1、课题课题3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条血红蛋白只存在于红细胞内，含有四条肽链肽链,每条肽链环绕一个每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此此基团可携带基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，一分子氧或一分子二氧化碳，血红血红蛋白因含有蛋白因含有血红素血红素而呈而呈红色。红色。Fe2+一、基础知识一、基础知识:1 1、分离生物大分子的基本思路是什么？、分离生物大分子的基本思路是什么？本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？白哪方面的差异进行提纯？选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化选用
2、一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。学性质的生物大分子。2 2、蛋白质提取与分离的依据：、蛋白质提取与分离的依据：不同种类蛋白质的物不同种类蛋白质的物理化学性质不同：理化学性质不同：蛋白质形状、蛋白质形状、大小大小、电荷性质和多少、溶解度、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、对其他分子亲和力等千差万别。从而分吸附性质、对其他分子亲和力等千差万别。从而分离不同种类的蛋白质。离不同种类的蛋白质。一、基础知识一、基础知识-蛋白质提取和分离原理蛋白质提取和分离原理 提取提取分离分离方法方法凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 3 3、分离不同的蛋白质方法：、分离不同的蛋白质
3、方法：2 2、原理：、原理：1 1、材料、材料-实际上就是一些微小的多孔球体。小球实际上就是一些微小的多孔球体。小球内部有许多贯穿的通道内部有许多贯穿的通道.大多数是由多糖类化合物构成，如葡聚大多数是由多糖类化合物构成，如葡聚糖、琼脂糖。糖、琼脂糖。凝胶凝胶(一一)凝胶色谱法凝胶色谱法（分配色谱法）：（分配色谱法）：根据根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离蛋白质的分离蛋白质的有效方法有效方法 当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小相对分子质量较小的蛋白质：的蛋白质：容易进入凝胶颗粒容易进入凝胶颗粒内部的通道，路程较长，移动速度较慢；
4、内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而而相对分子质量较相对分子质量较大的蛋白质：大的蛋白质：无法进入凝胶颗无法进入凝胶颗粒内部的通道，只能在凝胶外部间隙中移动，路粒内部的通道，只能在凝胶外部间隙中移动，路程较短，移动速度较快。程较短，移动速度较快。3 3、具体过程：、具体过程：一、基础知识一、基础知识-分子量分子量大大小小直径大小直径大小运动方式运动方式运动速度运动速度运动路径运动路径洗脱次序洗脱次序一、基础知识一、基础知识-大于凝胶颗粒孔隙大于凝胶颗粒孔隙直径，被阻挡在颗直径，被阻挡在颗粒的外面粒的外面小于凝胶颗粒孔小于凝胶颗粒孔隙直径，可以进隙直径，可以进入颗粒内部入颗粒内部垂直向下移动垂
5、直向下移动垂直向下移动，垂直向下移动，无规则扩散进无规则扩散进入颗粒内部入颗粒内部较快较快较慢较慢较短较短较长较长先从凝胶柱洗脱先从凝胶柱洗脱出来出来后从凝胶柱洗脱后从凝胶柱洗脱出来出来1 1、什么是缓冲液？、什么是缓冲液？2 2、缓冲液的作用是什么？缓冲液的作用是什么？【思考思考2 2】:（二）、缓冲溶液（二）、缓冲溶液-在一定的范围内，凡是能够抵制在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱外加少量强酸或强碱的影响使的影响使原来溶液原来溶液PHPH值基本保持值基本保持不变的混合溶液。不变的混合溶液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如组成。如H H2 2COCO3 3
6、/NaHCO/NaHCO3 3，醋酸，醋酸/醋酸钠，醋酸钠，NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4等等 能够抵制能够抵制外界的酸和碱外界的酸和碱对溶液对溶液PHPH值值的影响，的影响，维持维持PHPH基本不变。基本不变。洗脱剂洗脱剂3 3、缓冲液是如何配制的？缓冲液是如何配制的？4 4、本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？通常由通常由1 12 2 种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在就可以制得在不同不同pHpH范围范围内内使用的缓冲液。使用的缓冲液。
7、磷酸缓冲液磷酸缓冲液,利用缓冲液模拟细胞内的利用缓冲液模拟细胞内的pHpH环境，环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察便于观察()和科学研究和科学研究()2.2.原理：原理：(三三)电泳电泳1.1.电泳的概念电泳的概念指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的的基团，在一定的PHPH下，这些基团会带上正电或负电。下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷在电场的作用下，这些带电分
8、子会向着与其所带电荷相反相反的电极移动。的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。速度，从而实现样品中各种分子的分离。凝胶电泳原理示意图凝胶电泳原理示意图 在一定在一定pHpH下，使蛋白质基团带上正电或负电；下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的加入带负电荷多的SDSSDS，形成，形成“蛋白质蛋白质SDSSDS复合复合物物”，SDS SDS所带负电荷大大超过了蛋白质分子原所带负电荷
9、大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使异，使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小。蛋白质迁移速率完全取决于分子大小。(三三)电泳电泳琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。4 4 SDS-SDS-聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳凝胶电泳分离过程：分离过程：二、实验操作二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。到的血红蛋白溶液
10、。（2）粗分离：）粗分离：透析除去分子较小的杂质。透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。为什么不用鸡的血红细胞而用哺乳动物的血红细胞作为什么不用鸡的血红细胞而用哺乳动物的血红细胞作为实验材料？为实验材料？（一）样品处理（一）样品处理血液的成分血液的成分（一）样品处理及粗分离（一）样品处理及粗分离1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：（2）目的：）目的：去除杂蛋白。去除杂蛋白。血液柠檬酸钠血液柠檬酸钠低速短时离心低速短时
11、离心吸出上层黄色血浆吸出上层黄色血浆暗红色红细胞液暗红色红细胞液5 5倍体积生倍体积生理盐水理盐水 缓慢缓慢搅拌搅拌10min10min低速短时离心低速短时离心吸出上清液吸出上清液反复洗涤反复洗涤直至上清液无黄直至上清液无黄色色（1）步骤：）步骤：柜式离心机柜式离心机初次离心后的结果初次离心后的结果3次洗涤后的结果次洗涤后的结果？洗涤好的红细胞洗涤好的红细胞+蒸馏水蒸馏水+甲苯甲苯搅拌搅拌10min 红细胞红细胞破裂释放血红蛋白破裂释放血红蛋白2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是使红细胞大量吸水胀
