1、第1章绪论1.1 复习笔记一、微生物和你微生物是一把十分锋利的双刃剑，它们在给人类带来巨大利益的同时也带来“残忍”的破坏。1. 有利方面（1） 微生物为人类提供很多有用产品，例如：啤酒、抗生素。（2） 微生物参与地球上的物质循环。（3） 微生物为以基因工程为代表的生物技术的发展起到了推动作用。2有害方面微生物引起的瘟疫会给人类带来毁灭性的灾难。二、微生物学1研究对象及分类地位（1） 定义微生物学一般定义为研究肉眼难以看清的称之为微生物的生命活动的科学。（2） 微生物包括的种类 无细胞结构不能独立生活的病毒、亚病毒因子（卫星病毒、卫星RNA和朊病毒）； 原核细胞结构的细菌、古生菌； 真核细胞结构
2、的真菌（酵母、霉菌、蕈菌等）、单细胞藻类、原生动物等。2研究内容及分科微生物学已形成了基础微生物学和应用微生物学，其又可分为许多不同的分支学科，并且还在不断地形成新的学科和研究领域。其主要的分科见图1-1。(a) 基础微生物学(b) 应用微生物学图1-1 微生物学的主要分支学科1三、微生物的发现和微生物学的发展微生物的发现荷兰商人安东列文虎克利用自制的显微镜发现了微生物世界。2微生物学发展过程中的重大事件由列文虎克揭示的多姿多彩的微生物世界吸引着各国学者去研究、探索，推动着微生物学的建立和发展，表l1列出了发展过程中的重大事件。表1-1 微生物学发展中的重大事件3微生物学发展的奠基者巴斯德和柯
3、赫是微生物学的奠基人。（1） 巴斯德的贡献 彻底否定了“自生说” 著名的曲颈瓶实验彻底否定了“自生说”，并从此建立了病原学说，推动了微生物学的发展。 免疫学预防接种 巴斯德研究了鸡霍乱，发现将病原菌减毒可诱发免疫性，以预防鸡霍乱病。他为人类防病、治病做出了重大贡献。 证实发酵是由微生物引起的。 其他贡献巴斯德消毒法和家蚕软化病问题。（2） 柯赫的贡献 证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌。 发现了肺结核病的病原菌。 提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则柯赫原则。 用固体培养基分离纯化微生物的技术。 配制培养基。四、20世纪的微生物学1多学科交叉促进微生物学全面发展（1） 形成了新的基础
4、研究学科微生物遗传学和微生物生理学，推动了分子遗传学的形成。（2） 其他分支学科迅速发展，如细菌学、真菌学、病毒学。2微生物学推动生命科学的发展（1） 促进许多重大理论问题的突破基因结构的精细分析、重叠基因的发现，最先完成的基因组测序等都与微生物学发展密不可分。（2） 对生命科学研究技术的贡献转基因动物、转基因植物的转化技术也源于微生物转化的理论和技术。（3） 微生物与“人类基因组计划”目前已完成了近200多种独立生活的微生物基因组的序列测定，在此过程中，由于微生物基因组作图和测序方法的不断改进，加快了人类基因组计划进展。3我国微生物学的发展（1）19101921年间伍连德用近代微生物学知识对
5、鼠疫和霍乱病原的探索和防治，在中国最早建立起卫生防疫机构；（2）20世纪2030年代，汤飞凡等在医学细菌学、病毒学和免疫学等方面的某些领域做出过较高水平的成绩；（3） 魏岩寿等在工业微生物方面做出了开拓性工作，戴芳澜和俞大绂等是我国真菌学和植物病理学的奠基人；（4） 张宪武和陈华癸等对根瘤菌固氮作用的研究开创了我国农业微生物学；（5） 高尚荫创建了我国病毒学的基础理论研究和第一个微生物学专业。五、21世纪微生物学发展的趋势1微生物基因组学研究将全面展开。2. 与环境密切相关的微生物学研究将获得长足发展3. 微生物生命现象的特性和共性将更加受到重视。微生物生命现象的特性和共性可概括为：（1） 微
6、生物具有其他生物不具备的生物学特性，具有其他生物不具备的代谢途径和功能。（2） 微生物具有其他生物共有的基本生物学特性（3） 易操作性：微生物具有个体小、结构简单、生长周期短、易大量培养、易变异、重复性强等优势。4. 与其他学科实现更广泛的交叉，获得新的发展。5. 微生物产业将呈现全新的局面微生物工业将生产各种各样的新产品，例如，降解性塑料、DNA芯片、生物能源等一、复习题1.2 课后习题详解1用具体事例说明人类与微生物的关系。答：说明人类与微生物关系的事例如下：（1） 微生物的存在及其生命活动关系到人类和其他高等生物在地球上的生存，微生物使得地球上的物质进行循环，是人类生存环境中必不可少的成
