1、常用生物学实验技术 马 军,目的,一、生命科学相关实（试）验内容 二、常用生物学实验技术 三、实验室安全,一、生命科学相关实（试）验内容,临床试验：在人体进行药物的研究，明确药物的作用、不良反应、药代动力学，确定药物的疗效与安全性。 临床试验一般分为I、II、III、IV期临床试验。也包括细胞及其他生物制品、外科治疗、放射治疗、医疗器械、行为疗法 对象：人 伦理：伦理委员会，知情同意,伦理委员会批准-赫尔辛基宣言,1964年世界医学协会通过赫尔辛基宣言关于进行人体医学研究的准则和方法。1975年、1983年、1996年修订，2000年重新修订，特别强调了人体医学研究中对特殊人群和弱势人群权益的
2、保护。,临床试验分为I、II、III、IV期。 上市前，I、II、III期临床试验 上市后，IV期临床试验 I期临床试验：初步的临床药理学及人体安全性评价试验。观察人体对于新药的耐受程度和药代动力学，为制定给药方案提供依据,II期临床试验：治疗作用初步评价阶段。 目标适应症患者的治疗作用和安全性 试验设计多样化（如随机盲法）。 III期临床试验：治疗作用确证阶段。 为药物注册申请的审查提供充分的依据。试验一般应为具有足够样本量的随机盲法对照试验。 IV期临床试验：新药上市后的应用研究阶段。 药物的疗效和不良反应、改进给药剂量。,样本含量估算方法 药品注册管理办法对临床试验病例数的规定：期为20
3、30例，期为100例，期为300例，期为2000例。,临床试验注册,http:/www.chictr.org/cn/,https:/clinicaltrials.gov/,基础实验,二、常用生物学实验技术,（一）基因相关技术 （二）蛋白质相关技术 （三）细胞培养技术 （四）动物实验,（一）基因相关技术,核酸提取 表达检测 PCR、原位杂交、膜杂交（Northern-Blot、Southern-blot） 基因工程 转基因细胞或动物、工程化抗体或疫苗制备,基因研究简史,1838年发现蛋白质，1869年发现DNA,19世纪,1910,发现染色体上存在基因,1941,基因可以编码蛋白酶,1944,D
4、NA是最基本的遗传物质,1953,DNA双螺旋结构,1961,认识mRNA,1966,发现遗传密码,1972,体外合成DNA,1973,克隆DNA,发现转录酶,1973,1977,DNA测序技术,2001,1986,创建PCR技术,小干扰RNA（miRNA）,1993,人类基因组计划,2006,非编码RNA（noncoding RNA）的调控作用,基因研究的临床应用,1.小分子分子靶向药物 肺癌吉非替尼、厄洛替尼片 2.血液学标志物 如肿瘤标志物 3.单抗药物 风湿病IL6抗体、TNFa抗体， 4.基因治疗 如B细胞性淋巴瘤、白血病CAR-T（CD19、CD20）,DNA的操作,DNA的来源：
5、新鲜、石蜡包埋组织、血液、体液、毛 发、质粒、细胞、微生物、植物 DNA抽提试剂：苯酚/氯仿法、试剂盒（吸附柱） 原理：裂解原材料（酶、碱）、分离DNA和其他成分、 离心分离、除分离液成分 注意事项：彻底裂解、小心抽吸、 取材应在试剂能力范围内,Qiagen试剂盒操作步骤,裂解 结合 一洗 二洗,洗脱 收集,浓度测定：紫外分光光度仪（OD260和OD280） 完整性检测：琼脂糖凝胶电泳,依据OD260值计算DNA浓度,RNA抽提,步骤和DNA类似 RNA非常容易降解，减少操作时间；所用试剂、耗材要无RNase 标本低温处理（液氮、冰上），抽提过程低温（6-10 ）。 RNA在无水乙醇、Triz
6、ol中-80保存2-3年 建议使用匀浆机,X ,PCR技术,PCR聚合酶链反应 利用酶的作用+特殊的引物，可在体外复制特定区域的DNA片段 常用PCR种类： 1.逆转录PCR(RT-PCR)：以由mRNA逆转录而来的DNA为模板，检测基因的mRNA表达量。 2.热启动PCR(hot start PCR)：以高热活化型核酸聚合酶进行反应，提高PCR特异性。 3.实时定量PCR(real-time PCR)：PCR过程中利用萤光探针或染料定量检测靶基因的表达量。 4.巢式PCR(nested PCR)：先用低特异性引物扩增几个循环以增加模板数量，再用高特异性引物扩增。 5.多重PCR(multip
7、lex PCR)：在同一个管中使用多组引物。,PCR技术主要用于基因表达水平的检测（DNA、mRNA） mRNA表达量的检测，需要先将提取的RNA或mRNA反转录成cDNA。 反应成分：反应液（Mg2+）、模板、引物、Taq DNA合成酶、dNTPs 热循环：热变性、退火、延伸，20-40循环。,引物设计：20nt左右，二聚体、发夹结构，横跨内含子 产物：数十个碱基（探针法）；500碱基（sybrGreen） 扩增循环数：30个左右 引物设计软件：在线、Primer primer5、Oligo,RT-PCR的引物设计 （防止DNA污染）,核酸杂交技术,原理：核酸双链的变性、解链、复性、再结合
