1、纤纤维素酶发酵维素酶发酵汪其林维素酶发酵维素酶发酵纤维素酶是一类能水解纤维素成简单糖的复合酶，它主要包括葡聚糖内切酶（EG）、葡聚糖外切酶（CBH）和-葡萄糖苷酶（BG）。三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化纤维素酶的分离纯化三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化以稻草粉和麸皮为主要原料，对白腐菌（White-rot fungi）NS75、黑曲霉（Aspergillus niger）NS83 和絮凝酵母（Saccharomyces cerevisiae）SP5 混合菌固态发酵产纤维素酶进行研究单菌发酵生产的纤维素酶存在个别酶活低和酶系不完整的缺陷。如，绿色木霉以及其
2、近源的菌株发酵生成的纤维素酶中普遍存在着-葡萄糖苷酶偏低的缺陷。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化来自不同菌株的纤维素酶酶系不一样，通过混合菌发酵培养能够弥补菌株间的不同，生成各种有着不一样功能的混合酶，它们可以通过作用在纤维素的不同位点来发挥各种酶之间的协同作用，从而可以大幅度的提高纤维素酶的活性。黑曲霉产-葡萄糖苷酶能力较高，但产内切和外切葡聚糖酶能力较低；白腐菌产内切酶能力较高。选用白腐菌NS75和黑曲霉NS83 在稻草粉、麸皮为主要培养基的基础上进行固态混菌发酵生产纤维素酶三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化在白腐菌和黑
3、曲霉混合发酵产纤维素酶的基础上，接入絮凝酵母消耗发酵过程中酶解形成的纤维二糖、葡萄糖等简单糖对多菌固态发酵产酶的作用，实验考察了三菌混合发酵产纤维素酶的能力和主要酶种活力，并对发酵条件进行优化。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化1.固态发酵培养将在斜面上培养 2-5d 的白腐菌、黑曲霉菌和絮凝酵母菌，分别制成约 107个/mL 的孢子或细胞悬浮液。分别取 1mL 接于 50mL 液体种子培养基中，于30、200r/min 培养 24h，白腐菌和黑曲霉双菌发酵接种 6mL 于含有 10g 固态发酵培养基的 250mL 的广口瓶中；三菌混合发酵则保持接种总量 6m
4、L，白腐菌：黑曲霉：絮凝酵母按 1:2:1.5（v/v/v）比例接种，接种后搅拌均匀，30恒温培养 5-7d，单因素实验每组 3 个平行。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化2.单菌、双菌与三菌混合发酵产酶情况对比单菌发酵分别将 6mL 白腐菌或黑曲霉孢子液接入到装有 10g 稻草粉、麸皮发酵培养基的 250mL 广口瓶中；双菌混合发酵则将白腐菌孢子液和黑曲霉孢子液按 1:2 体积比接种；三菌混合发酵则以白腐菌：黑曲霉：絮凝酵母按 1:2:1.5体积比接种，接种总量保持 6mL。接种搅拌均匀后放于培养箱中 30恒温培养发酵 8d，从第 3 天开始每天取平行样三瓶
5、，分别检测其 CMCase 酶和-G 酶活。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化黑曲霉NS83 产-G 酶能力较强，在培养第 5 天时酶活达到 15254U/g，但产 CMCase 较弱，酶活为 7063U/g。白腐菌NS75 产 CMCase 能力较强，在培养第 5 天时酶活达到 11188U/g，但产-G 酶能力较弱，酶活为 6991U/g。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化双菌培养时在第 5 天酶活达到峰值，其 CMC 酶活为 17894 U/g，-G 酶活为 22325U/g，比单菌发酵有明显提高三菌混合培养时，在第 7
6、 天酶活达到峰值，其 CMCase 酶活和-G 酶活分别为 30099U/g和 54326U/g；相较单菌、双菌发酵，三菌混合发酵产生的纤维素酶酶活更高，发酵产酶时间延长，且比较稳定三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化其原因可能是接入絮凝酵母混合发酵后，消耗了可发酵的简单糖，有助于降低培养基中葡萄糖、纤维二糖等对发酵菌纤维素酶合成代谢的反馈抑制作用，使得产酶菌处于更有利的环境下生长和代谢产酶。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化2.变温控制混合菌按白腐菌：黑曲霉：絮凝酵母=1:2:1.5 比例接种，接种总量 6mL。采用变温发酵，
7、考查温度对混合菌发酵产酶的影响。实验温度控制按以下 5 种方式进行：先 303 天后 284 天先 304 天后 283 天，先 303 天后 354 天先 304 天后 353 天一直 30培养 7 天，检测测酶活，结果如图三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化温度控制方式所产的纤维素酶活较高，即温度一直保持在 30时酶活较高。表明温度震荡可能是对白腐菌、黑曲霉和絮凝酵母协同发酵产纤维素酶产生不利影响。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化3.混合菌接种比例对产酶的影响接种比例为 1:2:1.5 时，发酵产纤维素酶活相对较高。原因可
8、能是在接入絮凝酵母混合发酵后，消耗了可发酵的简单糖，从而降低培养基中葡萄糖、纤维二糖等对发酵菌纤维素酶合成代谢的反馈抑制作用，且黑曲霉在接入絮凝酵母消耗简单糖解除反馈抑制作用后的环境中更易生长和产酶。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化4.絮凝酵母接入时间对混合菌发酵产酶的影响发酵实验培养开始时先按 1:2 体积比例接入白腐菌 NS75 和黑曲霉 NS83 孢子液，絮凝酵母种子液按 1.5 体积比（总体积保持 6mL）分别以 4 个发酵时间点接入：培养 0 天后接入絮凝酵母，培养 1 天后接入絮凝酵母，培养 2 天后接入絮凝酵母，培养 3 天后接入絮凝酵母。于
