1、 第一章第一章 人体的内环境与稳定人体的内环境与稳定专题专题1基因工程基因工程11DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题专题1基因工程基因工程学习导航学习导航1.了解基因工程的概念、诞生及发展。了解基因工程的概念、诞生及发展。2掌握限制酶及掌握限制酶及DNA连接酶的作用。连接酶的作用。重、难点重、难点3理解载体需具备的条件。理解载体需具备的条件。重点重点专题专题1基因工程基因工程一、基因工程一、基因工程基因工程的别名基因工程的别名_操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象_操作水平操作水平_结果结果新的生物类型和生物产品新的生物类型和生物产品DNA重组技术重组技术基因基因DNA
2、分子水平分子水平二、限制性核酸内切酶二、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”1来源来源：主要来自于：主要来自于_。2特点特点：具有专一性。：具有专一性。(1)识别双链识别双链DNA分子的某种分子的某种_。(2)切割特定核苷酸序列中的特定位点。切割特定核苷酸序列中的特定位点。3作用作用：断开每一条链中：断开每一条链中_的两个核苷酸之间的的两个核苷酸之间的_。4结果结果：产生：产生_和和_。原核生物原核生物特定核苷酸序列特定核苷酸序列特定部位特定部位磷酸二酯键磷酸二酯键黏性末端黏性末端平末端平末端巧记巧记限制酶有特性，限制酶有特性，“特定特定”突显专一性。突显专一性。三、三、DNA连接酶连接酶
3、“分子缝合针分子缝合针”1.大肠杆菌大肠杆菌互补的互补的黏性末端黏性末端噬菌体噬菌体黏性末端黏性末端平末端平末端2作用作用：形成：形成_。3结果结果：形成重组：形成重组DNA分子。分子。四、基因进入受体细胞的载体四、基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车”1作用作用：将：将_送入细胞中。送入细胞中。2种类种类：_、噬菌体衍生物和动植物病毒等。噬菌体衍生物和动植物病毒等。磷酸二酯键磷酸二酯键外源基因外源基因质粒质粒3.限制酶切割位点限制酶切割位点标记基因标记基因1判一判判一判(1)通过基因工程改造成的生物为新物种。通过基因工程改造成的生物为新物种。()(2)限制酶和限制酶和DNA解旋酶的作
4、用部位相同。解旋酶的作用部位相同。()(3)DNA连接酶起作用时不需要模板连接酶起作用时不需要模板()2连一连连一连将基因工程中的有关名词与其对应内容连线将基因工程中的有关名词与其对应内容连线1切割位点：切割位点：磷酸二酯键。磷酸二酯键。磷酸二酯键指的是如图圆圈中的化学键，而限制酶切割的只磷酸二酯键指的是如图圆圈中的化学键，而限制酶切割的只能是箭头能是箭头所指的化学键，因为圈中另一个化学键属于一个所指的化学键，因为圈中另一个化学键属于一个核苷酸内部的化学键。核苷酸内部的化学键。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(限制酶限制酶)作用位点示意图作用位点示意图2限制酶切出的黏性末端和平末端的比较限制酶
5、切出的黏性末端和平末端的比较(1)黏性末端：限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线两侧黏性末端：限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线两侧将将DNA的两条链分别切开时形成的。的两条链分别切开时形成的。(2)平末端：限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线处切开平末端：限制性核酸内切酶在识别序列的中心轴线处切开时形成的。时形成的。3限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与DNA解旋酶的比较解旋酶的比较(1)相同点：都作用于相同点：都作用于DNA分子中的化学键。分子中的化学键。(2)不同点：两者作用部位不同，前者作用于磷酸与脱氧核糖不同点：两者作用部位不同，前者作用于磷酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键，而后者作用
6、于两个碱基之间的氢键，即之间的磷酸二酯键，而后者作用于两个碱基之间的氢键，即上述作用位点示意图中的箭头上述作用位点示意图中的箭头所指处的氢键。所指处的氢键。4限制酶切割位点与限制酶切割位点与DNA片段的关系片段的关系(1)链状链状DNA分子上有分子上有1个酶切位点，用限制酶切割后形成个酶切位点，用限制酶切割后形成2个个DNA片段；如果有片段；如果有2个酶切位点，用限制酶切割后则形成个酶切位点，用限制酶切割后则形成3个个DNA片段。依次类推。片段。依次类推。(2)环状环状DNA分子上有分子上有1个酶切位点，用限制酶切割后形成一个酶切位点，用限制酶切割后形成一条链状条链状DNA；如果有；如果有2个
