1、课题课题3 血红蛋白的提取和分血红蛋白的提取和分 离离 1、含量：占细胞干重的、含量：占细胞干重的50以上，是细胞中含以上，是细胞中含 量量最多的有机化合物最多的有机化合物。 2、组成元素：、组成元素：C、H、O、N 3、基本单位：氨基酸、基本单位：氨基酸 蛋白质小知识蛋白质小知识 氨基氨基 NH2 COOH 羧基羧基 H R C 4、分子结构：、分子结构： 氨基酸氨基酸 多肽多肽 蛋白质蛋白质 肽键：肽键：CONH 5、相对分子质量：、相对分子质量：高分子化合物高分子化合物 蛋白质小知识蛋白质小知识 脱水缩合脱水缩合 盘曲折叠盘曲折叠 1.图片对齐 在我们插入PPT图片或是输入文字的时候，为
2、了整齐都需要将插入的文本框对齐 ，但是又不想一个一个的进行操作，这时按住Ctrl键将需要进行对齐的文本选中 ，点击开始排列对齐垂直居中即可； 2.巧用格式刷 在制作PPT的时候为了保证PPT风格的统一，很多任通常会使用复制粘贴来确保 每一页PPT格式相同，这样对于少页数来说可以进行操作，但是碎玉多页面的话 就有点麻烦了，其实我们可以巧用格式刷：首先，在开始菜单栏下方有一个格式 刷，点击格式刷，很快就能看到效果； 3.去除所有动画效果 很多人在制作PPT的时候都是直接在模板库里下载模板进行使用的，但是下载的 模板大多数都是有幻灯片的，这样在演讲的时候很不方便，怎样将其进行去除呢 ？单击幻灯片放映
3、选择设置幻灯片放映，放映类型选择演讲者放映；换片方式 选择手动即可； 4.PPT快键 PPT逼格提升技巧逼格提升技巧 1、分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理 或化学性质的生物大分子。或化学性质的生物大分子。 2、蛋白质的分离和提取的原理是什么？、蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大 小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性 质和对其他分子的亲和力，等等，可
4、以用来分离质和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离 不同种类的蛋白质。不同种类的蛋白质。 思考思考 凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法） 1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相 对分子质量的大小，利用具有多孔网状结对分子质量的大小，利用具有多孔网状结 构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。 性质：微小的多孔球体性质：微小的多孔球体 本质：多糖类化合物本质：多糖类化合物 实例：葡聚糖、琼脂糖实例：葡聚糖、琼脂糖 凝胶色谱法分离蛋白质凝胶色谱法分离蛋白质 凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法） 2、原理：、原
5、理： 当当相对分子质量不同相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相的蛋白质通过凝胶时，相 对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通 道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量 较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对 分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 相对相对 分子质量分子质量 大大 小小 直径大小直径大小 大于大于凝胶颗粒孔凝胶颗粒孔 道
6、直径道直径 小于小于凝胶颗粒孔凝胶颗粒孔 道直径道直径 运动路径运动路径 被阻挡在凝胶颗被阻挡在凝胶颗 粒外面而迅速通粒外面而迅速通 过过 因扩散进入凝胶因扩散进入凝胶 颗粒内部而被滞颗粒内部而被滞 留留 运动速度运动速度 较快较快 较慢较慢 运动路程运动路程 较短较短 较长较长 洗脱次序洗脱次序 先先 后后 缓冲溶液缓冲溶液 1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强在一定的范围内，能对抗外来少量强 酸、强碱或稍加稀释不引起溶液酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化发生明显变化 的溶液。的溶液。 2、作用：、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的能够抵制外界的酸或碱的对溶液的 p
7、H的影响，维持的影响，维持pH基本不变。基本不变。 3、配制：、配制：通常由通常由12种缓冲剂溶解于水中配制种缓冲剂溶解于水中配制 而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同 pH范围内使用的缓冲液。范围内使用的缓冲液。 还记得人体血液中的缓冲液吗？还记得人体血液中的缓冲液吗？ H2CO3 /NaHCO3 NaH2PO4 /Na2HPO4 你认为在血红蛋白整个实验中用的你认为在血红蛋白整个实验中用的 缓冲液是什么？目的是什么？缓冲液是什么？目的是什么？ 本实验使用的是本实验使用的是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的是利用，目的是利用 缓冲液模拟细胞内的缓冲液模
8、拟细胞内的pHpH环境，保证血红蛋环境，保证血红蛋 白的正常结构和功能，便于观察（白的正常结构和功能，便于观察（红色红色） 和科学研究（和科学研究（活性活性）。）。 电泳电泳 1、概念：、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的指带电粒子在电场作用下发生迁移的 过程。过程。 2、原理：、原理： 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离 的基团，在一定的的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。下，这些基团会带上正电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相 反的电极移动
9、。反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及 分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移 速度，从而实现样品中各种分子的分离。速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3、类型：、类型：琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳 应用：测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定应用：测定蛋白质分子量、进行蛋白质纯度鉴定 原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决原理：蛋白质
10、在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 SDS：消除净电荷对迁移率的影响。：消除净电荷对迁移率的影响。 电泳电泳 实验操作步骤实验操作步骤 样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定 水分水分 血浆血浆 固体物质固体物质 血液血液 白细胞白细胞 血细胞血细胞 血小板血小板 红细胞红细胞 血红蛋白（血红蛋白（90） 血红蛋白的组成血红蛋白的组成 血红素基因血红素基因 可携带一分子可携带一分子 O2或一分子或一分子 CO2 1、 红细胞的洗涤红细胞的洗涤 2、血红蛋白的释放、血红蛋白的释放 3、分离血红蛋白溶液
11、、分离血红蛋白溶液 4、透析、透析 （一）样品处理（一）样品处理 问题：问题： 1、刚采集的血样要做、刚采集的血样要做 怎样的处理？为什么？怎样的处理？为什么？ 加入抗凝血剂，加入抗凝血剂， 防止血液凝固。防止血液凝固。 2、怎样洗涤？、怎样洗涤？ 采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次 低速短时间离心低速短时间离心 生理盐水生理盐水 1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤 3、洗涤的目的是什么？、洗涤的目的是什么？ 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 4、洗涤干净的标志是什么？、洗涤干净的标志是什么？ 直至上清液不再呈现黄色