7、员。没有微生物也就没有高等生物的繁衍，相反，如果没有高等生物，大多数微生物则可照样繁衍子孙。（2） 人类与微生物关系的重要性，还可以从它们在给人类带来巨大利益的同时也可能带来极大的危害两方面进行分析。能够列举：面包、奶酪、啤酒、抗生素、疫苗、维生素酶等重要产品的生产；过去瘟疫的流行，现在一些病原体正在全球蔓延，许多已被征服的传染病也有“卷土重来”之势；食品的腐败等等。最后，还可以从人体本身携带的不可缺少的有益微生物进行分析，说明微生物与人类的关系密切和重要性。2为什么微生物学比动物学、植物学起步晚，但却发展迅速?并成为生命科学研究的“明星”?答：（1）发展迅速是原因有以下几方面： 微生物具有其
8、他生物不具备的生物学特性； 微生物具有其他生物共有的基本生物学特性； 微生物具有个体小、结构简单、生长周期短、易大量培养、易变异、重复性强等优势，十分易于操作，动、植物由于结构的复杂性及技术方法的限制而相对发展缓慢； 微生物的广泛的应用性，能迅速地符合现代学科、社会和经济发展的需求。（2）成为明星是因为易操作，易培养。3简述微生物学在生命科学发展中的地位，并描绘其前景。答：（1）20世纪40年代，随着生物学的发展，许多生物学难以解决的理论和技术问题十分突出， 特别是遗传学上的争论问题，使得微生物这样一种简单而又具完整生命活动的小生物成了生物学研究 的“明星”。微生物学很快与生物学主流汇合，并被
9、推到了整个生命科学发展的前沿，获得了迅速的发 展，为整个生命科学的发展做出了巨大的贡献（可举例说明），在生命科学的发展中占有重要的地位。（2）微生物学的发展前景： 微生物基因组学研究将全面展开； 以了解微生物之间、微生物与其他生物、微生物与环境的相互作用为研究内容的微生物生态学、环境微生物、细胞微生物学等，将在基因组信息的基础上获得长足发展，为人类的生存和健康发挥积极的作用； 微生物生命现象的特性和共性将更加受到重视； 与其他学科实现更广泛的交叉，获得新的发展；微生物产业将呈现全新的局面。4为什么说巴斯德和柯赫是微生物学的奠基人?答：巴德斯和柯赫为微生物的建立和发展作出了卓越的贡献，使微生物学
10、作为一门独立的学科开始形成。（1） 巴德斯彻底否定了“自生说”；发现将病原菌减毒可诱发免疫性，首次制成狂犬疫苗，进行预防接种；正是发酵是由微生物引起的；创立巴氏消毒法等。（2） 柯赫在对病原细菌的研究中取得了突出的成就：证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌；发现了肺结核病的病原菌；一提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则柯赫原则；创建了分离、纯化微生物的技术等。5简述下列科学家对微生物学发展的主要贡献： Lister，Griffith，Fleming，Avery，Lederberg， Waksman，JacobMonod，Ames，Woese，汤飞凡，何大一答：下列科学家对微生物学发展的
11、主要贡献分别是：（1） Lister创立了消毒外科。并首次成功的进行了石碳酸消毒试验。（2） Griffith发现细菌转化。（3） Fleming发现青霉素。（4） Avery证实转化过程中DNA是遗传信息载体。（5） Lederberg发现普遍性转导。（6） Waksman发现链霉素。（7） JacobMonod提出基因调节的操纵子模型。（8） Ames建立细菌测定法检测致癌物。（9） Woese提出古生菌是不同于细菌和真核生物的类群。（10） 汤飞凡首次分离出沙眼衣原体。（11） 何大一是艾滋病鸡尾酒疗法的发明人。二、思考题1许多生物科学研究者喜欢用微生物作为模式系统来揭示生命过程，你认为
12、其原因何在?你能列举几个现代微生物学发展的例子吗?答：（1）原因是： 微生物具有其他生物不具备的生物学特性； 微生物具有其他生物共有的基本生物学特性； 微生物具有个体小、结构简单、生长周期短、易大量培养、易变异、重复性强等优势，十分易于操作，动、植物由于结构的复杂性及技术方法的限制而相对发展缓慢； 微生物的广泛的应用性，能迅速地符合现代学科、社会和经济发展的需求。（2）现代微生物学发展的例子： 利用微生物治理环境。 利用微生物制备抗生素。 利用微生物制备单克隆抗体。2何谓纯培养?为什么说它对微生物学的发展至关重要?它存在于自然环境中吗?纯培养和当今工业发酵中采用的混合培养（见第十五章）有何关系
