1、 细胞学检测 分子生物学检测辐射生物学研究方法细胞克隆实验The Clonogenic Assay 克隆实验最早是细菌物学家用来检测细菌存活的一种实验手段。Puck和Marcus将此方法引入到细胞生物学中 单个细胞在petri dish中生长并形成一个肉眼可见的克隆辐射生物学研究方法细胞细胞辐照受损伤未受损伤克隆克隆细胞克隆实验The Clonogenic Assay辐射生物学研究方法细胞克隆实验The Clonogenic Assay辐射生物学研究方法5细胞克隆实验The Clonogenic Assay辐射生物学研究方法Hela细胞的辐射-存活曲线第一个发表的哺乳动物存活曲线细胞克隆实验T
2、he Clonogenic Assay辐射生物学研究方法7细胞活力实验MTT Assay辐射生物学研究方法 MTT（3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3，5-di-phenytetrazoliumromide），又名噻唑蓝MTT琥珀酸脱氢酶黄色甲臜 蓝紫色结晶DMSO溶解后570nm测OD值MTT一种黄色化合物，能接受氢离子的染料。在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的甲臜（formazan）结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）MTT工作液制备（5mg/ml）：M
3、TT粉末+PBS 0.22m滤膜过滤除菌及杂质，4 避光保存 吸取待测细胞的原培养基，按一定比例（一般为0.5%MTT）加入新鲜培养基和MTT工作液，37 继续培养4h 吸取培养基与MTT混合物，加入DMSO溶解细胞内结晶 酶标仪570nm出测定OD值8细胞活力实验MTT Assay辐射生物学研究方法 处理组的OD570细胞活性（%）=x100%对照组OD570细胞活力实验MTT Assay辐射生物学研究方法l实验过程中注意避光lMTT和DMSO对实验者均有伤害，注意戴手套l测定OD值时注意对照和空白的设置，空白一般用蒸馏水（DI water）即可l为保证结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.
4、7之间Clonogenic Assay MTT细胞活力实验MTT Assay辐射生物学研究方法流式细胞术（Flow Cytometry）FCMFCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的技术和分选的技术FALS SensorLaser辐射生物学研究方法 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量辐射生物学研究方法
5、流式细胞仪的分析及分选原理 工作原理：工作原理：FCMFCM是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。微荧光脉冲分光光度仪。基本组成结构基本组成结构：液流系统液流系统：样品流和鞘流样品流和鞘流 光学系统光学系统：激光激光、透镜组、光电倍增管等。、透镜组、光电倍增管等。数据处理系统数据处理系统辐射生物学研究方法Injector TipSheath fluid样品流和鞘流液流系统辐射生物学研究方法流动室Laser Flow Cell孔径50-200m 检测区离喷口200m有分选功能 辐射生物学研究方法PMTPMTPMTPMTDic
6、hroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234Flow cell 激光、透镜组、光电倍增管等光学系统 辐射生物学研究方法细胞组成细胞组成细胞功能细胞功能大小大小细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核核-特异性抗原特异性抗原粒度粒度细胞活性细胞活性DNA,RNADNA,RNA含量含量胞内细胞因子胞内细胞因子蛋白质含量蛋白质含量激素结合位点激素结合位点钙离子钙离子,PH,PH值值,膜电位膜电位酶活性酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性辐射生物学研究方法 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不
7、同。产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。不同特征。线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器荧光测量辐射生物学研究方法荧光测量辐射生物学研究方法FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光细胞悬液异硫氰酸
