1、昆医分生蛋白质分子建模与设计昆医分生蛋白质分子建模与设计1（优选）昆医分生蛋白质分子建模与设计2Protein Folding occurs in the cytosol involves localized spatial interaction among primary structure elements,i.e.the amino acids may or may not involve chaperone proteins3Unrelated proteins assume similar structures to fulfill common functionsProtein
2、structure often provides clues about protein function引言引言在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外在人体的进化过程中蛋白质执行了在人体及体外的许多重要任务：的许多重要任务：酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；抗酶是催化化学反应的蛋白质或者核酸分子；抗体起到防护的作用体起到防护的作用;从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质从生态角度，蛋白质也是非常理想的物质:生物合成不需要消耗很多能量生物合成不需要消耗很多能量专一性很强专一性很强不产生副作用并且能很快降解不产生副作用并且能很快降解 5蛋白质没有像化学试剂那样被普遍应用，其原因蛋白质没有像
3、化学试剂那样被普遍应用，其原因:(1)(1)蛋白质分子量非常大蛋白质分子量非常大(10 000-1 000 000)(10 000-1 000 000)，不能通过化学方法生产不能通过化学方法生产;(2)(2)蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其蛋白质的功能是在生理条件下挥发的，在其它条件下它条件下(如在有机溶剂中如在有机溶剂中)是不稳定的是不稳定的;(3)(3)专一性致使其应用范围受到影响。专一性致使其应用范围受到影响。蛋白质应用受限的原因蛋白质应用受限的原因6蛋白质设计目前存在的问题蛋白质设计目前存在的问题1 1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及
4、明显的功能优越性明显的功能优越性2 2、三级结构的确定性较差、三级结构的确定性较差7RNase T1的结构改造是分于设计中的一个成功实例白质,并且已经成为检验蛋白质折叠理论和无论是从设计或合成看，是简单的；1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性异源专一性的计算机重新设计或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。删除一个或多个氨基酸残基；改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。二、蛋白质结构的从头设计抗DON单链抗体改体研究1建立
5、所研究蛋白质的结构模型Cutte成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的34肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。二、蛋白质结构的从头设计依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较；10Taq PCR Buffer 5 L2突变方法鉴定突变功能残基计算机模拟计算机模拟突变蛋白质产品突变蛋白质产品功能分析功能分析基因构建基因构建Pr 设计循环第
6、一节第一节 蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理8蛋白质分子设计的流程蛋白质分子设计的流程天然蛋白质天然蛋白质蛋白质结构预测蛋白质结构预测蛋白质晶体学蛋白质晶体学蛋白质三维结构蛋白质三维结构结结构与功能的关系构与功能的关系蛋白质突变体设计及结构预测蛋白质突变体设计及结构预测几何优化及蛋白质动力学研究几何优化及蛋白质动力学研究结果分析与原先的结构比较结果分析与原先的结构比较蛋白质合成定位突变蛋白质合成定位突变分离、纯化及表征分离、纯化及表征新蛋白质新蛋白质数据数据的输的输入入9Pr突变体设计的突变体设计的3个步骤个步骤利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的a
7、aaa利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构预测的结构与原始的预测的结构与原始的PrPr结构比较，利用结构比较，利用PrPr结构结构-功能或结构功能或结构稳定相关知识及理论计算机预测新稳定相关知识及理论计算机预测新PrPr可能具有的性质可能具有的性质10英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验(人源化抗体)VL(3)专一性致使其应用范围受到影响。occurs in the cytosol72 40 s，25个循环；制备感受态细胞无论是从设计或合成看，是简单的；5同源四聚体衍生物T2的X-射线结构（Ali et