13、?答：（1）纯培养是指培养基中只含有一种培养物。（2） 自然界中不存在。自然界中的微生物都是混合生长。一种生境下有多种培养物。（3） 混合培养是多种微生物混合在一起培养，共用一种发酵培养基。相当于多个纯培养混合在一起。1.3 名校考研真题详解一、填空题1“人畜共患病”的例子有 、 、和 。四川大学2007研【答案】狂犬病；禽流感；艾滋病219世纪中期，以法国的 和德国的 为代表的科学家，揭示了微生物是造成腐败发酵和人畜疾病的原因，并建立了分离、培养、接种和灭菌等一系列独特的微生物技术，从而奠定了微生物学的基础，同时开辟了医学和工业微生物学等分支学科。南开大学2009研【答案】巴斯德；科赫二、判
14、断题巴斯德和柯赫被认为是微生物学的奠基人，是因为他们最先发现了微生物。()中科院2004研【答案】【解析】最早发现微生物的人是荷兰商人安东列文虎克，他自制的显微镜，从而发现了微生物世界。巴德斯和柯赫为微生物的建立和发展作出了卓越的贡献，使微生物学作为一门独立的学科开始形成。三、名词解释1Joshua Lederberg南京大学2006研答：Joshua Lederberg即乔舒亚莱德伯格，是细菌遗传重组的发现者，在1958年，因为细菌遗传物质重组的现象发现与机制的阐明，获得了诺贝尔生理医学奖。2Microbial ecology南开大学2009研答：Microbial ecology即微生物生
15、态学，是研究微生物群体与其周围的生物和非生物环境条件间相互作用的规律的学科。四、简答题12005年诺贝尔生理学和医学将授予澳大利亚学者B. Jarshall和J. R. Warren。你知道他们是因为哪项研究成果获奖的？他们的成功是基于哪些因素？南京大学2006研答：（1）澳大利亚学者B. Jarshall和J. R. Warren取得的研究成果是：发现了导致人类罹患胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡的罪魁幽门螺杆菌。（2）他们成功基于以下因素： 为科研献身的精神，拿自己作为实验者。 对于发现新现象的认真态度。2从有益和有害两个方面各列举两个例子说明微生物和人类的关系。中科院2004研 答：（1）微生
16、物对人类的有益关系： 微生物为人类提供很多有用产品，例如：啤酒、抗生素。 微生物参与地球上的物质循环。 微生物为以基因工程为代表的生物技术的发展起到了推动作用。（2） 微生物对人类的有害关系：微生物引起的瘟疫会给人类带来毁灭性的灾难。32002年底至2003年春，在我国部分地区爆发非典型性肺炎，一开始对引起该病的病原颇有争议，经过科技工作者的努力，最终弄清了引起非典型性肺炎的病原是一种冠状病毒。请你设想科研人员是怎样确定该病是由病毒引起的(说明证据要点)?(10分)中科院2004研答：确定该病是病毒引起的，应该采用科赫法则，如下：(1) 从患病的宿主体内能分离到病毒； (2)宿主细胞能够培养该
17、病毒；(3) 能够通过滤菌器；(4) 培养的病毒能够使相同的或相近的宿主产生类似的症状； (5)能够从实验感染的宿主体内重新分离到病毒；(6)能检测到针对病毒发生的特异性免疫反应。第2章微生物的纯培养和显微技术2.1 复习笔记微生物个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture），而只有一种微生物的培养物称为纯培养物（pure culture）。1一、微生物的分离和纯培养无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。因此，在微生物的研究及应用
18、中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入，所操作的微生物培养物也不应对环境造成污染。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术（aseptic technique）。（1） 微生物培养的常用器具及其灭菌 试管、玻璃烧瓶、培养皿（culture dish，Petri dish）等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌； 培养微生物的营养物质称为培养基（culture medium），可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器