8、荧光素得州红能量传递复合染料藻胆蛋白类几种常见的荧光染料辐射生物学研究方法荧光染料 激发波长（nm)发射波长（nm)颜色FITC 488 525 深蓝色PE(RDI)488 575 橙色ECD 488 620 橙红色PeCy-5 488 670 红色PeCy-7 488 755 深红色PI 488 620 橙红色APC 633 670 红色几种常见的荧光染料辐射生物学研究方法流式细胞仪测定细胞周期时相 原理：细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C PI（Propidium Iodide）：一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DN
9、A后释放红色荧光。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm 利用PI标记，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比辐射生物学研究方法实验步骤 待测细胞酶解收集单细胞悬浮液 PBS洗涤后，70%预冷乙醇，4避光固定30min 加BSA，重悬细胞于PBS，离心去上清 重悬细胞于含RNA酶的PBS缓冲液中，37 避光处理30min 加PI染色，过滤后上流式细胞仪分析辐射生物学研究方法流式分析细胞周期时相分布辐射生物学研究方法细胞实时摄像技术辐射生物学研究方法Live Cell Imaging By Phase,DIC&Pol Micros
10、copyImmunofluorescence Microscopy of Microtubules(Green)&Chromosomes(Red)In Mitotic PtK1 Cell细胞实时摄像技术辐射生物学研究方法 优点：可以得到准确的细胞周期时间及分优点：可以得到准确的细胞周期时间及分裂间裂间 期和分裂期的准确时间期和分裂期的准确时间 缺点：缺乏对细胞群体的指征性缺点：缺乏对细胞群体的指征性细胞实时摄像技术辐射生物学研究方法l碱基变化 l脱氧核糖变化lDNA链断裂 单链断裂（SSB）双链断裂（DSB）l交联 DNA链交联 DNA-蛋白质交联 其中DSB是辐射所致生物学效应中最重要的原初
11、损伤，而非重接性的DSB则被认为是细胞杀伤效应的最重要的损伤电离辐射致DNA分子的变化辐射生物学研究方法DNA链断裂示意图单链断裂双链断裂单链断裂：是DNA双螺旋结构中一条链断裂双链断裂：是DNA的两条互补链于同一对应处或相邻处同时断裂辐射生物学研究方法凝胶电泳 原理原理：DNA带负电，外加电场后，DNA片段会在凝胶中移动且移动的速度跟片段大小有关 步骤步骤：制胶 点样 电泳 染色 观察 DNADNA分子种类分子种类 线状DNA单链与双链，ss-DNA电泳时要注意局部区域形成ds-DNA，造成迁移距离不确定 环状DNA单链（如M13mp）和双链（质粒DNA）线状ds-DNA电泳使用频率最高的一
12、种电泳 环状ds-DNA电泳:常用于质粒DNA的初步鉴定 线状ss-DNA电泳辐射生物学研究方法单细胞凝胶电泳或彗星试验 原理：原理：由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出后又经Singh N P和Olive P I进一步完善的一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法。因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验(comet assay)。它是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记，具有极高的实用价值。目前该技术已广泛地应用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的DNA损伤和修复的研究 辐射生物学研究方法辐射生物
13、学研究方法实验步骤辐射生物学研究方法辐射生物学研究方法 定义：定义：微核微核(Micronucleus)(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，的产生与染色体损伤有关，是是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核质内，因比主核小，故称微核 微核试验微核试验(Micronucleus test(Micr
14、onucleus test，MNT)MNT)是观察受试物能否产生是观察受试物能否产生微核的试验。微核的试验。其主要可检出其主要可检出DNADNA断裂剂和非整倍体诱变剂断裂剂和非整倍体诱变剂微核试验辐射生物学研究方法实验原理 细胞质中微核来源：细胞质中微核来源：断片或无着丝粒染色体在细断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。辐射生物学研究方法实验步骤37辐射生
15、物学研究方法 统计1000个以上双核细胞内含有微核的细胞占的比例 含有微核的双核细胞数 微核率=1000 含有双核细胞的总数结果统计辐射生物学研究方法MNNCE辐射生物学研究方法简介简介：荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.荧光原位杂交（FISH）辐射生物学研究方法 原理：用已知的标记单