8、 al.进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。T1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，热稳定性增加。different length二是在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质
9、进行分子设计工作。（一）定位突变的设计目标及解决方法二、蛋白质结构的从头设计从头设计的20个氨基酸残基的三股式折叠（Kortemme T,et al.occurs in the cytosol蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内核中残基的相互作用决定。从头设计的20个氨基酸残基的三股式折叠（Kortemme T,et al.v在上述的设计工作完成后，要进行合成或在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新求的新PrPr；vPrPr设计的成功与否，必须要有设计的成功与否，必须要有理论与实验理论与实验的紧密相结合的紧密相结合
10、11v在上述的设计工作完成后，要进行合成或在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新求的新PrPr；vPrPr设计的成功与否，必须要有设计的成功与否，必须要有理论与实验理论与实验的紧密相结合的紧密相结合 12 蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理内核假设内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内核中残基的相互作用决定。（内部十分白质内核中残基的相互作用决定。（内部十分保守的区域）保守的区域）PrPr内部都是密堆积内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子（很少有空穴大到水分子可以结合一个水分子或
11、惰性气体），没有重叠可以结合一个水分子或惰性气体），没有重叠13 所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧所有内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代溶剂键被蛋白质键所取代 疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。分布代表疏水效应的主表面及不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力要驱动力 蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理14金属金属PrPr中配位残基的替换要满足金属配位几中配位残基的替换要满足金属配位几何何。要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白。
12、要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。角以及整体的几何。对于金属对于金属PrPr，围绕金属中心的第二壳层中的，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。相互作用是重要的。氢键的第二壳层通常涉氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用。及与蛋白质主链的相互作用。蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理15 最优的最优的aaaa侧链几何排列侧链几何排列。PrPr侧链构象由空侧链构象由空间两个立体因素所决定间两个立体因素所决定(一是立体势垒，二一是立体势垒，二是是aaaa的位置的位置)结构及功能的专一性。结构及
13、功能的专一性。这是这是PrPr设计最困难设计最困难的问题的问题 蛋白质分子设计原理蛋白质分子设计原理16一、蛋白质分子设计的分类一、蛋白质分子设计的分类 设计的目的主要有两个：设计的目的主要有两个：一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计一是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案和指导性信息，如以此提高蛋白质的方案和指导性信息，如以此提高蛋白质的热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，热、酸稳定性，增加活性，降低副作用，提高专一性等；提高专一性等；17 二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋二是探索蛋白质的折叠机理，如简单蛋白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相白质骨架的从头设计是研究蛋白质内相互作用力的类型及
14、本质的很好途径，也互作用力的类型及本质的很好途径，也为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量为解决蛋白质折叠问题寻找定性和定量的规律。的规律。18（一）蛋白质分子设计的层次（一）蛋白质分子设计的层次 分为两个层次：分为两个层次：一是在蛋白质三维结构已知基础上的分一是在蛋白质三维结构已知基础上的分子设计子设计；二是在三维结构未知的情况下，借助一二是在三维结构未知的情况下，借助一级结构序列信息及生物化学性质进行分级结构序列信息及生物化学性质进行分子设计工作。子设计工作。19（二）蛋白质分子设计的分类（二）蛋白质分子设计的分类 1定点突变或化学修饰法定点突变或化学修饰法 2拼接组装设计法拼接组装设计法 3