19、具中； 培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。（2） 接种操作 接种环在火焰上灼烧灭菌； 烧红的接种环在空气中冷却，同时打开装有培养物的试管； 用接种环蘸取一环培养物转移到一；装有无菌培养基的试管中，并将试管重新盖好； 接种环在火焰上灼烧，杀灭残留的培养物。2用固体培养基获得纯培养固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基。分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落（colony）。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔（1awn）。培养平板（culture plat
20、e）是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，它是冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面，常被简称为平板（plate）。下面列出的是目前实验室用固体培养基获得微生物纯培养的几种常用方法。（1） 涂布平板法（spread plate method） 先将已熔化的培养基倒入无菌培养皿，制成无菌平板。 冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌涂布棒将菌液均匀分散至整个平板表面。 培养后挑取单个菌落。（2） 稀释倒平板法（pour plate method） 先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1：10、1：100、1：1000、1：10000
21、）。 分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个微生物细胞繁殖形成的。 挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。（3） 平板划线法（streak plate method） 用接种环以无菌操作蘸取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线。 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平
22、板表面得到单菌落。（4） 稀释摇管法（shake tube method）对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行。 先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂熔化后冷却并保持在50左右。 将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀。 冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。 培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。 进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡一石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。3用液
23、体培养基获得纯培养通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生 物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的概率就会急剧下降。4单细胞（孢子）分离采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。5选择培养没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界