16、链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位 优点：与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点41辐射生物学研究方法根据所用的探针和靶核酸的不同可分为三类：DNA-DNA杂交；DNA-RNA杂交；RNA-RNA杂交。根据探针的标记物是否能直接被检测可分为两类：直接法：探针用放射性同位素、荧光素或一些酶标记，当与组织细胞内靶核酸形成杂交体后，可分别通过放射性自显影、成
17、色的酶促反应、荧光等来显示靶核酸的位置。间接法：一般都是用半抗原来标记探针，如生物素、地高辛等，然后通过用免疫组织化学对半抗原的定位，间接地显示探针与组织细胞内靶核酸所形成的杂交体。辐射生物学研究方法 探针及标本的变性：DNA变性成单链 杂交：探针与待测样本充分结合 洗脱：洗去未结合探针 杂交信号的放大 封片：延长保存时间 荧光显微镜观察FISH结果实验步骤辐射生物学研究方法整条染色体涂染通过整条染色体涂染判断易位染色体辐射生物学研究方法荧光染色检测DSB原理：原理：DSB产生时，会有特异性蛋白53BP1以及-H2AX 产生，利用这两种蛋白的抗体进行原位免疫荧光染色，通过荧光显微成像术获得细胞
18、及特征蛋白的荧光图像后,分析图像中阳性细胞的比例来评估旁细胞的损伤程度 辐射生物学研究方法辐射生物学研究方法辐射生物学研究方法概念概念:两个不同来源的、含有互补核苷酸顺序的单股核酸分子，通过碱基配对形成一个新的、稳定的双股分子的过程原理原理:核酸经加热变性后，低于变性温度20-30时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核苷酸片段核酸杂交技术辐射生物学研究方法核酸杂交原理图辐射生物学研究方法l根据标记物的性质分：放射性标记:32P,35S,125I,3H 非放射性标记：化学发光标记、酶标记、荧光标记等敏感度高，半衰
19、期短（32P 14.3天，35S 87.1天，125I 60天，3H的半衰期长达12.3年，但它所释放放射线能量太低，只能用于组织原位杂交），有辐射危害探针的分类辐射生物学研究方法探针的分类 根据探针中核酸的性质分：根据探针中核酸的性质分：DNA(包括cDNA)探针RNA探针(包括cRNA)寡核苷酸探针肽核酸（peptide nucleic acid,PNA）探针辐射生物学研究方法实验步骤辐射生物学研究方法核酸限制性内切酶 原理：原理：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA辐射生物学研究方法四类限制性内切酶识别位点及产物辐射生
20、物学研究方法DNA 1g反应 10缓冲液2L重蒸水19L1L酶液+用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底混匀反应体系后，37水浴保温2-3h每管加入2L 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，电泳检测EP管编号,加样实验步骤辐射生物学研究方法 Southern Blotting Northern Blotting辐射生物学研究方法Southern Blotting膜上检测膜上检测DNADNA的杂交技术，的杂交技术，19751975年由年由Edwin SouthernEdwin Southern建立。建立。将待测将待测DNADNA序列结合到一定的支持物上，然后与存在于液序列结合到一定的支
21、持物上，然后与存在于液相中的核酸探针分子进行杂交的过程，是目前最常用的一相中的核酸探针分子进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法种核酸分子杂交方法辐射生物学研究方法印迹方法 虹吸印迹法 真空转移法 电转移法辐射生物学研究方法虹吸转移法 利用毛细管的利用毛细管的虹吸作用虹吸作用由移动缓冲液带由移动缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上动核酸分子转移至滤膜上辐射生物学研究方法 利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中通过凝胶利用真空泵将转移缓冲液从上层容器中通过凝胶抽到下层真空室中，同时带动核算分子快速转移抽到下层真空室中，同时带动核算分子快速转移到凝胶下面的滤膜上。该法的最大优点是快速，到凝胶下面
22、的滤膜上。该法的最大优点是快速，转膜的同时进行转膜的同时进行DNADNA的变性和中和，整个过程只的变性和中和，整个过程只需需1h1h左右左右真空转移法辐射生物学研究方法电转移法辐射生物学研究方法实验步骤I.I.核酸的制备核酸的制备II.II.电泳电泳III.III.印迹印迹IV.IV.预杂交预杂交V.V.杂交杂交VI.VI.洗膜洗膜VII.VII.检测检测辐射生物学研究方法Northern Blotting Northern Blotting是将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针针对固定在膜上的RNA进行杂交。其基本原理