7、酶切位点，用限制酶切割后形成个酶切位点，用限制酶切割后形成2个个DNA片段。依次类推。片段。依次类推。特别提醒限制酶作用结果特别提醒限制酶作用结果不同不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；同一个同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同，如果相同，可重新互补配对。不相同，如果相同，可重新互补配对。(2014山东济宁高二检测山东济宁高二检测)下表为常用的限制性核酸内下表为常用的限制性核酸内切酶切酶(限制酶限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法及其识别序列和切割位点，由
8、此推断以下说法正确的是正确的是()(注：注：YC或或T，RA或或G)A限制酶切割后不一定形成黏性末端限制酶切割后不一定形成黏性末端B限制酶的切割位点一定在识别序列的内部限制酶的切割位点一定在识别序列的内部C不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列限制酶名称限制酶名称识别序列和切识别序列和切割位点割位点限制酶名称限制酶名称识别序列和切识别序列和切割位点割位点BamHGGATCCKpnGGTACCEcoRGAATTCSau3AGATCHindGTYRACSmaCCCGGGA解析解析由表得知
9、，由表得知，Hind能识别能识别4种不同的核苷酸序列，切种不同的核苷酸序列，切割后不一定形成黏性末端，割后不一定形成黏性末端，D项错误；项错误；Sau3A的切割位点在的切割位点在识别序列的外部，识别序列的外部，B项错误；不同限制酶切割后可能形成相项错误；不同限制酶切割后可能形成相同的黏性末端，如同的黏性末端，如BamH与与Sau3A切割的末端，切割的末端，C项错误项错误;限制酶切割后不一定形成黏性末端，也可能是平末端，限制酶切割后不一定形成黏性末端，也可能是平末端，A项项正确。正确。(1)表格中哪两种限制酶切割出来的表格中哪两种限制酶切割出来的DNA片段末端可以互补结片段末端可以互补结合？其末
10、端互补序列是什么？合？其末端互补序列是什么？(2)从表中各限制酶识别序列和切割位点的差异，得出限制酶从表中各限制酶识别序列和切割位点的差异，得出限制酶有何特性？有何特性？提示提示：(1)Bam H和和Sau 3 A。GATC。(2)专一性。专一性。(2)判断黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的方判断黏性末端或平末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是：将黏性末端或平末端之一旋转法是：将黏性末端或平末端之一旋转180后，看它们是否是后，看它们是否是完全相同的结构。完全相同的结构。(2014枣庄高二检测枣庄高二检测)现有一长度为现有一长度为1 000个碱基对个碱基对(bp)的的DNA分子，用
11、限制性核酸内切酶分子，用限制性核酸内切酶EcoR 酶切后得到的酶切后得到的DNA分子分子仍是仍是1 000 bp，用，用Kpn 单独酶切得到单独酶切得到400 bp和和600 bp两种长两种长度的度的DNA分子，用分子，用EcoR、Kpn 同时酶切后得到同时酶切后得到200 bp和和600 bp两种长度的两种长度的DNA分子，该分子，该DNA分子的酶切图谱正确的分子的酶切图谱正确的是是()解析：选解析：选D。从题干中。从题干中“用限制性核酸内切酶用限制性核酸内切酶EcoR 酶切后酶切后得到的得到的DNA分子仍是分子仍是1 000 bp”，再结合选项中，再结合选项中DNA分子的分子的可能酶切图谱
12、分析可知，此可能酶切图谱分析可知，此DNA分子是环状，故分子是环状，故A、B排除。排除。同理，从同理，从“用用Kpn 单独酶切得到单独酶切得到400 bp和和600 bp两种长度两种长度的的DNA分子分子”，又可推知图谱中应有两个，又可推知图谱中应有两个Kpn 酶切位点，酶切位点，故选故选D。DNA连接酶及相关的比较连接酶及相关的比较1限制酶与限制酶与DNA连接酶的相互作用连接酶的相互作用2几种工具酶作用特点的比较几种工具酶作用特点的比较名称名称作用作用参与的生理参与的生理过程或应用过程或应用作用位作用位点点(如图如图)DNA连接酶连接酶连接两个连接两个DNA片段片段基因工程基因工程a限制性核
13、酸限制性核酸内切酶内切酶能够识别双链能够识别双链DNA分子的某种分子的某种特定核苷酸序列，特定核苷酸序列，并且使每一条链中并且使每一条链中特定部位的两个核特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二苷酸之间的磷酸二酯键断开酯键断开a名称名称作用作用参与的生理参与的生理过程或应用过程或应用作用位作用位点点(如图如图)DNA聚合酶聚合酶在脱氧核苷酸在脱氧核苷酸链上添加单个链上添加单个脱氧核苷酸脱氧核苷酸DNA的的a复制解旋酶复制解旋酶使使DNA碱基间碱基间的氢键断裂，的氢键断裂，把两条螺旋的把两条螺旋的双链解开双链解开DNA复制复制b特别提醒有关酶的进一步说明特别提醒有关酶的进一步说明(1)DNA连接酶无识别