15、从头设计全新蛋白质从头设计全新蛋白质20二、蛋白质分子设计的原则二、蛋白质分子设计的原则 1活性设计活性设计 2对专一性的设计对专一性的设计 3Scaffold设计设计(框架框架)4疏水基团与亲水基团需合理分布疏水基团与亲水基团需合理分布 5最优的氨基酸侧链几何排列最优的氨基酸侧链几何排列21白质,并且已经成为检验蛋白质折叠理论和（四）蛋白质中功能残基的鉴定基于天然蛋白质结构的分子设计有两类：利用蛋白质结构-功能或结构-稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；我们知道,蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制,而功能又与结构密切相关。0的琼脂糖电泳检测。VH如组合化学方法应用到蛋白质生物
16、合成不需要消耗很多能量Pr侧链构象由空间两个立体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置)如果能够找到构造蛋白质结构的方法,我们就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质,这就是蛋白质全新设计问题。依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。(A)-sheet barrel(红色)（二）全新蛋白质设计目标的选择非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。involves localized spatial interaction among primary structure el
17、ements,i.VH结构骨架模板、分级迭代算法插入一个或多个氨基酸残基；异源专一性的计算机重新设计溶菌酶结构溶菌酶结构 例如例如:鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子鸡卵清蛋白溶菌酶活性分子的设计过程中，其中的设计过程中，其中EFAEEAASF多肽能水解几丁质多肽能水解几丁质和葡聚糖，但糖苷酶活性较低。和葡聚糖，但糖苷酶活性较低。Cutte成功设计了一个具有明显成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的的核酸酶活性的34肽，该肽可水肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。其主要活性源于二聚体；而其主要活性源于二聚体；而天然核酸酶仅消化
18、天然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA，特别倾向于水解，特别倾向于水解polyC的的3端。端。22 设计步骤设计步骤蛋白质分子设计步骤图蛋白质分子设计步骤图修正设计修正设计获得目标蛋白质获得目标蛋白质序列合成序列合成检测检测结构信息分析结构信息分析建立结构模型建立结构模型设计目标设计目标蛋白质数据库蛋白质数据库23序列设计序列设计 设计设计螺旋时，应选择象螺旋时，应选择象Leu、Glu等易等易于形成于形成螺旋的残基；螺旋的残基；设计全设计全结构时，应选择结构时，应选择Val、Ile等易于等易于形成形成折叠片的残基；折叠片的残基；而在设计转角时常选择而在设计转角时常选择Pro-Asn
19、残基对。残基对。24第二节第二节 基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计基于天然蛋白质结构的分子设计有两类基于天然蛋白质结构的分子设计有两类：一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，一是进行蛋白质修饰或基因定位突变，即即“小改小改”；二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即二是进行蛋白质分子裁剪拼接，即“中中改改”。25一、定位突变 基于天然蛋白质结构的蛋白质分子基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改小改”是指对已知结构的蛋白质进行是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法
20、，主要可分为蛋白质修饰和基因定位法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。突变两类。26（一）定位突变的设计目标及解决方法（一）定位突变的设计目标及解决方法 定位突变常见的设计目标是提高蛋白质定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构行结构-功能关系的研究等。功能关系的研究等。27Hartley等于等于1986年完成了一个我们所要的年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法设计目标及解决的办法：热稳定性热稳定性 对氧化的稳定性对氧化的稳定性 对重金