9、30静止培养 7 天，分别检测酶活。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化在白腐菌和黑曲霉固态发酵 2 天后接入絮凝酵母发酵产纤维素酶酶活明显高于其他时间接入的纤维素酶发酵酶活；与时间点接入相比，可能因絮凝酵母接入早，且简单糖吸收代谢能力强，生长快，消耗了培养基中的营养成分而影响白腐菌和黑曲霉的前期菌体生长和产酶代谢，导致整个发酵过程产酶活力下降；在第个时间点接入絮凝酵母，此时可能发酵培养基中白腐菌和黑曲霉菌丝已长成，并且逐渐代谢纤维素酶和出现纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖等简单糖产生对菌体发酵产纤维素酶的反馈抑制作用，接入絮凝酵母菌只对发酵过程的后期发挥抑制解除作
10、用，总体效果以时间点接入絮凝酵母为好。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化5.料水比对混合菌发酵产酶的影响实验在稻草、麸皮固料为 10g 的基础上，料水比按 1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3 的比例加入 Mandels 营养液，混合搅拌均匀，接种后于 30恒温培养 7d，分别检测酶活，考查含水量对混合菌发酵产酶的影响。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化当料水比在 1:2 时，CMCase 酶活和-G 酶活都较高，说明混合菌发酵过程中，水分会影响菌体生长和酶的产生，水分过少或过多都不利。水分过多，会影响透气性，使培养
11、基内部供养和散热困难，影响菌体生长和产酶；水分过少，则可能满足不了菌种正常生长和代谢产酶的生理需要。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化6.稻草粉麸皮质量比对混菌发酵产酶的影响实验保持稻草、麸皮固料总量为 10g，稻草粉和麸皮质量比按 8:2、7.5:2.5、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8 加入，接种后，于 30培养 7 天，检测酶活。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化稻草粉和麸皮质量比为 8:2 时，混合菌的产酶能力比较好。这样的原因可能和稻草粉、麸皮的组成成分有关。麸皮中含有氧化酶、淀粉酶、蛋白质、维生素等物
12、质，可以有利于菌体的生长；而稻草主要是含有木质素、果胶、纤维素等物质，这些物质不利于菌体很好的利用，但是稻草所含的纤维素物质能作为诱导剂来诱导菌体生成纤维素酶。少量的麸皮可以使菌体的前期生长较好，而大量的稻草却可以诱导菌体在中后期产生酶，当稻草粉和麸皮质量比为 8:2 时，CMCase 酶活达到 25690U/g，-G 酶活达到 59814U/g。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化7.三菌混合固态发酵产酶条件优化在单因素实验的基础上，对变温控制、混合菌接种比例、絮凝酵母接入时间和料水比进行4 因素3 水平正交设计实验，分别测定CMCase 酶活和-G 酶活，分
13、别以 CMCase 酶活和-G 酶活为考察指标优化产酶条件三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化发酵产酶最优实验组为第 4 组，即温度为 30，接种比为 1:2:1.5，培养 2 天后接入絮凝酵母，料水比为 1:2。和极差分析得到的优化组合 A2B1C2D3相符合，在这个组合下 CMCase 酶活达到 30241U/g，-G 酶活为 62305U/g。各个培养条件对混合菌发酵产 CMCase 酶的影响顺序为：温度料水比菌种比絮凝酵母接入时间；而对产-G 酶的影响顺序为：温度菌种比料水比絮凝酵母接入时间。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化
14、件优化三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化CMCase 酶活和-G 酶活为优化考查值所得的发酵产酶最优条件一致，为温度为 30，接种比为 1:2:1.5，培养 2 天后接入絮凝酵母，料水比为 1:2。由表 2.8、2.9 可以看出，温度（A）对混合菌产酶的影响显著。选择温度为 30，接种比为 1:2:1.5，培养 2 天后接入絮凝酵母，料水比为1:2 为混菌固体发酵条件，对正交实验的结果进行验证，所得的三组平行实验的CMCase 酶活分别为 30150U/g、30165 U/g 和30305U/g，平均值为 30206U/g。-G酶活分别为 62954U/g、6
15、1878U/g 和 62095U/g，平均值为 62309U/g。与正交实验直观分析所得最优条件所得值 CMCase 酶活 30241U/g 和-G 酶活 62305U/g十分接近。三菌混合固态发酵产纤维素酶条三菌混合固态发酵产纤维素酶条件优化件优化8.优化结果（1）选取白腐菌 White-rot fungi NS75，黑曲霉 Aspergillus niger NS83 及絮凝酵母 Saccharomyces cerevisiae SP5 进行混合菌发酵培养，通过单因素实验以及正交实验优化，混合菌发酵生产纤维素酶的最佳培养条件为：温度 30，接种比为 1:2:1.5，培养 2 天后接入絮凝酵母，料水比为 1:2。此条件下 CMCase酶活达到 30241U/g，-G 酶活为 62305U/g。（2）从正交实验的结果分析中看出，影响混合菌产酶最显著的因素是温度，因此，在发酵过程中要注意控制好温度。纤维素酶的分离纯化纤维素酶的分离纯化目前，更多的是用真菌来生产纤维素酶，产生的大多是胞外酶。因此，工业上纤维素酶粗酶制剂的分离常采用沉淀、盐析、离心、干燥等方式。分析研究采用的分离主要是超滤、分级沉淀、层析、电泳法、色谱法等方法纤维素酶的分离纯化纤维素酶的分离纯化