12、，表明红细胞已洗涤干直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干 净。净。 1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤 2、血红蛋白的释放、血红蛋白的释放 问题：问题： 加蒸馏水和甲苯的作用是什么？加蒸馏水和甲苯的作用是什么？ 使红细胞破裂，释放出血红蛋白。使红细胞破裂，释放出血红蛋白。 有机溶剂有机溶剂（无色透明的甲苯层）（无色透明的甲苯层） 脂类物质脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）（白色脂溶性物质沉淀层） 血红蛋白溶液血红蛋白溶液（红色透明液体）（红色透明液体） 红细胞破碎物沉淀（红细胞破碎物沉淀（ 暗红色沉淀物）暗红色沉淀物） 3、分离血红蛋白溶液、分离血红蛋白溶液 高速离心滤纸过滤漏斗分液高速离心滤
13、纸过滤漏斗分液 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 1、 凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作 打孔挖穴安管覆网纱包插管 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填 固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡 3、样品的加入和洗脱、样品的加入和洗脱 调节缓冲液面滴加透析样品样品渗入凝胶床 洗脱收集分装蛋白质 2、凝胶色谱柱的装填、凝胶色谱柱的装填 固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱 洗涤平衡 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 沸水浴加热沸水浴加热 紧密紧密 (pH为为7.0) 不得有气泡不得有气泡 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 3、样品的加入和洗脱、样品的加入和洗脱 调节缓冲液面滴加透析样品样品渗入凝胶床 洗脱
14、收集分装蛋白质 磷酸缓冲液磷酸缓冲液 (1)不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面 (pH为为7.0) (2)贴壁加样贴壁加样 (3)使吸管管口沿管壁环绕移动使吸管管口沿管壁环绕移动 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 蛋白质的提取和分离步骤蛋白质的提取和分离步骤 1、样品处理、样品处理 通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集 血红蛋白溶液。血红蛋白溶液。 2、粗分离、粗分离 经过透析去除分子量较小的杂质。经过透析去除分子量较小的杂质。 3、纯化、纯化 通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白质除去。通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白
15、质除去。 4、纯度鉴定、纯度鉴定 通过通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。 收集得到的纯化后的收集得到的纯化后的血红血红蛋白蛋白 血 红 蛋 白 的 取 和 分分 离 凝胶色谱法 原 理 分离过程 凝胶电泳法 缓冲溶液 组 成 作 用 蛋白质的 提取分离 样品处理 粗 分 离 纯 化 纯度鉴定 血血 红红 蛋蛋 白白 的的 提提 取取 和和 离离 蛋白质分子的差异性 蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性 凝胶色谱法 原 理 分离过程 凝胶电泳法 凝胶色谱法凝胶色谱法 原原 理理 分离过程分离过程 凝胶电泳法凝胶电泳法 缓冲溶液 组 成 作 用 缓冲溶液缓冲溶液 组
16、组 成成 作作 用用 蛋白质的 提取分离 样品处理 粗 分 离 纯 化 纯度鉴定 蛋白质的蛋白质的 提取分离提取分离 样品处理样品处理 粗粗 分分 离离 纯纯 化化 纯度鉴定纯度鉴定 问题：问题： 1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲 液处理的目的是什么？液处理的目的是什么？ 让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。 2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？ 这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 血红蛋白是有色蛋白，
17、因此在凝胶色谱分离时可以血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以 通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这 使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验 操作。操作。 练习巩固：练习巩固： 1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究 和应用越来越深入，首先要做的一步是（和应用越来越深入，首先要做的一步是（ ） A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成
18、过程 D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质 2、使用使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质 的电泳迁移率完全取决于（的电泳迁移率完全取决于（ ） A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小 C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异 D B 3、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白 质的叙述，正确的是（质的叙述，正确的是（ ） A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的 蛋白质蛋白质 B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相
19、对分子质量较大相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大 的蛋白质的蛋白质 C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大 的蛋白质的蛋白质 D 二者根本无法比较二者根本无法比较 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是（、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是（ ） A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固 A D 5、一分子血红蛋白最多可携带的一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子数或者分子数或者 CO2分子数分别是分子数分别是（ ） A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、1 6、下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，、下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作， 其中正确的是（其中正确的是（ ） A可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料 B用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤红细胞 C血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液 B A