8、Northern-blot RNA Southern-blot DNA 原位杂交（细胞、组织切片）（RNA或DNA）,全基因组测序 SNP 即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点，是继微卫星之后的第三代遗传标记。有些SNP位点还会影响基因的功能，从而导致生物性状改变甚至致病。 全基因组关联研究（Genome Wide Association Studies,GWAS）是一种检测特定物种中不同个体间的全部或大部分基因，从而了解不同个体间的基因变化有多大的一种方法,基因芯片,1. 基因芯片（Gene chip）又称DNA芯片(DNA
9、chip)，DNA微阵列（DNA microarray） 2.蛋白芯片（Protein chip） 3.其他芯片 细胞芯片、组织芯片、糖芯片及其他类型的生物芯片 基因芯片的新发展 基因组（比较基因组等） 转录组（表达谱、miRNA、lncRNA芯片等）,Affymetrix：世界上最早的芯片公司 国内芯片公司：博奥、欧易 Mammaprint：第一个被FDA批准的临床基因芯片 70个乳腺癌相关基因，用于判断转移 和复发危险度。,基因克隆和载体技术,基因克隆（gene cloning）:把基因片段通过无性繁殖转到另一个生物体内的过程。 基因克隆技术: 包括基因的获取、基因的重组、基因的克隆化和基
10、因的表达等。 蛋白质工程：基因克隆下游的相关技术,转基因方法,感染 通过病毒介导，用基因组中携带有克隆目的片断的病毒来感染靶细胞,转染 通过生化或者物理方法将目的基因导入真核细胞中 。,显微注射 磷酸钙沉淀 电穿孔 脂质体,RNA病毒 逆转录病毒、HIV DNA病毒 腺病毒、腺相关病毒,选定目的基因 载体的选择 克隆载体 表达载体 原核 真核 质粒、粘粒 噬菌体 病毒,病毒载体特点,病毒作为基因转移是基因递送良好的工具，病毒载体的优点有：（1）在转化的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定的遗传成分；（2）可能将有缺陷的或突变的基因置于病毒调节信号的控制下以进行研究；（3）能将克隆的基因作为病毒微
11、染色体的一部分 ，并能进行分离；（4）转移效率较高。 其主要缺点是病毒载体对外源基因的最大容纳量只有2500bp。目前常用的病毒载体有下列几种。,基因工程下游技术,工程菌大规模发酵参数 新型生物反应器 高效分离介质及装置的开发 分离纯化的优化控制 生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造,基因敲除,基因敲除是将基因组中特定基因去除、替代、灭活，然后从细胞或整体水平观察基因的功能。 基因沉默（gene silencing）常用RNAi技术，细胞水平 基因敲除（gene knockout）常用Cre-loxP技术，动物体内研究，如动物基因缺陷模型,（二）蛋白相关实验技术,PAGE电泳 Western
12、-blot ELISA 免疫组化 组织荧光,PAGE电泳和双向电泳,介质：聚丙烯酰胺 原理：分子量大小（分子形状） 电流 染色（丽春红、考马斯亮蓝、银染）,按等电点先分离第一向，按分子量分离第二向,Western-blot,蛋白质印迹 检测细胞、组织中特定蛋白的表达量 用抗体检测，属免疫学检测手段之一 原理：抗体-抗原结合,X光片 成像仪,同位素 荧光素,Western blot技巧,蛋白不能降解（冰上操作、用蛋白酶抑制剂） 断裂核酸（针头抽吸、超声破碎） 一抗选择很重要 抗体浓度要摸索 二抗浓度不易太高 ECL要适量,蛋白降解 蛋白完好,曝光过度 曝光适当,免疫组化,应用免疫学和组织化学技术
13、，对特定抗原（蛋白）进行定性、定量、定位检测。 标本：组织切片（固定、冰冻）、细胞涂片、爬片。 试剂：抗体、显色剂等 显色：DAB、NBT/BCIP、荧光等。 注意事项：内源性生物素干扰、控制显色时间、设立对照,ELISA,用酶标记抗体（或抗原）在体外与抗原（或抗体）结合，通过相应底物被酶解后出现显色反应，定量检测抗原（或抗体）。 特点：灵敏、特异 类型： 双抗体夹心法、竞争法、间接法等,双抗体夹心法 竞争法 间接法,蛋白芯片,蛋白芯片：原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的