21、属的稳定性对重金属的稳定性 pH稳定性稳定性 提高酶学性质提高酶学性质 引入二硫桥，增加内氢键数目，引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积改善内疏水堆积 把把CysCys转换为转换为AlaAla或或SerSer，把，把TrpTrp转换为转换为PhePhe或或TyrTyr 替代表面羧基，把替代表面羧基，把MetMet转换为转换为GlnGln、ValVal、IleIle或或LeuLeu 替换表面荷电基团，替换表面荷电基团，HisHis、CysCys以及以及TyrTyr的置换的置换 专一性的改变，增加逆转数，专一性的改变，增加逆转数，改变酸碱度改变酸碱度 28（二）定位突变的种类（二）定位突变的
22、种类 要进行基因定位突变，改变要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。直接修饰法、盒式突变技术等。根据基因突变的方式，分为以下三类：根据基因突变的方式，分为以下三类：插入一个或多个氨基酸残基；插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。替换或取代一个或多个氨基酸残基。要达到基因定位突变的目的，多采用体外要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组重组DNA技术或技术或PCR方法。方法。29（三）定位突变的程序（三）定位突
23、变的程序1建立所研究蛋白质的结构模型建立所研究蛋白质的结构模型 可以通过可以通过X射线晶体学、二维核磁共射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。构或其他结构预测方法建立起结构模型。302找出对所要求的性质有重要影响找出对所要求的性质有重要影响的位置的位置 在改造中如何恰当地选择突变残基在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。有的三维结构或分子模型。313预测突变体的结构 根据所
24、选定的氨基酸残基位点及突变后的根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较；预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较；利用蛋白质结构利用蛋白质结构-功能或结构功能或结构-稳定性相关稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质；同时利用能量优化及蛋白质动力学方法同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。基酸位点和突变后的氨基酸种类。324
25、构建突变体，获得突变体蛋白构建突变体，获得突变体蛋白 依据所设计好的突变，利用化学合依据所设计好的突变，利用化学合成或成或PCR等方法构建突变体。进行基因等方法构建突变体。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。332、三级结构的确定性较差3aa本实验将能够各自产生抗DON毒素和抗ZEN毒素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与DON和ZEN两种毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗体。研究蛋白质质折叠规律的重要手段。蛋白质全新设计不仅使我们有可能得到定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热
26、、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。二、蛋白质分子设计的原则蛋白质全新设计不仅使我们有可能得到能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或抗体复合物）称为双特异性单链抗体。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。2、三级结构的确定性较差（一）全新蛋白质设计程序1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。DON和ZEN抗体基因的提取 目的基因片段引物的设计74aa5同源四聚体衍生物T2的X-射线结构（Ali et al.1 2
27、 3 4 5 6 7 8VLT1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，热稳定性增加。白质,并且已经成为检验蛋白质折叠理论和T1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，热稳定性增加。5突变体蛋白质的检验 测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定测定新蛋白质的序列、三维结构、稳定性、催化活性等，性、催化活性等，并与对应
28、的天然蛋白质进行比较，检验并与对应的天然蛋白质进行比较，检验突变设计的效果，突变设计的效果，同时进一步修正设计方案。同时进一步修正设计方案。34蛋白质中功能蛋白质中功能残基的鉴定残基的鉴定根据结构信息根据结构信息确定残基的突变确定残基的突变突变方法鉴定突变突变方法鉴定突变功能残基功能残基利用蛋白质同源性利用蛋白质同源性鉴定功能残基鉴定功能残基（四）蛋白质中功能残基的鉴定（四）蛋白质中功能残基的鉴定351根据结构信息确定残基的突变 最有效最直接的方法最有效最直接的方法 Alan Fersht和和GregWinter等测定了酪氨酰等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该合成酶突变
