1、包装饮用水中包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测铜绿假单胞菌的检测主要内容检测背景铜绿假单胞菌的致病性铜绿假单胞菌的检测v目前空气、河流、土壤污染严重，每年有260万人死于癌症。v云南铬矿、湖南镉大米、宿迁儿童血铅超标，大运河的水质与二十年前也没法相比v污染的严重，使人们渴望喝到干净的水，越多的人开始选择瓶装水。一、检测背景 国内污染情况：-瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.223.6；-瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6。国外污染情况：-Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌；-Rosenberg报告德国1.210.2的瓶装矿泉水检出铜绿假单胞菌。一、检测背景WHO
2、在HACCP的评估中明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶装水很可能导致疾病的发生。普通人食入103104个菌体细胞即可被侵害。一、检测背景2014年新出台的食品安全国家标准GB19298-2014包装饮用水其中微生物指标中：删除了菌落总数指标；保留了大肠菌群；增加了铜绿假单胞菌这一指标。国家标准要求：0 CFU/250ml一、检测背景二、铜绿假单胞菌的致病性 铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌为条件致病菌条件致病菌，是医院内感染的主，是医院内感染的主要病原菌之一。要病原菌之一。可引起局部化脓性可引起局部化脓性炎症炎症
3、，也可引起中耳炎、，也可引起中耳炎、角膜角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内膜炎炎、尿道炎、胃肠炎、心内膜炎 ，还可引起败，还可引起败血症菌血症及婴儿流行性腹泻血症菌血症及婴儿流行性腹泻。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者或术后患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者或术后治疗的患者易感染本菌。治疗的患者易感染本菌。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。主要致病物质是主要致病物质是内毒素内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、，此外尚有菌毛、荚膜、胞外酶和胞外酶和外毒素外毒素等多种致病因子。等多种致病因子。铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）俗称绿脓杆菌，因为在代谢过程中产
4、生水溶性的绿色色素，使伤口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。无芽孢，无夹膜，革兰氏染色后为红色，革兰阴性杆菌，有单鞭毛或丛鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.51m1.53.0m，菌体笔直或弯曲。铜绿假单胞菌的菌体形态三、铜绿假单胞菌的检测（一）检测方法（滤膜法）（二）检测原理（三）试剂和设备（四）检测步骤（五）报告（一）铜绿假单胞菌检测方法（滤膜法）GB/T 8538-2008 GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法饮用天然矿泉水检验方法 v铜绿假单胞菌的特性：v需氧菌，营养要求不高，产色素(主要为绿脓素)v90 以上的菌株产生蓝绿色色素。v 98 菌株产生水溶性荧光色素。v 氧化酶试验
5、呈阳性。v分解乙酰胺产生氨。（二）检测原理 将将250mL250mL水样用孔径为水样用孔径为0.45m0.45m的滤膜过滤，的滤膜过滤，并将滤膜移至并将滤膜移至CNCN琼脂选择性培养基上琼脂选择性培养基上，于，于3636士士11恒温箱中培养恒温箱中培养48h48h，典型典型菌落菌落能够在能够在CNCN琼脂选择琼脂选择性培养基上生长并产生性培养基上生长并产生绿脓菌素绿脓菌素，或者能够在，或者能够在CNCN琼琼脂选择性培养基上生长并且脂选择性培养基上生长并且氧化酶呈阳性氧化酶呈阳性、紫外光紫外光（36036020nm20nm）照射下能产生照射下能产生荧光荧光、能够利用能够利用乙酰乙酰胺产氨胺产氨的
6、革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为单胞菌，则其检测结果为阳性阳性。（二）检测原理 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂 营养琼脂 金氏B 培养基 乙酰胺肉汤 氧化酶试剂 钠氏试剂（三）试剂和设备1、检测试剂1、检测试剂2、检测材料2、检测材料玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121高压蒸汽灭菌15min恒温培养箱：361紫外灯：波长应为36020nm滤膜：直径47mm，微孔径为0.45 显微镜：10100冰箱：083、设备和仪器（四）检测步骤1.检验程序2.水样过滤3.培养4.结果观察5.确证性试验6.计数7.结果报告蓝/绿色菌落铜绿假单胞
7、菌阳性铜绿假单胞菌阳性铜绿假单胞菌阳性红褐色菌落1.检验程序v在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通 过孔径0.45m的滤膜过滤，然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。2、水样过滤水样过滤3.培养将平板置于将平板置于3636士士11恒温箱中培养恒温箱中培养48h48h，并防止干燥。并防止干燥。培养20h24h观察滤膜上菌落的生长情况并计数，防止因为培养导致菌落过分生长而出现菌落融合。（40h48h时更容易观察产色素情况和荧光情况）。4