23、与Southern Blotting相同，只不过变性方法不能采用碱变性法（碱会导致RNA水解），一般采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛等变性法。主要用于分析mRNA的转录或者mRNA分子的大小辐射生物学研究方法 原理，方法及步骤与Southern Blotting类似Northern Blotting辐射生物学研究方法定义：定义：是通过模拟体内 DNA 复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术，由美国科学家Kary B.Mullis提出原理：原理：PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催
24、化作用，经过DNADNA变性变性、引物与模板结合引物与模板结合（复性）和延伸延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段PCR定义及原理辐射生物学研究方法PCR反应混合物 引 物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA 多 聚 酶rTth DNA 多 聚 酶AmpErase（UNG酶）和 或 和辐射生物学研究方法实验步骤1.1.引物设计与合成引物设计与合成2.2.DNADNA模板的变性模板的变性3.3.模板与引物的结合模板与引物的结合（退火或复性）（退火或复性）4.4.引物延伸引物延伸以上为一次以上为一次PCRPCR循环（变循环（变性、复性和延伸），性、复性和延伸），新合成
25、的链可作为下新合成的链可作为下一轮循环的模板一轮循环的模板辐射生物学研究方法逆转录PCR（RT-PCR）以反转录的以反转录的cDNAcDNA作模板所进行的作模板所进行的PCRPCR，可对基因，可对基因的表达和序列多态性分析的表达和序列多态性分析辐射生物学研究方法 原理：原理：通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程中每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量PCR 荧光标记方式荧光标记方式Quantitative Real-time PCRSYBR荧光染料（SYBR green)TaqMan 探针发夹型杂交探针辐射生物学研究方法5TaqManPro
26、beForwardPrimer53535ReversePrimer535535ForwardPrimerReversePrimerPolymerizationDisplacementQRRQQuantitative Real-time PCR辐射生物学研究方法Cleavage535355535535Polymerization CompletedRQ33RQQuantitative Real-time PCR辐射生物学研究方法标准曲线 可作为判断模板起始浓度的依据 一般以质粒梯度稀释再进行PCR得到辐射生物学研究方法DNA介导的基因转移 研究与辐射相关基因最好的方法就是将该基因转入自身无表达的
27、细胞系中，再通过基因的表达情况以及细胞的应激调控来确定该基因的功能辐射生物学研究方法 微注射：微注射：通过毛细管直接将外源DNA注射入宿主细胞核内。但难度大，每次只能对一个细胞进行操作，效率低 磷酸钙沉淀：磷酸钙沉淀：磷酸钙能使DNA沉淀形成大的聚合物，某些细胞能摄入这种形式的DNA。该方法最为经典，但原理尚未知 电穿孔：电穿孔：短时间的电脉冲处理能在悬浮细胞的膜上形成暂时打开的孔洞，为外源基因的进入打开了通道。该法适合磷酸钙沉淀法无法处理的细胞 病毒载体：病毒载体：逆转录病毒携带的遗传物质是RNA，当转入宿主体内后，在病毒逆转录酶的作用下转成DNA，再掺入宿主的基因组内，同宿主基因一起复制，
28、转录。缺点是转导的外源基因大小受限制 脂质体：脂质体：将DNA包裹在人工制备的磷脂双分子层的膜状结构内，通过脂质体与细胞膜的融合而将DNA导入细胞内DNA介导的基因转移辐射生物学研究方法DNA文库 定义：定义：某一特定来源DNA通过细胞DNA克隆技术构建呈含有所用DNA片段的重组DNA分子，并转化至细菌内，构成DNA文库。依据DNA的来源不同，可分为，基因组DNA文库和cDNA文库 cDNAcDNA文库文库 ：某种生物的基因组的转录部分或全部的mRNA经反转录，产生大量的cDNA片段，然后通过克隆载体，将这些cDNA片段贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就是这种生物的cDNA文库 辐射生物学研
29、究方法1 1）提取研究对象基因组提取研究对象基因组DNA,DNA,制备合适大小的制备合适大小的DNADNA片断，片断，或提取组织或器官的或提取组织或器官的mRNAmRNA并反转录成并反转录成cDNAcDNA2 2）DNADNA片段或片段或cDNAcDNA与经特殊处理的载体连接形成重组与经特殊处理的载体连接形成重组DNADNA3 3）重组重组DNADNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体菌转化宿主细胞或体外包装后浸染受体菌4 4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择阳性重组菌落或噬菌斑的选择构建基因文库的基本程序辐射生物学研究方法基因组DNA文库的构建辐射生物学研究方法插cDNA文库的构建辐射生物学研究方法