24、中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。（1） 选择平板培养根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。有些微生物如螺旋体、黏细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其他不能移动的微生物分开。可将微生物群落点种到平板上， 让微生物滑行，从滑行前沿挑取培养物接种，如此反复操作，得到纯培养物。（2） 富集培养富集培养主要是指利用不同微生物，生命活动特点的不
25、同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，使人们能够更容易地从自然界中分离到这种所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等方面。6微生物的保藏技术生物的生长一般都需要一定的水分、适宜的温度和合适的营养，微生物也不例外。菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。（1） 传代培养保藏传代培养与培养物的直接使用密切相关，常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。（2） 冷冻保藏将微生物处于冷冻状态，使其代谢
26、作用停止，可达到保藏的目的。在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。一般来说，保藏温度越低，保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中，液氮保藏可达到一196。在70低温冰箱中保存菌株，添加甘油做保护剂。（3） 干燥保藏法沙土管保存和冷冻真空保藏是最常用的两项微生物干燥保藏技术。前者一般将菌种接种斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙土管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法简便易行，并可以将微生物保藏较长时间。冷冻真空保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过冰的升华作用除去水分。达到干燥
27、的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。二、显微镜和显微技术绝大多数微生物必须借助显微镜放大系统的作用才能看到它们的个体形态和内部构造。1显微镜的种类及原理（1） 普通光学显微镜现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。分辨率为0.2m。（2） 暗视野显微镜明视野显微镜的照明光线直接进入视野，属透射照明。暗视野法主要用于观察生活细菌的运动性。（3） 相差显微镜相差显微镜使人们能在不染色的
28、情况下比较清楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。（4） 荧光显微镜由于不同荧光素的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用两种以上的荧光素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发发射出不同颜色的光。荧光显微技术在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用十分普遍。（5） 透射电子显微镜电子显微镜的分辨能力要远高于光学显微镜。（6） 扫描电子显微镜扫描电镜主要被用于观察样品的表面结构。（7） 扫描隧道显微镜STM是目前分辨率最高的显微镜。目前，人们已利用STM直接观察到 DNA、RNA和蛋白质等生物大分子，以及生物膜、古生菌的细胞壁、病毒等结