29、体的三维结构，通过分析该酶的酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的的3羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。在结合腺苷酸部分的作用。362突变方法鉴定突变功能残基 通过引进另外一种突变来检测通过引进另外一种突变来检测 随机突变技术随机突变技术 删除分析及连接片段扫描突变删除分析及连接片段扫描突变 373利用蛋白质同源性鉴定突变功能残基 高度保守的残基与同源蛋白的共同功能高度保守的残基与同源蛋白的共
30、同功能以及维持结构有关以及维持结构有关。非保守残基是分析的靶位点，特别是对非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。于专一性研究。探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。定突变残基。38（五）定位突变的应用（五）定位突变的应用 RNase T1的结构改造是分于设计中的一的结构改造是分于设计中的一个成功实例个成功实例 T1核糖核酸酶含有核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的，日本大阪大学的Niskikawa等人在等人在Tyr24和和A
31、sn84位引入第位引入第三个二硫键，热稳定性增加。三个二硫键，热稳定性增加。39二、蛋白质分子拼接 例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原例如，有一种和癌症的发病有关的癌胚抗原CEA（Carcinoembryonic antigen），是由七），是由七个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，个大小和形状都非常相似的结构域拼接构成的，各结构域之间由柔韧性较大的各结构域之间由柔韧性较大的“铰链铰链”片段相片段相连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征连。研究发现，癌胚抗原的这种多结构域特征有利于它的细胞识别和粘合作用。有利于它的细胞识别和粘合作用。40而天然核酸酶仅消化polyC、polyU、p
32、olyA，特别倾向于水解polyC的3端。2、三级结构的确定性较差要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。M 1 2根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较；而天然核酸酶仅消化polyC、polyU、polyA，特别倾向于水解polyC的3端。Anti-DON gene改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化质折叠规律的认识还不够,所以蛋白质全新二、蛋白质结构的从头设计different length插入一个或多个氨基酸残基；（二）蛋白质结构的从头设计实例能识别两种抗
33、原并能与之结合的单链抗体（或抗体复合物）称为双特异性单链抗体。Anti-DON gene如组合化学方法应用到蛋白质Pr设计的成功与否，必须要有理论与实验的紧密相结合金属Pr中配位残基的替换要满足金属配位几何。VH 和VL的PCR扩增结果型异源四聚体的设计历程探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。白质,并且已经成为检验蛋白质折叠理论和英国剑桥大学的英国剑桥大学的Winter等人利用分子剪裁技术成等人利用分子剪裁技术成功地在抗体分子上作了实验功地在抗体分子上作了实验(人源化抗体人源化抗体)41（抗体工程)DON:小麦镰刀菌毒素小麦镰刀菌毒素42 GGGGSGGGGSGGGGS GGGGSG
34、GGGSGG GGGGSGGG GGGGS GGG VH VH VH VH VH VH VL VL VL VL VL VL43VHVHVHVHVHVHLinker 12aa VVVVVVLinkerLinker 3-12aa 3aaVVVVVHVHVHVH441pET20b(+)3716bporiAmpf1 originXXhhooI IE Ec co oR RI I Linker XhoSal ISalSalXho双酶切双酶切EcoRIXho双酶切双酶切EcoRISal I双酶切双酶切different length1pET20b(+)/DON-ScFv4464bporiAmpf1 orig
35、inVLVLLinkerLinkerVHVHXhoIXhoIEcoRIEcoRISalISalISalISalI连接连接 技术路线技术路线EcoRI45转 化筛选、检测 蛋白质的诱导生成 表达载体构建 感受态细胞的制备纯 化亲和力初步测定46 PCR扩增重链、轻链策略 Linker VH VLP3P4P5P6P7P8P1P247 PCR反应体系及反应条件50 L反应体系如下：10Taq PCR Buffer 5 LdNTP(2.5 mM)3 L Forward Primer(20 mM)1 LReverse Primer(20 mM)1 LTemple 1 L rTaq 0.3 L Add d
