。（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，原因是 。（3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为 。（4）遗传信息的传递都遵循 。(5)为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？。DNA中心法则基因的组成、空间结构和碱基互补配对方式相同所有生物
3、共用一整套遗传密码科技探索之路 基因是控制生物性状的独立遗传单位基因是控制生物性状的独立遗传单位 遗传信息的传递都遵循中心法则遗传信息的传递都遵循中心法则 生物界共同一套遗传密码生物界共同一套遗传密码 到社会中去到社会中去那么，科学家究竟用到了哪些那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具分子工具”？这些这些“分子工具分子工具”各具有什么特征呢？各具有什么特征呢？工具工具分子手术刀分子手术刀分子缝合针分子缝合针分子运输车分子运输车限制性内切核酸酶：限制性内切核酸酶：DNA连接酶：连接酶：载体：载体：准确切割准确切割DNA分子分子将将DNA片段连接起来片段连接起来将体外重组好的将体外重组好的DNA分子
4、导分子导入受体细胞入受体细胞（1）来源）来源:从微生物从微生物(主要是主要是原核生物原核生物)体内分离出来体内分离出来（2）功能）功能:能够识别双链能够识别双链DNA分子的分子的某种特定的核苷酸序列某种特定的核苷酸序列，并且使每一，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开，因此具有断开，因此具有专一专一性。性。1.限制酶限制酶一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具磷酸二酯键磷酸二酯键切点切点（3）切割部位：）切割部位：磷酸二酯键磷酸二酯键（消耗水）（消耗水）练习：练习：流感嗜血杆菌的流感嗜血杆菌的d菌株菌株(Haemophil
5、us influenzae d)中先后分离到中先后分离到3种限制酶，则分别命名为种限制酶，则分别命名为:Hind、Hind、Hind1.限制酶限制酶一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具限制酶存在于原核生物中的作用是什么限制酶存在于原核生物中的作用是什么?原核生物容易受到原核生物容易受到外源外源DNA的入侵的入侵限制酶的作用限制酶的作用:切割切割外源外源DNA,使之失效使之失效保证自身的安全保证自身的安全限制酶为什么不会剪切原核生物本身的限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA?DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列分子中不具备这种限制酶的识别切割序列,或者或者DNA分子被修饰（
6、甲基化），使限制酶不能将其切开分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开【思考【思考1】一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具1.限制酶限制酶（1）来源）来源:（2）功能）功能:（3）作用部位：）作用部位：（4）切割结果：）切割结果：黏性末端和平末端黏性末端和平末端1.限制酶限制酶一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具（大部分限制酶切割结果为黏性末端）EcoR识别的序列识别的序列切点切点切点切点切点切点EcoR5G-A-A-T-T-C33C-T-T-A-A-G5Sma5C-C-C-G-G-G33G-G-G-C-C-C5BamH5G-G-A-T-C-C33C-C-T-A-G-
7、G5Taq5T-C-G-A33A-G-C-T5反向对称重复排列的反向对称重复排列的回文序列回文序列能被限制酶特异性识别的切割部位：能被限制酶特异性识别的切割部位：一条链一条链从从5往往3读读的碱基顺序与另一条链的碱基顺序与另一条链从从5往往3读读的顺序完全一致。的顺序完全一致。1.限制酶限制酶一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具A.形成的黏性末端（从形成的黏性末端（从5往往3读）为读）为_B.一个限制酶切割一次断两个一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键磷酸二酯键形成形成_个黏性末端个黏性末端C.同一种限制酶切割形成的黏性末端同一种限制酶切割形成的黏性末端_D.两个黏性末端有两个黏性末
8、端有_个游离的磷酸基团个游离的磷酸基团AATT两两相同相同2重组重组DNA分子分子一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具请在两张纸上分别写上下面两段请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列，序列，找到两条片段上找到两条片段上EcoRI的识的识别序列和切割位点。别序列和切割位点。：重组重组DNA分子分子请在两张纸上分别写上下面两段请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列，序列，找到两条片段上找到两条片段上EcoRI的识的识别序列和切割位点。别序列和切割位点。：一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具重组重组DNA分子分子请在两张纸上分别写上下面两段请在两张纸上分别写上下面两段DNA