29、构。2显微观察样品的制备（1） 光学显微镜的制样光学显微镜是微生物学研究的最常用工具，有活体观察和染色观察两种基本使用方法。 活体观察a. 压滴法：将菌悬液滴于载玻片上，加盖盖玻片后立即进行显微镜观察。b. 悬滴法：在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹玻载片上后进行显微镜观察。为防止液滴蒸发变干，一般还应在盖玻片四周加封凡士林。c. 菌丝埋片法：将无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，经培养，取下玻璃纸置于载玻片上，用显微镜对菌丝的形态进行观察。 染色观察在光学显微镜下观察细菌形态和主要结构，一般都需要对它们进行染色，从而借助颜色的反衬作用提高观察样品不同部位的反差。（
30、2） 电子显微镜的制样 透射电镜的样品制备a. 负染技术； b投影技术；c超薄切片技术。 扫描电镜的样品制备扫描电镜样品制备方法比透射电镜要简单，它主要要求样品干燥，并且表面能够导电。三、显微镜下的微生物微生物类群庞杂，种类繁多，包括细胞型和非细胞型两类。凡具有细胞形态的微生物称为细胞型微生物，按系统发育和细胞结构它们分属于细菌（Bacteria）、古生菌（Archaea）和真核生物（Eukarya）。不具细胞结构的病毒、类病毒，行寄生生活，它们的许多生活特性类同于寄主生物。1. 细菌和古生菌（1） 细菌的形态和排列细菌基本形态可分为球状、杆状与螺旋状3种。许多细菌也常以成对、成链、成簇的形式
31、生长。支原体（mycoplasma）由于只有细胞膜，没有细胞壁，故细胞柔软，形态多变，具有高度多形性。放线菌、黏细菌具有特定的生活周期，在不同的生长阶段具有不同的形态。（2） 古生菌古生菌与细菌具有类似的个体形态，有些古生菌则具有比较独特的个体形态，例如，能在饱和盐水中生长的有些极端嗜盐菌细胞呈方型。（3） 原核生物的细胞大小原核生物的细胞大小随种类不同差别很大。有的与最大的病毒粒子大小相近，在光学显微镜下勉强可见，有的与藻类细胞差不多，几乎肉眼就可辨认，但多数居于二者之间。2真菌（1） 霉菌霉菌是一些“丝状真菌”的统称。霉菌菌体均由分支或不分支的菌丝构成。许多菌丝交织在一起，称为菌丝体。其生
32、长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多以及细胞质的增加。（2） 酵母菌酵母菌是一群单细胞的真核微生物。通常用于以芽殖或裂殖来进行无性繁殖的单细胞真菌。极少数种可产生子囊孢子进行有性繁殖。 大多数酵母菌为单细胞，在光学显微镜下，一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。有些酵母菌细胞与其子代细胞连在一起成为链状，称为假丝酵母。3藻类藻类是指除苔藓植物和维管束植物以外，基本上有叶绿素，可进行光合作用，并伴随放出氧气的一大类真核生物。藻类的大小、形态有很大差别，许多是单细胞的，也有些藻类是单细胞的群体。4原生动物原生动物是一类缺少真正细胞壁，细胞通常无色，具有运动能力，并进行吞噬营养的单细胞真核生物。
33、它们个体微小，大多数都需要显微镜才能看见。一、复习题2.2 课后习题详解1何为无菌技术?试列举属于无菌技术范围的具体实验操作环节及注意事项。答：（1）无菌技术是指在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入，所操作的微生物培养物也不应对环境造成污染。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境。（2）实验操作环节及注意事项如下： 接种环在火焰上灼烧灭菌。 烧红的接种环在空气中冷却，同时打开装有培养物的试管。 用接种环蘸取一环培养物转移到一装有无菌培养基
34、的试管中，并将试管重新盖好。 接种环在火焰上灼烧，杀灭残留的培养物。2. 哪些固体培养基分离技术可以被用来获得目的微生物的纯培养?它们的适用范围及特点如何？ 答：（1）可以被用来获得目的微生物的纯培养固体培养基包括：稀释倒平板法，涂布平板法，平板划线法，稀释摇管法，选择平板法。（2）适用范围及特点如下： 稀释倒平板法细菌分离效果好，但操作相对麻烦，不利于热敏感菌和好氧菌的生长。 涂布平板法操作方便，但有时涂布不均匀。 平板划线法操作方便，但无法进行计数。 稀释摇管法对厌氧菌进行纯培养分离，操作和观察均相对麻烦。 选择平板利用选择性培养条件（例如加抗生素或用牛奶平板）较快地分离获得目的菌。3在何