14、的特异性，连接两个互补末端的连接酶无识别的特异性，连接两个互补末端的DNA片片段间的磷酸二酯键，而段间的磷酸二酯键，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有到已有DNA片段上，且需一条片段上，且需一条DNA链为模板。链为模板。(2)解旋酶打开碱基对之间的氢键，但氢键是分子间的静电引解旋酶打开碱基对之间的氢键，但氢键是分子间的静电引力，不需要通过酶的催化形成。力，不需要通过酶的催化形成。下列有关下列有关DNA连接酶的叙述正确的是连接酶的叙述正确的是()AT4DNA连接酶只能将双链连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间片段互补的黏性末端之间连接起来连接起来BEc
15、oli DNA连接酶能将双链连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连片段平末端之间进行连接接CDNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键酸二酯键DDNA连接酶可连接连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸双链的氢键，使双链延伸C解析解析 DNA连接酶能使两个连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键片段之间形成磷酸二酯键,从从而将它们连接起来。而将它们连接起来。Ecoli DNA连接酶只能将双链连接酶只能将双链DNA片段片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端片段平末端之间进行连
16、接。之间进行连接。T4DNA连接酶既可以连接酶既可以“缝合缝合”双链双链DNA片段片段互补的黏性末端，又可以互补的黏性末端，又可以“缝合缝合”双链双链DNA片段的平末端。片段的平末端。(2014江苏徐州高二质检江苏徐州高二质检)如图为如图为DNA分子在不同酶的作用下分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合聚合酶、酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A BC DC解析：本题考查不同工具酶的作用及作用特点。图示中解析：本题考查不同工具酶的作用及作用特点。图示中表表示该酶切割示该酶切割
17、DNA分子双链产生黏性末端的过程，用到的酶是分子双链产生黏性末端的过程，用到的酶是限制性核酸内切酶，限制性核酸内切酶，是黏性末端连接的过程，用到的酶是是黏性末端连接的过程，用到的酶是DNA连接酶，连接酶，是是DNA分子解旋的过程，要用解旋酶，分子解旋的过程，要用解旋酶，是是DNA复制时子链的形成过程，需要复制时子链的形成过程，需要DNA聚合酶。聚合酶。基因工程中常用载体基因工程中常用载体质粒质粒1来源：来源：质粒主要存在于细菌、酵母菌等生物中。质粒主要存在于细菌、酵母菌等生物中。2结构：结构：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并且具有自我复
18、制能力的双链环状之外，并且具有自我复制能力的双链环状DNA分子，如图分子，如图所示：所示：3标记基因标记基因：质粒上有一些特殊的基因，如抗四环素基因、：质粒上有一些特殊的基因，如抗四环素基因、抗氨苄青霉素基因，用于对重组抗氨苄青霉素基因，用于对重组DNA进行鉴定和选择。进行鉴定和选择。4载体的作用载体的作用(1)用它作为运载工具，将目的基因送入受体细胞中去。用它作为运载工具，将目的基因送入受体细胞中去。(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。5限制酶的选取原则限制酶的选取原则限制酶识别的切割位点，不能在载体的复制起始点、标记基限制酶识别的切割位
19、点，不能在载体的复制起始点、标记基因等载体必需的基因片段，切点所处位置必须在载体需要的因等载体必需的基因片段，切点所处位置必须在载体需要的基因片段之外，避免载体因目的基因的插入而失活或影响鉴基因片段之外，避免载体因目的基因的插入而失活或影响鉴定和筛选。定和筛选。特别提醒细胞膜上的载体与基因工程中的载体的区别特别提醒细胞膜上的载体与基因工程中的载体的区别(1)化学本质不同：细胞膜上的载体的化学成分是蛋白质；基化学本质不同：细胞膜上的载体的化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)、噬菌体的衍生噬菌体的衍生物，也可能是生物，如动植物病毒等。物，也
20、可能是生物，如动植物病毒等。(2)功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车分子运输车”，把目的，把目的基因导入受体细胞。基因导入受体细胞。目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图所示。构建的质粒载体，其主要结构如图所示。(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于构建人工质粒时要有抗性