9、序列，序列，找到两条片段上找到两条片段上EcoRI的识的识别序列和切割位点。别序列和切割位点。：一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具限制酶切限制酶切质粒质粒一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具DNA连接酶连接连接酶连接一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具1.限制酶限制酶重组质粒重组质粒一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具1.限制酶限制酶1.限制酶限制酶1.限制酶限制酶颠倒180度1.限制酶限制酶颠倒180度【思考【思考2】用限制酶切割时需注意的事项用限制酶切割时需注意的事项(1)获取目的基因和切割载体时获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶
10、通常使用同种限制酶,目的是目的是_ 。但是使用该法缺点是容易发生。但是使用该法缺点是容易发生 _ ，为了避免上述，为了避免上述情况发生情况发生,可采取的措施是可采取的措施是_ _ .(2)获取一个目的基因需限制酶切割获取一个目的基因需限制酶切割 次次,共产生共产生 个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。为了产生相同的黏性末端，便于连接为了产生相同的黏性末端，便于连接两两4分别使用分别使用两种限制酶两种限制酶去去切割目的基因和运载体切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化目的基因、质粒的自身环化以及以及目的基因与质粒反向连接目的基因与质粒反向连接一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具
11、1.限制酶限制酶【思考3】用限制酶切割时需注意的事项(3)选择限制酶切割位点的基本原则：切割目的基因时：。切割质粒时：。能切下目的基因且不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选一.重组DNA技术的基本工具1.限制酶【例1】用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是 。构建重组质粒时，最好选择限制酶BamH、Hind处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。Sma会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因确保目的基因与质粒的定向连接一.重组DNA技术的基本工具1.限制酶 将将双链双链DNA片段片段“缝合缝合”起来，恢复起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的被
12、限制酶切开的两个核苷酸之间的磷磷酸二酯键酸二酯键，形成重组，形成重组DNA分子。分子。(1)作用作用:(2)分类分类种类种类Ecoli DNA连接酶连接酶T4 DNA连接酶连接酶来源来源功能特性功能特性相同点相同点大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体只能将只能将具有具有互补黏性末端互补黏性末端的的DNADNA片段片段连接起来连接起来，不能连，不能连接具有平末端的接具有平末端的DNADNA片段片段既可以连接双链既可以连接双链DNADNA片段互补的黏性片段互补的黏性末端，又可以连接双链末端，又可以连接双链DNADNA片段的平片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）末端（但连接平末端的效率相对较低）恢
13、复恢复的都是的都是磷酸二酯键磷酸二酯键一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具2.DNA连接酶连接酶 旁栏思考（旁栏思考（P72）：）：DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？聚合酶是一回事吗？为什么？DNA连接酶连接酶 DNA聚合酶聚合酶不需要模板不需要模板 需要需要DNA的一条链为模板的一条链为模板两个两个DNA片段之间片段之间 脱氧核苷酸和脱氧核苷酸和DNA片段之间片段之间连接成更长的连接成更长的DNA分子分子 形成形成DNA的一条子链的一条子链基因工程基因工程 DNA复制复制 不不同同点点 模板模板 作用部位作用部位 作用结果作用结果 用途用途 一一.重组重组DN
14、A技术的基本工具技术的基本工具2.DNA连接酶连接酶化学本质都是蛋白质化学本质都是蛋白质都是催化形成磷酸二酯键都是催化形成磷酸二酯键相同点相同点 资料资料1973年，美国科学家科恩（年，美国科学家科恩（S.Cohen)等等人从大肠杆菌中提取出了两种质粒，一种含有人从大肠杆菌中提取出了两种质粒，一种含有卡那霉素抗性基因，另一种含有四环素抗性基卡那霉素抗性基因，另一种含有四环素抗性基因。他们将这两种基因分别因。他们将这两种基因分别“切割切割”下来，并下来，并拼接在同一个质粒上，然后导入大肠杆菌，产拼接在同一个质粒上，然后导入大肠杆菌，产生了既抗卡那霉素又抗四环素的大肠杆菌。生了既抗卡那霉素又抗四环
15、素的大肠杆菌。一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体（1）质粒）质粒来源：来源于许多来源：来源于许多_ 等生物，它是一种裸露的、结构简等生物，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的之外，并具有自我复制能力的很小的 _ （化学本质），故质粒有（化学本质），故质粒有 个游离的磷酸基团个游离的磷酸基团氨苄青霉素抗性基因在质粒氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为上称为_ ，还有如：还有如：等；等；其作用是其作用是_ 。细菌和酵母菌细菌和酵母菌双链双链环状环状DNA分子分子0标记基因标记基