14、待测蛋白,（三）细胞培养和检测技术,从体内组织取出细胞，在体外模拟体内环境下使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群，或者组织、器官。 原代培养： 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 传代培养： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。,无菌操作,细胞培养间 超净工作台或生物安全柜 紫外光或臭氧消毒灭菌 微孔滤膜,培养细胞的生长方式 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞,密度抑制,恶
15、性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（Density Inhibition）。,细胞冻存和复苏 冻存和复苏的原则：慢冻快融 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化（30-40代）。 标准程序：细胞冻存器 当温度在-25 以上时， 12 /m
16、in 当温度达-25 以下时， 510 /min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,细胞活力检测,克隆形成率 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率克隆形成数接种细胞数 缺点：操作繁琐 优点：精确、可靠,台盼兰染色 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力 活细胞总数100 活细胞率（ ） 活细胞总数死细胞
17、总数,MTT比色法 是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 CCK-8比色法 1.产生的formazan都是水溶性，检测灵敏度更高。 2.更加稳定，酚红和血清对其测定无明显影响 对细胞无明显毒性， 3.加入显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，使检测时间更加灵活，便于找到最佳测定时间,注意事项,微生物污染 细菌 支原体污染 真菌污染 湿度 温度
18、 宁低勿高 CO2浓度 宁酸勿碱,流式细胞学检测,FITC-Annexin V检测试剂盒 活细胞，磷脂酰丝氨酸（PS）位于胞膜内，在凋亡的细胞，PS 翻转到细胞膜外表面，Annexin-能与PS高亲和力结合 胞膜胞内蛋白检测 细胞膜或细胞内蛋白表达,侵袭和迁移实验,侵袭实验：常用8.0、12.0m膜。上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。 趋化/迁移实验：常用5.0、8.0、12.
19、0m膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。,迁移实验 侵袭实验,（四）实验动物,动物保护 动物选择 小鼠、大鼠、哺乳动物、灵长类 小鼠 清洁级（近交系、封闭群）、裸鼠、转基因、基因敲除。 裸鼠 无菌、近交系，无胸腺-T细胞缺乏 动物的处死 麻醉、CO2、断颈 动物尸体的处理,实验室事故频发多源于科研人员粗心大意！ 94年清华女研究生铊中毒 2010年东北农业大学实验室感染事件中，28名师生被发现感染布鲁氏菌病 92年某实验室浓硝酸引燃拖布 浓硝酸具有强氧化性， 与易燃物和有机物(如糖、纤维素、木屑、
20、棉花、稻草或废纱头等)接触会发生剧烈反应，甚至会引起燃烧。,三、实验室安全,微波炉爆炸：加热培养基、融化琼脂糖凝胶,天津8-12大爆炸,隐患（1）,仪器种类多 分布广 研究生实验技术培训少 研究生流动性大 岗前培训欠缺 安全意识差 事故发生的潜在性、突发性,隐患（2）,1.化学试剂安全知识 强酸：盐酸、硫酸、磷酸等 强碱：氢氧化钠、氢氧化钾等 易燃易爆：乙醇、甲醇、二甲苯等 腐蚀性：酶、苯酚等 毒性物质：氰化钾、铊 2.生物安全 微生物、血清制品 3.锐器 玻璃、针头 4.仪器安全使用、紫外线、防火、防水、防盗 5.医疗废物 生化物品垃圾（黄）、生活物品垃圾（黑）,防毒 防火 防爆 防灼伤 防盗 防水 防传染病 防电,实验记录,目的 方法 结果：数据、描述、图、表、照片 总结 改进措施,网络资源, http:/www.protocol-online.org/ http:/ （丁香园） 生物谷、生物通,谢 谢！,