21、基因，以便于_。(2)pBR322分子中有单个分子中有单个EcoR 限制酶作用位点，限制酶作用位点，EcoR 只能识别序列只能识别序列GAATTC，并只能在，并只能在G与与A之间切割。若之间切割。若在某目的基因的两侧各有在某目的基因的两侧各有1个个EcoR 的切点，请画出目的基的切点，请画出目的基因两侧被限制酶因两侧被限制酶EcoR 切割后所形成的黏性末端：切割后所形成的黏性末端：_。筛选筛选(鉴别鉴别)目的基因是否导入受体细胞目的基因是否导入受体细胞(3)pBR322分子中另有单个的分子中另有单个的BamH 限制酶作用位点限制酶作用位点,现将现将经经BamH 处理后的质粒与另一种限制酶处理后
22、的质粒与另一种限制酶Bgl 处理得到的处理得到的目的基因目的基因,通过通过DNA连接酶作用恢复连接酶作用恢复_键，成功获得键，成功获得了重组质粒，说明了重组质粒，说明_。磷酸二酯磷酸二酯两种限制酶两种限制酶(BamH 和和Bgl)切割得到的黏性末端相同切割得到的黏性末端相同(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和和tetR的大肠的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒
23、布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是对应的图二中的菌落表现型是_图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_。能抗氨苄青霉素，但不能抗四能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素环素pBR322质粒质粒解析解析(1)质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于筛选因，以便于筛选(鉴别鉴别)目的基因是否导入受体细胞。目的基因是否导入受体细胞。(2)同
24、一同一限制酶切割限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，根据题意可知分子产生的黏性末端相同，根据题意可知:该该目的基因两侧被限制酶目的基因两侧被限制酶EcoR 切割后所形成的黏性末端为：切割后所形成的黏性末端为：(3)DNA连接酶催化两个连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限分子片段连接，表明经两种限制酶制酶(BamH 和和Bgl)切割得到的切割得到的DNA片段，其黏性末端相片段，其黏性末端相同。同。(4)由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠
25、杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamH 作用后，标作用后，标记基因记基因tetR被破坏，而不能抗四环素，故多数大肠杆菌导被破坏，而不能抗四环素，故多数大肠杆菌导入的是入的是pBR322质粒。质粒。图一中有多个限制酶作用位点，对生物本身有何作
26、用？图一中有多个限制酶作用位点，对生物本身有何作用？在基因工程中有何好处？在基因工程中有何好处？提示提示：防止外源：防止外源DNA入侵细菌，是一种自我防御；在基入侵细菌，是一种自我防御；在基因工程中可供目的基因插入其中。因工程中可供目的基因插入其中。基因工程中基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,便于便于重组和筛选。已知限制酶重组和筛选。已知限制酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGATCC，限制酶，限制酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATC。根据图示判断下列操作正确的是。根据图示判断下列操作正确的是()A目的基因和质粒均用限制酶目的
27、基因和质粒均用限制酶切割切割B目的基因和质粒均用限制酶目的基因和质粒均用限制酶切割切割C质粒用限制酶质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割，目的基因用限制酶切割切割D质粒用限制酶质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割，目的基因用限制酶切割切割D解析：首先把目的基因切下来要用到限制酶解析：首先把目的基因切下来要用到限制酶；如果再用限；如果再用限制酶制酶切割质粒，则切割质粒，则2个标记基因都被切开，标记基因将失去个标记基因都被切开，标记基因将失去作用。若用限制酶作用。若用限制酶切割质粒可保留一个标记基因，而产生切割质粒可保留一个标记基因，而产生的黏性末端和限制酶的黏性末端和限制酶切割下来的目的基因可以互补配对。切割下来的目的基因可以互补配对。