16、因用于鉴别用于鉴别和和筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体（1）质粒）质粒 复制原点：复制原点：_ 。DNA分子复制的起点分子复制的起点一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体 在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒天然质粒的的 基础上进行过基础上进行过人工改造人工改造的。的。细菌质粒是独立于细菌
17、拟核之外的细胞质细菌质粒是独立于细菌拟核之外的细胞质DNA分子，侵入宿主细胞后分子，侵入宿主细胞后 A.有的可以独立地进行自我复制有的可以独立地进行自我复制，B.有的则整合到宿主细胞染色体有的则整合到宿主细胞染色体DNA上，随着宿主上，随着宿主 细胞染色体细胞染色体DNA的复制而同步复制的复制而同步复制。（1）作用）作用:_（2）作为运载体需具备的条件作为运载体需具备的条件:_ _ _等等（3）种类种类将目的基因转移到受体细胞中去将目的基因转移到受体细胞中去利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制能够在宿主细胞中自我能够在宿主细胞中自我复制复制并
18、稳定并稳定保存保存 有有1个个至至多个多个限制酶切点，以便与限制酶切点，以便与外源基因外源基因连接连接具有标记基因具有标记基因（最好多个）（最好多个），便于进行便于进行筛选筛选对受体细胞无害对受体细胞无害一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体种类种类用途用途不同点不同点质粒、噬菌体质粒、噬菌体植物病毒植物病毒动物病毒动物病毒将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入植物细胞将外源基因导入动物细胞将外源基因导入动物细胞来源不同，在大小、结来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以构、
19、复制方式以及可以插入外源插入外源DNA片段的大片段的大小也有很大差别小也有很大差别（4）噬菌体的衍生物或某些动植物病毒作为运载体利用的原理是噬菌体的衍生物或某些动植物病毒作为运载体利用的原理是_ .病毒对宿主细胞的侵染具有一定病毒对宿主细胞的侵染具有一定的的 _ 性。性。利用病毒对宿主细胞的侵染性利用病毒对宿主细胞的侵染性物种特异物种特异【例【例2】若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是作为载体，其原因是 。噬菌体噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕噬菌体的宿主
20、细胞是细菌，而不是家蚕一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体霍乱弧菌中含有质粒，但霍乱弧菌中含有质粒，但 （填（填“能能”、“不能不能”）用来做载体，因）用来做载体，因为选择的载体应该为选择的载体应该 。对受体细胞无害对受体细胞无害不能不能（1）质粒与拟核中的）质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点）有哪些相同点：（至少写出两点）_ 。_ 。_ 。（2）质粒）质粒 （是（是/不是）一种细胞器。不是）一种细胞器。（3）细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别）细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别 化学本质不同：化学本质不
21、同：细胞膜上的载体：细胞膜上的载体：。基因工程中的载体可能是。基因工程中的载体可能是物质物质,如如_ ;也可是生物也可是生物,如如_ ；也可是；也可是噬菌体的衍生物。噬菌体的衍生物。功能不同：功能不同：细胞膜上的载体功能是细胞膜上的载体功能是_ ;基因工程中的载体是一种基因工程中的载体是一种“分子运输车分子运输车”,把把 _ .化学本质化学本质和和结构相同结构相同能够自我复制能够自我复制具有遗传效应具有遗传效应或或都能够指导蛋白质的合成都能够指导蛋白质的合成等等不是不是蛋白质蛋白质质粒质粒动植物病毒动植物病毒协助细胞膜控制物质进出细胞协助细胞膜控制物质进出细胞目的基因导入受体细胞目的基因导入受
22、体细胞【例【例3】辨析填空】辨析填空一一.重组重组DNA技术的基本工具技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；【解析：酶具有专一性，识别的序列相同解析：酶具有专一性，识别的序列相同】二.能力提升你能用DNA连接酶将他们连接起来吗？2和 ；3和 ；1和 ；4和 。7658旋转180度二.能力提升判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端是用同一种限制酶切割2 已知EcoR的识别序列和切点是GAATTC，BamH的识别序列和切点是GGATCCEcoRBamH
23、同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同；【解析：酶具有专一性，识别的序列不同解析：酶具有专一性，识别的序列不同】二.能力提升2 已知BamH的识别序列和切点是GGATCC，Sau3A的识别序列和切点是GATCBamHSau3A同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同,(也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配对连接成链）GCGCCGCG总结：产生相同的黏性末端不一定都是用同一种限制酶切割二.能力提升2 已知BamH的识别序列和切点是GGATCC，Sau3A的识别序列和切点是GATCBamH不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对连接Sau3