35、种情况下你会选择使用液体分离法或单孢子（细胞）分离法来获得微生物的纯培养? 答：（1）对于不能或不易在固体培养基上生长的微生物，选择用液体分离法获得纯培养。（2）从样品中直接分离所需要的微生物细胞或孢子时，获得其纯培养物时，采取单细胞分离法。4为什么说菌种保藏技术对于微生物学的研究和应用都具有重要意义?你认为哪些菌种保藏技术可被用于保藏大肠杆菌及枯草芽孢杆菌菌株?答：（1）菌种保藏技术对于微生物学的研究和应用都具有重要意义,理由是: 菌株的保藏技术能够使分离得到的纯培养物在一定时间内不死亡。 菌株的保藏技术能够使分离得到的纯培养物不会被其他污染物污染，不会因发生变异丢失重要的生物学性状。 菌株
36、的保藏技术使微生物研究和应用工作顺利进行。（2）冷冻保藏和干燥保藏可以用于保藏大肠杆菌及枯草芽孢杆菌菌株。5使用油镜时为何要滴加香柏油?我们是否应该进一步寻找介质折射率更大的其他物质取替香柏油，以进一步提高显微镜的分辨率?答：（1）使用油镜时要滴加香柏油，理由是：油镜的放大倍数高，而透镜很小，光线通过不同密度的介质时，会发生散射。进入镜筒的光线少，视野暗。加上香柏油后，进入视野的光线多，物象清晰。（2）我们不需要进一步寻找介质折射率更大的其他物质取替香柏油，提高显微镜的分辨率。因为人眼的分辨率是有限的。6试总结、比较普通光学显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜、扫描电子显微镜在成像原理方面的异同
37、点。答：普通光学显微镜、荧光显微镜、透射电子显微镜、扫描电子显微镜在成像原理方面的异同点如下表所示：表2-1 各种显微镜成像原理异同的比较显微镜类型基本原理及特点应用光学显微镜明视野显微镜光线透射照明，物像处于亮背景中。为光学显微镜的最基本配置，价格便宜、容易使用用于观察染色样品，观察未经染色的活细胞效果欠佳暗视野显微镜通过特殊的聚光器实现斜射照明，亮物像形成于暗背景中明视野显微镜下不易看清的活细胞的观 察；不易被染色或易被染色过程破坏的细胞的观察（例如对梅毒密螺旋体的检测）；观察活细胞的运动性相差显微镜通过特殊的聚光器和物镜将通过样品不同部位产生的光波相位差转变为振幅差（明暗差异），提高样品
38、不同部位间的反差活细胞及其内部结构的观察荧光显微镜经荧光染料染色或荧光抗体处理的样品在紫外线等短波长光照射下激发出长波长的可见光（荧光），在黑暗的背景中形成明亮的彩色物像环境微生物的直接观察；病灶或医学样品中特定病原微生物的直接检测（使用特定的荧光抗体）共聚焦显微镜激光作为光源，每次照明样品的一个点，连续扫描后经计算机处理获得样品的二维或三维图像。显微镜价格昂贵对完整细胞的细微立体结构进行观察和分析电子显微镜透射电镜用电子束作为“光源”聚焦成像，分辨率较光学显微镜大大提高。仪器庞大、价格昂贵，对工作环境和操作技术有较高要求对病毒等颗粒微小样品的形貌进行观察或通过超薄切片处理后观察细胞的内部结构
39、扫描电电子束在样品表面扫描，收集样品表面被激发形成的二次电子形成物像。分辨率远高于光学显微镜。仪器庞大、价格昂贵，对丁作环境和一般用于观察样品的表面立体结构镜操作技术有较高要求探针扫描显微镜隧道扫描显微镜用细小的探针在样品表面进行扫描，通过记录针尖和样品间隧道效应电流的变化形成物像与电子显微镜相比，这类显微镜能提供更高的分辨率，可在生理状态下对生物大分子或细胞结构进行观察。同时仪器体积较小，价格也相对便宜原子力显微镜利用细小的探针对样品表面进行恒定高度的扫描，同时通过一个激光装置来监测探针随样品表面的升降变化来获取样品表面形貌的信息7试述电子显微镜在进行生物样品制备与观察时应注意的问题。答：电
40、子束的穿透能力电子束的穿透能力是十分有限的，超薄切片是基本的透射电镜实验技术。相比之下，扫描电镜对样品的大小和厚度没有严格的要求。制备与观察时应注意以下问题：（1） 生物组织的特点生物组织的主要成分之一是水，若生物样品不经处理直接放进电镜，镜筒中的高真空必然会使样品发生严重的脱水现象，失去样品原有的空间构型，所以一般不能用电镜进行生物样品的活体观察。而且，由于生物样品很容易遭到破坏，在对样品进行固定、干燥、染色及其他一些处理过程中，也必须随时注意使样品尽量保持生活状态下的精细结构，而不严重失真。另外，在扫描电镜的使用中，除要求样品干燥外，还需要样品具一定的导电能力，以减少样品表面电荷的堆积并得