36、dH2O to a final volume of 50 L PCR循环条件为：94 5 min，1个循环；94 45 s，58 30s，72 45 s，31个循环；72 40 s，25个循环；72 7 min，1个循环。取PCR产物5 L，1.0的琼脂糖电泳检测。48 VH 和VL的PCR扩增结果 750015000100002500100250500750100020001000250500049 菌落PCR重组子验证 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 20001000750500250100200020001000100075075050
37、050025025010050 改体抗体在大肠杆菌改体抗体在大肠杆菌BL21BL21中的表中的表达及其纯化达及其纯化 1 2 3 4 5 6 7 897.4 KD66.2 KD42.7 KD31 KD51 改体抗体的改体抗体的ELISAELISA初步测定初步测定31245678910111252在上述的设计工作完成后，要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要求的新Pr；1建立所研究蛋白质的结构模型Xho EcoR Sal Nco 一、全新蛋白质设计方法Temple 1 L（一）全新蛋白质设计程序基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或
38、删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。T1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，热稳定性增加。1、与天然的蛋白质比较，缺乏结构的独特性及明显的功能优越性依据所设计好的突变，利用化学合成或PCR等方法构建突变体。白质,并且已经成为检验蛋白质折叠理论和Alan Fersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cy
39、s35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。（二）全新蛋白质设计目标的选择Add ddH2O to a final volume of 50 LTemple 1 L能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或抗体复合物）称为双特异性单链抗体。3aa如组合化学方法应用到蛋白质PCR扩增Anti-DON基因单链抗体单链抗体 抗体：是体液免疫应答的主要效应分子。由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）组成。53 单链抗体（scFv）：抗体可变区的重链（VH）与轻链
40、（VL）通过一段约15-25个氨基酸残基构成的弹性短肽（Linker）相连，融合表达出来的抗体片断。54双特异性单链抗体双特异性单链抗体 能识别两种抗原并能与之结合的单链抗体（或抗体复合物）称为双特异性单链抗体。本实验将能够各自产生抗DON毒素和抗ZEN毒素的单链抗体基因，连接融合，表达出能同时与DON和ZEN两种毒素抗原特异性结合的双特异性单链抗体。玉米赤霉烯酮玉米赤霉烯酮(ZEN)55技术路线技术路线 DON和ZEN抗体基因的提取 目的基因片段引物的设计 PCR扩增目的片段 制备感受态细胞 酶切目的片段、载体，linker连接 转化连接产物 酶切验证重组子 表达、纯化蛋白56载体的构建载体
41、的构建1pET-32a(+)5900bpf1 originAmptrxAlacoriXho INco I1重 组 子7500bpDONZENtrxAlacoriAmpf1 oriAnti-ZEN geneAnti-DON gene Xho EcoR Sal Nco 连 接 Linker57PCR扩增扩增Anti-DON基因基因 1 2 M20001000(bp)800 bp75025010050058PCR扩增扩增Anti-ZEN基因基因 M 1 220001000750500250100(bp)750 bp59重组验证重组验证60PCR验证验证以重组质粒为模板，进行Anti-DON基因的PC
42、R分析。61取PCR产物5 L，1.Alan Fersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。与数目达到最大；一、全新蛋白质设计方法稳定相关知识及理论计算机预测新Pr可能具有的性质（一）定位突变的设计目标及解决方法插入一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。5突变体蛋白质的检验3、评价：使用特定的评分系统将构建的分子与活性位点的匹配性进行排序，可以选择其中优良的结果作为
43、合成实验的对象。Cutte成功设计了一个具有明显的核酸酶活性的34肽，该肽可水解下列底物，但活性依次降低：polyC、polyA、polyU、polyG。VL最优的aa侧链几何排列。T1核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，这个天然酶有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys100，日本大阪大学的Niskikawa等人在Tyr24和Asn84位引入第三个二硫键，热稳定性增加。酶切目的片段、载体，linker连接T2异源四聚体衍生物hetT1的X-射线结构(Ali et al.最优的aa侧链几何排列。改体抗体在大肠杆菌BL21中的表达及其纯化如果能够找到构造蛋白质结构的方法,我们就能得到具