24、A总结：两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端二.能力提升【例4】在基因工程中，已知限制酶的识别序列和切点是GGATCC，限制酶的识别序列和切点是GATC。根据下图示判断下列操作错误的是()A.质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解C.限制酶和限制酶切割后获得的黏性末端相同D.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA连接酶连接的重组DNA还能用上面两种酶切割D一.重组DNA技术的基本工具【例5】某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别
25、序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是()a酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp)1600；1100；300800；300A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接C.a酶与b酶切断的化学键不相同D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，DTCTAGGAGATCC序列会明显增多一.重组DNA技术的基本工具用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，序列会明显 （增多、减少、不变）TCTAGGAGATCC增多总结：两种同尾酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不
26、存在，不能再被原来的限制酶识别二.能力提升【例6】若要用上图质粒和外源DNA构建重组质粒,需要对质粒进行改造,构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中需要使用的酶是（）A限制酶Pst、DNA连接酶、DNA聚合酶 B.限制酶EcoR、DNA连接酶、DNA聚合酶C.限制酶EcoR、限制酶Pst、DNA聚合酶D.限制酶Pst、限制酶EcoR、DNA连接酶B一.重组DNA技术的基本工具3.基因进入受体细胞的载体【例2】在DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在 DNA上定位，使其成为 DNA 分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶
27、Hind，BamH和二者的混合物分别降解一个 4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA 分子上的限制位点数目是以下哪一组？AHind1个，BamH2 个 BHind2个，BamH3个CHind2个，BamH1 个 DHind和BamH各有2 个二.能力提升A【例1】基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，已知BamH的识别序列和切点是GGATCC，Sau3A的识别序列和切点是GATC酶切结果：BamH，。Sau3A，。形成一个切口形成两个DNA片段使用 （限制酶）提
28、取目的基因Sau3A二.能力提升 1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是()A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端一、概念检测C练习与应用（P74）2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是()A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C.DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针一、概念检测A练习与应用（P74）二.拓展应用1.想一想
29、，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样,尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。练习与应用（P74）有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制
30、酶切spe进行切割，B片段分别用限制酶Hind,Xba、EcoR和Xho进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶Spel切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？xba。因为Xba与Spe 切割产生了相同的黏性末端二.拓展应用练习与应用（P74）（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？识别识别DNADNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如例如,我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的因的DNADNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。基因。二.拓展应用练习与应用（P74）