41、到良好的二次电子信号。而生物样品一般都是不导电的，所以在制备扫描电镜生物样品时，一般需在其表面镀上一层金属薄膜。（2） 增加样品的反差显微观察时，只有样品具有一定的反差，才能得到清晰的图像。光学显微镜可以通过各种染色技术来增加样品的反差，并得到彩色的样品图像。而在电镜的使用中，彩色染料是不采用的，因为两种不同的颜色在电镜中是不能区别的。电镜中生物样品不同结构之间反差的取得一般是用重金属盐染色或喷镀，凡是嗜金属的结构，对电子的散射与吸收的能力增强，易于形成明暗清晰的电子图像。而且，由于电子图像是靠不同电子密度形成的亮度差异而构成，所以，电镜得到的电视或照相图像都是黑白的。8哪些因素会影响显微测定
42、的细菌细胞大小?如果在实验中偶然发现某菌具有特异的细胞形态，你该如何对待?答：（1）影响显微测定细菌细胞大小的因素有：染色因素和菌的生长时期。比如干燥固定后的菌体比活的菌体的长度要缩短1/31/4。幼龄期的细菌比老龄期的细菌要大很多。（2）偶然发现有特异形态的细菌，应该对该菌进行鉴定。首先是平板划线，纯化该细菌。其次是提取基因组，对16S rRNA测序。二、思考题1一般说来，严格的无菌操作是一切微生物学工作的基本要求，但在分离与培养极端嗜盐菌时，常在没有点酒精灯的普通实验台上倾倒培养平板、在日常环境中直接打开皿盖观察和挑取菌落，而其研究结果并没有因此受到影响，你知道这是为什么吗?答：这种现象是
43、因为：培养极端嗜盐菌的培养平板需要添加很高浓度的氯化钠（例如25），实验室环境中的一般微生物都不能在这种选择培养基上生长，因此在实验过程中即使不采取无菌操作技术，实验结果也不会受到影响。2如果希望从环境中分离得到厌氧固氮菌，你该如何设计实验? 答：从环境中分离得到厌氧固氮菌，实验设计如下：（1） 根据选择分离的原理设计不含氮的培养基，在这种培养基上生长的细菌，其氮素应来自固氮作用。（2） 将环境样品（例如土样）稀释涂布到选择平板上，放置于厌氧罐中。对厌氧罐采用物理、化学方法除去氧气，保留氮气。培养后在平板上生长出来的细菌应是厌氧固氮菌或兼性厌氧固氮菌。（3） 挑取一定数量的菌落，对应点种到两块
44、缺氮的选择平板上，分别放置于厌氧罐内、外保温培 养。在厌氧罐内外均能生长的为兼性厌氧固氮菌，而在厌氧罐外的平板上不生长，在厌氧罐内的平板上生长的即为可能的厌氧同氮菌。（4） 对分离得到的厌氧固氮菌菌落样品进行系列稀释，涂布于相应的选择平板，重复上述步骤直到获得厌氧固氮菌的纯培养物。3为什么光学显微镜的目镜通常都是15?是否可以采用更大放大倍率的目镜（如30）来进一步提高显微镜的总放大倍数?答：（1）光学显微镜的目镜通常都是15，是因为光学显微镜的分辨率受到光源波长及物镜性能的限制，在使用最短波长的可见光（450nm）作为光源时在油镜下可以达到的最大分辨率为0.18m。由于肉眼的正常分辨能力一般
45、为0.25mm左右，因此光学显微镜有效的最高总放大倍数只能达到10001500 倍。油镜的放大倍数是100，因此显微镜配置的目镜通常都是15。（2）不可以采用更大放大倍率的目镜（如30）来进一步提高显微镜的总放大倍数。选用更大放大倍数的目镜（如30）进一步提高显微镜的放大能力对观察效果的改善并无帮助。4为什么透射电镜和扫描电镜对样品厚度与大小的要求有如此大的差异?能否用扫描电镜来观察样品的内部结构，而用透射电镜来观察样品的表面结构?答：（1）这种差异是因为：透射电子显微镜的成像原理类似于普通光学显微镜，作为光源的电子束在成像时要穿透样品。由于电子束的穿透力有限，因此在进行透射电镜观察时要求样品
46、一定要薄。而扫捕电镜的成像原理类似于电视或电传真照片，图像是通过收集样品表面被激发的二次电子形成的，因此对样品的厚度并无特别的要求。（2）能用扫描电镜来观察样品的内部结构，用透射电镜来观察样品的表面结构。 扫描电镜一般被用于观察样品的表面结构，但通过样品制备过程中的冰冻蚀刻技术，用扫描电镜也可观察到样品的内部结构，获得立体的图像。 透射电镜一般通过超薄切片技术观察样品的内部结构，但通过样品制备过程中的复型技术，用透射电镜也可对样品的表面结构进行观察。5培养条件对微生物个体的大小有哪些影响?你是否能很快地在显微镜下区分同为单细胞的细菌、酵母菌和原生动物?答：（1）培养条件对微生物大小影响： 首先应使用稀释涂布等方法对待检菌株的纯度、