8、、结果观察ATCC27853ATCC27853阳性对照菌株结果观察阳性对照菌株结果观察24h24h培养结果（阳性）培养结果（阳性）ATCC25922ATCC25922阴性对照菌株结果观察阴性对照菌株结果观察24h培养结果（阴性）培养结果（阴性）ATCC27853ATCC27853阳性对照菌株结果观察阳性对照菌株结果观察48h培养结果（阳性）培养结果（阳性）菌落融合菌落融合ATCC25922ATCC25922阴性对照菌株结果观察阴性对照菌株结果观察48h培养结果（阴性）培养结果（阴性）在在CNCN琼脂上生长的菌落选择和验证步骤琼脂上生长的菌落选择和验证步骤备注：备注：NTNT表示不用测试。表示不
9、用测试。荧光观察v紫外光（紫外光（36036020nm20nm）进行进行照射照射5.确证性试验（1）营养琼脂纯化（2）氧化酶试验（3）金氏B培养（4）产氨试验（1）营养琼脂纯化 将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培养基上，于361培养 20h24h，对可疑菌落进行纯化。（2）氧化酶试验将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验，取23滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。阴性阴性阳性阳性（3）金氏B培养v将纯化后呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏B培养基上于361培养 24h5d
10、。每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将5d内产生荧光的菌落记录为阳性。（3）金氏B培养日光下观察荧光下观察阳性阳性阴性阴性阳性阳性阴阴性性（4）产氨试验v将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在361下培养20h24h。然后向每支试管培养物加入12滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。（4）产氨试验未加入钠氏试剂阳性阳性加入钠氏试剂阴阴性性阴阴性性阳性阳性阴阴性性深黄色深黄色到到砖红色砖红色6.计数 计数滤膜上产绿脓色素的菌落以获得铜绿假单胞菌的数量。在紫外灯下产生荧光且在乙酰胺肉汤中产氨的所有菌落证实为铜绿假单胞菌，并进行计
11、数。将氧化酶反应阳性、乙酰胺肉汤产氨、金氏B培养基上显荧光的红褐色菌落进行计数。菌落计数公式：NPF(CF/nF)R(CR/nR)P 呈蓝/绿色的菌落数；F 没有绿脓色素但显荧光的菌落数；R 呈红褐色的菌落数；nF 进行产氨测试的显荧光菌落数；CF 产氨阳性的显荧光菌落数；nR 进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数；CR 产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。7.结果说明v计算举 例 N=20+15(2/5)+10(3/5)=32 20：呈蓝/绿色的菌落数；15：没有绿脓色素但显荧光的菌落数；2：产氨阳性的显荧光菌落数；5：进行产氨测试的显荧光菌落数
12、；10：呈红褐色的菌落数；3：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数；5：进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。结果以 CFU/250ml计。国家标准要求：0 CFU/250ml注意：若样品污染严重，建议对样品进行稀释，如10倍递增稀释：取30ml样液加入 至270ml无菌生理盐水中，混匀，以此类 推，进行系列稀释。（五）报告v铜绿假单胞菌虽然可由多种途径传播，但主要是通过污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性感染。v1：2000的新洁尔灭，1：5000的消毒净在5分钟内均可将其杀死。0.5-1%醋酸也可迅速使其死亡。青霉素对此菌无效。v因此，医院
13、对烧伤病房、手术器械及治疗器械进行严格消毒灭菌，可保证无铜绿假单胞菌的污染。v一般情况下，铜绿假单胞菌经过水源水消毒、管道消毒和臭氧消毒后，其活力大大降低，基本检测不出铜绿假单胞菌。v福建某市桶装天然矿泉水铜绿假单胞菌超标，到处查找原因，最后发现是蓄水池水（原始污染源）中含有大量铜绿假单胞菌。停用了蓄水池的水，产品结果变正常。v如发现污染，请查找污染源，消除污染。课堂测验课堂测验v1.GB19298-20141.GB19298-2014包装饮用水包装饮用水的微生物指标中，的微生物指标中，增加了增加了 的检测，删除了的检测，删除了 的检测。的检测。vA.A.菌落总数菌落总数 B.B.大肠菌群大肠
14、菌群 C.C.铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 D.D.霉菌霉菌v2.2.铜绿假单胞菌可引起局部化脓性炎症，也可引铜绿假单胞菌可引起局部化脓性炎症，也可引起起 。vA.A.中耳炎中耳炎 B.B.角膜炎角膜炎 C.C.胃肠炎胃肠炎 D.D.以上都是以上都是v3.3.下列下列 不是铜绿假单胞菌的检测试剂。不是铜绿假单胞菌的检测试剂。vA.CNA.CN琼脂琼脂 B.B.乙酰胺肉汤乙酰胺肉汤 C.C.氧化酶试剂氧化酶试剂 D.D.革兰革兰氏染色剂氏染色剂v4.4.铜绿假单胞菌检测中可计数的菌落包括铜绿假单胞菌检测中可计数的菌落包括。vA.A.蓝绿色菌落蓝绿色菌落 vB.B.产荧光（非蓝绿色），乙酰胺肉汤阳性菌落产荧光（非蓝绿色），乙酰胺肉汤阳性菌落vC.C.红褐色，乙酰胺肉汤阳性，氧化酶阳性，金氏红褐色，乙酰胺肉汤阳性，氧化酶阳性，金氏B B产荧光菌落产荧光菌落vD.D.以上都是以上都是v5.5.铜绿假单胞菌检测滤膜的孔径铜绿假单胞菌检测滤膜的孔径umum。v A.0.22 A.0.22v B.0.45 B.0.45v C.1 C.1v D.10 D.10
