1、城乡对口支援临床检验技术标准制定及培训Program of Urban and Rural Counterpart Support on Clinical Laboratory Technology Standard Development and TrainingELISA检测检测技术要点与常见问题技术要点与常见问题内内 容容v ELISAELISA的的概念概念 v 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验的反应原理及操作中注意事的反应原理及操作中注意事项项 v 常见问题原因分析及解决常见问题原因分析及解决v 结果的报告解释结果的报告解释ELISA的概念的概念 ELISAELISA属于标记免疫学技术
2、的一种，属于标记免疫学技术的一种，19711971年由荷年由荷兰和瑞典的学者提出，操作过程简单易行并可以兰和瑞典的学者提出，操作过程简单易行并可以定量，从而使其在免疫学检测中得到了广泛的应定量，从而使其在免疫学检测中得到了广泛的应用。用。ELISAELISA是一种免疫测定（是一种免疫测定（immunoassayimmunoassay，IAIA）。基础。基础:抗原抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性
3、或定量分析。检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。抗原抗体反应抗原抗体反应 可逆性可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：平衡，其反应式为：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗体的亲和力（抗体的亲和力（affinityaffinity），可以用平衡常数），可以用平衡常数K K表示：表示：K=AgK=AgAbAbAgAb,AgAgAb,AgAbAb的解离程度与的解离程度与K K值有关。值有关。高亲高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，
4、两者结合牢固，不易解离。适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。能保持原有的结构和活性。特异性特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。最适比例最适比例 敏感性敏感性化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测定法的敏感度约为酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml5
5、-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mlng/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可达，其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。常见问题常见问题ELISAELISA技术掌握不好技术掌握不好-较大的技术难题较大的技术难题 白白 板板 花花 板板 灰灰 区区 假假 阴阴 性性 假假 阳阳 性性白白 板板花花 板板均均 板板灰灰 区区竞争法竞争法ELISAELISA检验方法相关项目检验方法相关项目v乙肝抗原、抗体乙肝抗原、抗体v丙
6、肝抗体丙肝抗体v梅毒抗体梅毒抗体v艾滋抗体艾滋抗体-ELISA ELISA 常见类型常见类型1.1.双抗体夹心法（用于测抗原）双抗体夹心法（用于测抗原）HBsAgHBsAg2.2.间接法（用于测抗体）间接法（用于测抗体）HBsAbHBsAb3.3.竞争法（用于测小分子抗原竞争法（用于测小分子抗原/半抗原和抗体）半抗原和抗体）HBeAbHBeAb4.4.捕获法（用于测血清中某抗体的亚型）特异捕获法（用于测血清中某抗体的亚型）特异IgGIgG 钩状效应钩状效应 强阳性强阳性-假阴性假阴性方法：稀释后再测方法：稀释后再测特点：不易发现特点：不易发现避免：结果回顾、诊断提示、临床沟通避免：结果回顾、诊
7、断提示、临床沟通间接法的影响因素间接法的影响因素正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体对间接法的影响正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体对间接法的影响v假阳性假阳性v鉴别鉴别 结果回顾、诊断提示、临床沟通结果回顾、诊断提示、临床沟通v复检复检 必要时另一试剂盒复检必要时另一试剂盒复检小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点抗原的固相化既可以直接进行，亦可以通过相应特异抗体而间接固相化抗原的固相化既可以直接进行，亦可以通过相应特异抗体而间接固相化酶及底物酶及底物酶酶 底底 物物显色反应显色反应 测定波测定波长长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶
8、邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,2-2,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基-并并噻唑啉磺酸噻唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492492450450449449425425642642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400400500 500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄
9、色深蓝色深蓝色 405405420 420-半乳糖苷半乳糖苷酶酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光荧光黄色黄色 360,450360,450420420 对照设定对照设定 u 阳性对照品 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。u 阴性对照品 阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。ELISAELISA操作中的注意事项操作中的注意事项v 标本采集、保存v 试剂准备v 加样v 温育v 洗板v 显色v 比色v 结果判断v 溶血标本及混有红细胞的血清易产生假阳性,因溶血血清中含
10、有过氧化酶,造成假阳性v 受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,造成假阳性v 在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深,造成假阳性v EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性,造成假阴性v 标本凝固不全,形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果v 标本中有内源性干扰物,不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、交叉反应物质和其他物质等标本采集、保存试剂的准备试剂的准备v选择高质量的试剂是保证结果准确的关键选择高质量的试剂是保证结果准确的关键v室温平衡室温平衡v所用蒸馏水或去离子水应保证质量所用蒸馏水或去离子水应保
11、证质量试剂准备试剂准备 加加 样样 v 应将所加物加在ELISA板孔的底部。v 每次加标本应更换吸头。v 震荡充分混匀。v 从滴瓶中滴加试剂，要注意滴加角度和滴加速度。v 避免标本“交叉污染”问题。加样加样v温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）。v37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。v温育时间足够。v保温的方式一般采用水浴或电热块。v温育的温度和时间应按规定力求准确。保保 温温洗洗 板板v 分离游离的和结合的酶标记物v 洗板的方式：自动洗板仪；手工操作有浸泡式和流水冲洗式v 倾倒液体的方式 甩干孔内液体：应注意交叉污染和个人防护 吸干孔内液体：吸干应彻
12、底，可用水泵或真空 泵抽吸（推荐）如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。显色显色显色是ELISA中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。OPD底物显色一般在37反应20-30分钟。TMB约40分钟显色达顶峰。比比 色色 p加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀。p正确选择波长和参比波长。p酶标仪使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。结果判定结果判定v定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的简单回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。
13、v“阳性”表示该标本在该测定系统中有反应。v“阴性”则为无反应。v定性测定结果确定的依据在于阳性阴性判定值（Cut-off）的建立。v在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值。v 定量测定的结果判定是每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线，根据标本的吸光度值不同来确定待测物的浓度。v 在间接法和夹心法ELISA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。灰区概念v把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验
14、或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。v 酶标仪是垂直光路测定吸光度。垂直光的特点是样本吸光度受液体浓缩或稀释的影响小，不足之处是易受被测样本液面是否水平，酶标板透光性孔底是否平整等的影响较大。v 酶标仪在用单波长测定吸光度时，受到测定干扰（样本的浊度、干扰色等）、电路干扰（包括噪音、漂移、电压等）和液体表面张力的影响也很大。酶标仪单、双波长检测的比较酶标仪单、双波长检测的比较 v 双波长的测定时采用两个不同波长(测定波长450和参比波长630)同时测定一个样品的吸光度，它们的差值是样品相对准确的吸光度，这样就会减少了测定干扰和电路干扰。v 双波长差吸光度法具有可以克