12、破使红细胞大量吸水胀破溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂3.3.分离血红蛋白分离血红蛋白分离过程分离过程红细胞红细胞混合液混合液中速离心中速离心10min 离心管离心管滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质烧杯烧杯红细胞破碎混合液转移离心管中红细胞破碎混合液转移离心管中中速长时离心（中速长时离心（2000r/min2000r/min10min10min）滤纸过滤除去脂质滤纸过滤除去脂质分液漏斗静置片刻分液漏斗静置片刻分出下层的分出下层的红色透明液体红色透明液体。分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色脂
13、溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液1mL1mL4、透析（粗提取）：、透析（粗提取）：取取1ML1ML血红蛋白溶液装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（血红蛋白溶液装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PHPH为为7.07.0）透析）透析1212小时。小时。透析袋：小分子自由通过，而大透析袋：小分子自由通过，而大分子保留在袋内。分子保留在袋内。去除小分子的杂质去除小分子的杂质利用透析袋透析利用透析袋透析透析过程透析过程（二）纯化凝胶色谱操作（二）纯化凝胶色谱操作1.1.
14、凝胶色谱柱的凝胶色谱柱的制作制作：2.2.凝胶色谱柱的凝胶色谱柱的装填装填：3.3.样品的样品的加入和洗脱加入和洗脱（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管，两端需用砂纸两端需用砂纸磨平。磨平。底塞的制作：选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞底塞的制作：选择适合封堵玻璃管口的橡皮塞打打孔孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙网，再用覆盖尼龙网，再用100100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。顶塞的制作：顶塞的制作：打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管
15、。组装：组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。如如P68图图5-19注意事项：注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。白质分离不彻底。材料：交联葡聚糖凝胶材料：交联葡聚糖凝胶G-75G-75；20mmol/L20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液装填装填:2.2.凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填：步骤步骤操作要求操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲
16、液洗涤平衡12h12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。的空隙。3 3、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物泡
17、混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。质的分离效果。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。4 4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。装配好的凝胶柱如图5-213.3.样品加入与洗脱样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml
18、样品加到色谱柱的顶端，滴加样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。凝胶面。样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适当的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：收集：待红
19、色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱开始进行层析收集得到的纯化后的蛋白知识总结知识总结血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和分分离离蛋
20、白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法凝胶色谱法原原 理理分离过程分离过程凝胶电泳法凝胶电泳法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定教学反馈教学反馈 1 1凝胶色谱法是根据（凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。）分离蛋白质的有效方法。A A分子的大小分子的大小 B B相对分子质量的大小相对分子质量的大小 C C带电荷的多少带电荷的多少 D D溶解度溶解度2 2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（维持（）基本不变。）基本不变。A A温度
21、温度 B pH B pH C C渗透压渗透压 D D氧气浓度氧气浓度BB3 3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（荷（）的电极移动。）的电极移动。A A相同相同 B B相反相反 C C相对相对 D D相向相向4.4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与）与氧气的运输有关。氧气的运输有关。A A血红蛋白血红蛋白 B B肌红蛋白肌红蛋白 C C肌动蛋白肌动蛋白 D D肌球蛋白肌球蛋白BA5 5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的）的含量最多。含量最多。A A白细胞白细胞 B
22、B血小板血小板 C C红细胞红细胞 D D淋巴细胞淋巴细胞6 6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（血剂（）。）。A.NaCl B.A.NaCl B.甲苯甲苯 C.C.蒸馏水蒸馏水 D.D.柠檬酸钠柠檬酸钠CD7 7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为显看到试管中的溶液分为4 4层，其中第层，其中第3 3层是（层是（）A A无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层 B B脂溶性物质的沉淀层脂溶性物质的沉淀层 C C血红蛋白的水溶液血红蛋白的水溶液 D D其他杂质的暗红色沉
23、淀物其他杂质的暗红色沉淀物C1 1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是应用越来越深入，首先要做的一步是A A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质练习巩固练习巩固2 2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是的叙述，正确的是A A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质相对分子质量较小的
24、蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质量较大的蛋白质B B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质量较大的蛋白质C C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质量较大的蛋白质D D 二者根本无法比较二者根本无法比较3 3、使用、使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于的电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异4 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A A 调节调节pH B pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C C 防止微生物生长防止微生物生长 D D 防止血液凝固防止血液凝固