44、有任意结构和功能的全新蛋白质,这就是蛋白质全新设计问题。如组合化学方法应用到蛋白质（一）蛋白质分子设计的层次双特异性抗体的表达双特异性抗体的表达62 我们知道我们知道,蛋白质的空间结构受其氨蛋白质的空间结构受其氨基酸序列控制基酸序列控制,而功能又与结构密切相关。而功能又与结构密切相关。如果能够找到构造蛋白质结构的方法如果能够找到构造蛋白质结构的方法,我们就能得到具有任意结构和功能的全新我们就能得到具有任意结构和功能的全新蛋白质蛋白质,这就是蛋白质全新设计问题。这就是蛋白质全新设计问题。第三节 全新蛋白质设计63 蛋白质从头设计概念蛋白质从头设计概念 从头设计能够根据生物分子的活性从头设计能够根
45、据生物分子的活性位点特征产生一系列的结构片段，通位点特征产生一系列的结构片段，通过连接这些结构片段可以构成一个全过连接这些结构片段可以构成一个全新分子；或者在结合腔内对一个已知新分子；或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。的结构骨架进行化合物的衍生化。从头设计方法可以生成全新的分子从头设计方法可以生成全新的分子结构。结构。64全新蛋白质设计包括全新蛋白质设计包括 一、全新蛋白质设计方法一、全新蛋白质设计方法 二、蛋白质结构的从头设计二、蛋白质结构的从头设计65 全新蛋白质设计过程全新蛋白质设计过程设计目标设计目标序列生成序列生成结构预测结构预测合成合成构建模型构建模型检测检测6
46、6（一）全新蛋白质设计程序模拟 分析 设计 实验 一、全新蛋白质设计方法一、全新蛋白质设计方法67（二）全新蛋白质设计目标的选择 依据设计的目的可以分为依据设计的目的可以分为：从头结构设计从头结构设计 从头功能设计从头功能设计 68从头结构设计从头结构设计 中心问题：中心问题：稳定及独特的三维结构稳定及独特的三维结构 序列；序列；基本障碍：基本障碍：线性聚合构象熵；线性聚合构象熵；解决方法：（解决方法：（1）使相互作用的强度）使相互作用的强度 与数目达到最大；与数目达到最大；（2）共价交叉连接。）共价交叉连接。69从头设计方法包含的步骤从头设计方法包含的步骤1 1、活性位点分析：对结合位点的具
47、体的化学信活性位点分析：对结合位点的具体的化学信息进行扫描、分析和归类。这些信息的三维空息进行扫描、分析和归类。这些信息的三维空间相互关系都必须充分考虑。间相互关系都必须充分考虑。2 2、配体分子构建：采用不同的片段选择和分子、配体分子构建：采用不同的片段选择和分子构建方法，产生相应的分子结构。构建方法，产生相应的分子结构。3 3、评价：使用特定的评分系统将构建的分子与、评价：使用特定的评分系统将构建的分子与活性位点的匹配性进行排序，可以选择其中优活性位点的匹配性进行排序，可以选择其中优良的结果作为合成实验的对象。也可以将之做良的结果作为合成实验的对象。也可以将之做新一轮计算的起点进行进一步的
48、优化。新一轮计算的起点进行进一步的优化。70二、蛋白质结构的从头设计（一）蛋白质结构的从头设计原则（一）蛋白质结构的从头设计原则 1二级结构的设计原则二级结构的设计原则 螺旋螺旋 折叠片折叠片 转角转角 2超二级结构和三级结构的设计原则超二级结构和三级结构的设计原则71(1)蛋白质分子量非常大(10 000-1 000 000)，不能通过化学方法生产;Pr侧链构象由空间两个立体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置)（二）蛋白质结构的从头设计实例根据基因突变的方式，分为以下三类：非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的aa稳定相关知识及理论计算机
49、预测新Pr可能具有的性质二、蛋白质分子设计的原则Add ddH2O to a final volume of 50 L,1996,1998)；把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或TyrVLGGGGSGGGGSGG进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。进行基因测序验证突变体后，将突变体进行表达，纯化蛋白质，获得所设计的新蛋白质。利用能量优化及动力学方法预测修饰后的蛋白质结构VLVLVL生物合成不需要消耗很多能量或者在结合腔内对一个已知的结构骨架进行化合物的衍生化。螺旋螺旋(PHPPH)(Leu、Glu、Met)C端：端：aa+N端：端：aa
50、-72折叠片折叠片(HPHPH或PHPHP，5-10aa)73转角（转角（Pro、Gly中断中断螺旋，螺旋，Glu中断中断折叠）折叠）74蛋白质的几种超二级结构蛋白质的几种超二级结构、-、-75从头设计的三股式从头设计的三股式折叠折叠 从头设计的从头设计的20个氨基酸残基的三股式个氨基酸残基的三股式折折叠（叠（Kortemme T,et al.1998）（二）蛋白质结构的从头设计实例（二）蛋白质结构的从头设计实例结构骨架模板、结构骨架模板、分级迭代算法分级迭代算法76 型异源四聚体的设计历程型异源四聚体的设计历程 结构域替换寡聚化策略 异源专一性的计算机重新设计(A)23个氨基酸自动折叠成的锌