15、服一些外界环境的影响共存组分吸收谱叠加的干扰，以及减少比色的光学不均一性等特点，吸光度在一定的范围内有良好的线性关系。v 双波长测定明显比单波长更适合于生物活性测定实验，其可以提高实验结果分析的准确度，减少实验误差。结果的解释结果的解释乙肝五项的结果解释乙肝五项的结果解释 1,3,5或或1,3 大三阳大三阳 1,4,5或或1,5 小三阳小三阳 全阴或全阴或Sb阳性阳性 除此之外一律复查除此之外一律复查v丙肝抗体丙肝抗体ELISA检测试剂现已发展至第三代试检测试剂现已发展至第三代试剂，第三代试剂的灵敏度和特异性比前两代试剂剂，第三代试剂的灵敏度和特异性比前两代试剂都高。第一代试剂利用来自都高。第
16、一代试剂利用来自HCV病毒基因组中病毒基因组中的部分的部分NS3和和NS4区重组表达抗原（区重组表达抗原（C100）作为固相包被进行检测；第二代试剂利用来自作为固相包被进行检测；第二代试剂利用来自HCV基因组基因组NS3区的区的C33C和部分和部分NS4区的融区的融合表达抗原（合表达抗原（C200）、再加上）、再加上C区的核心抗原区的核心抗原C22-3作为固相包被进行检测；第三代试剂在作为固相包被进行检测；第三代试剂在第二代抗原的基础上，又加入了来自第二代抗原的基础上，又加入了来自NS5区的区的重组表达抗原，另外，部分公司的产品中又引进重组表达抗原，另外，部分公司的产品中又引进了合成肽抗原。了
17、合成肽抗原。v初筛用的初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四试剂目前已经发展到第四代检测试剂。第一代试剂主要以病毒裂解物或部代检测试剂。第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，以检测血清中的分纯化的病毒抗原包被反应板，以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。假阳性率较高。第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用，特异合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用，特异性有了很大提高。第三代试剂使用双抗原夹心法性有了很大提高。第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗
18、体，进一步提高了敏感性。第四代试剂则检测抗体，进一步提高了敏感性。第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检抗原的检测，把测，把HIV抗原和抗抗原和抗P24的抗体同时包被反应的抗体同时包被反应板，可同时检测血清中的板，可同时检测血清中的HIV抗体和抗体和P24抗原抗原。梅毒螺旋体感染的免疫测定梅毒螺旋体感染的免疫测定 非特异性实验（类脂质抗原血清学实验）非特异性实验（类脂质抗原血清学实验）梅毒螺旋体在破坏机体组织的过程中，体内释梅毒螺旋体在破坏机体组织的过程中，体内释 放出一种心磷脂抗原，这种抗原可刺激机体产生放出一种心磷脂抗原，这种抗原可刺激机体产生相
19、应的抗体即反应素，其与牛心中提取的心磷脂相应的抗体即反应素，其与牛心中提取的心磷脂在体外可产生免疫结合反应。此类试验包括在体外可产生免疫结合反应。此类试验包括 VDRL,USR(显微镜观察显微镜观察)RPR,TRUST(肉眼观察肉眼观察)RPR主要用于治疗效果的监测。主要用于治疗效果的监测。v特异性试验特异性试验 梅毒螺旋体抗体检测主要包括梅毒螺旋体抗体检测主要包括 荧光密螺旋体抗体吸收试验荧光密螺旋体抗体吸收试验FTA-ABS、梅毒螺旋体血凝试验梅毒螺旋体血凝试验TPHA、梅毒螺旋体明胶凝集试验梅毒螺旋体明胶凝集试验TPPA和和ELISA。临床中常用的有临床中常用的有TPPA试验和试验和EL
20、ISA法。法。vTPPA结果的判定方法结果的判定方法 v反应图像判定粒子成纽扣状凝集，呈现出外周边反应图像判定粒子成纽扣状凝集，呈现出外周边缘均匀且光滑的圆形（缘均匀且光滑的圆形（-）v粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形（圆形（）v粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱地聚粒子环明显变大，其外周边缘不均匀且杂乱地聚集在周围（集在周围（+）v产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展（延展（+）HIV和和TP阳性结果的处理流程阳性结果的处理流程vTP阳性阳性s/co大于大于0.23，只能报可疑阳性同时，只能报可疑阳性同时需加做需加做TPPA实验。实验。TPPA实验阳性，进一步确定阳性报告。实验阳性，进一步确定阳性报告。TPPA实验阴性，有待分析。实验阴性，有待分析。vHIV阳性的上报程序阳性的上报程序 ELISA方法测定两次均阳性，填写方法测定两次均阳性，填写HIV阳性复检单，再抽一管血同时送疾控做确阳性复检单，再抽一管血同时送疾控做确证实验。证实验。初筛实验室没有资格出具阳性报告单，如初筛实验室没有资格出具阳性报告单，如需病例只能出具需病例只能出具待复检待复检字样，字样，阳性报告单阳性报告单只有也只能由疾控出具。只有也只能由疾控出具。谢谢！