30、限制性核酸内切酶分析限制性核酸内切酶分析SouthernSouthern杂交杂交体外表达蛋白体外表达蛋白DNADNA序列分析，序列分析，最准确和可靠的鉴定方法最准确和可靠的鉴定方法克隆基因的验证和分析辐射生物学研究方法DNA测序 双脱氧双脱氧DNADNA链合成终止法链合成终止法 （dideoxydideoxy-mediated chain-termination method mediated chain-termination method）原理：原理：反应体系中被掺入了2，3-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时,由于它没有3-OH，不能再与其它的脱氧核苷酸形成3,
31、5-磷酸二酯键，DNA合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP，则新生链的末端就是A，依次类推可以通过掺入ddTTP、ddCTP、ddGTP，则新生链的末端为T、C或G，根据这个原理，Sanger与1977年建立了双脱氧链终止测序法。他本人也因此而获得了诺贝尔奖辐射生物学研究方法双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图 辐射生物学研究方法功能基因的失活 定点诱变（Site-Directed Mutagenesis）siRNA 转基因及基因敲除小鼠（Transgenic and Knockout Mice）辐射生物学研究方法定点诱变 可在特定位点精确的引入突变，研究基因的功能 两种诱变方法盒
32、式诱变（Cassette mutagenesis）寡核苷酸引物诱变辐射生物学研究方法寡核苷酸引物诱变原理：不需要依赖限制性内切酶，直接通过载体，原理：不需要依赖限制性内切酶，直接通过载体，如如噬菌体噬菌体M13M13，把含有把含有待突变的目的待突变的目的DNADNA片断段片断段克隆到克隆到M13M13中中，再以，再以5 5端磷酸化的待突变碱基的端磷酸化的待突变碱基的寡核苷酸引物与含有目的基因的寡核苷酸引物与含有目的基因的M13M13单链单链DNADNA退退火形成一小段碱基错配的异源火形成一小段碱基错配的异源DNADNA，在，在DNADNA聚合聚合酶的催化下，引物链以酶的催化下，引物链以M13M
33、13单链单链DNADNA为模板合成为模板合成全长的互补链，然后由连接酶封闭缺口，产生闭全长的互补链，然后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的环的异源双链的M13 DNAM13 DNA分子。含异源分子。含异源DNADNA的的M13M13转化大肠杆菌后，会产生野生型和突变型的转化大肠杆菌后，会产生野生型和突变型的同源双链同源双链DNADNA分子，再利用斑点法，限制性酶切分子，再利用斑点法，限制性酶切法等进行突变基因的筛选。法等进行突变基因的筛选。84辐射生物学研究方法寡核苷酸引物诱变辐射生物学研究方法siRNA siRNA(SmallsiRNA(Small interfering RNA)int
34、erfering RNA)：是一种小RNA分子（21-25核苷酸），由Dicer（RNAase 家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素86siRNA作用的原理 外源dsRNA入侵，细胞能通过RNAi将其清除 dsRNA在Dicer酶作用下被裂解成siRNA并在RdRP作用下自扩增，再被裂解 s
35、iRNA双链变单链后与蛋白形成复合物，并与siRNA互补的mRNA结合，使其被RNase裂解辐射生物学研究方法1.长度约在22nt左右。2.依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。3.生成需要Argonaute家族蛋白存在。4.是RISC组分。5.siRNA合成是由双链的RNA或RNA前体形成的。6.siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。7.结构上，siRNA是双链RNA。8.在Dicer酶的加工过程中，siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。9.在作用位置上，siRNA可作用于mRNA的任何部位。10.在作用方式上，
36、siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。11.siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。siRNA特点辐射生物学研究方法原理(2025nt双链RNA)辐射生物学研究方法转基因及基因敲除小鼠 在器官和集体水平上研究基因的功能 将基因转入生殖细胞系，产生转基因小鼠 目前常用的转基因方法是微注射法，将外源基因注射入受精卵的核中辐射生物学研究方法转基因及基因敲除小鼠辐射生物学研究方法 此方法制备的转基因小鼠其基因的插入位点为随机插入，另外还受到基因本身及染色体基因组对外源基因的识别、修饰因素的干扰等，并不是所有具有外源基因的小鼠都能具有表现型，在传代
37、过程中也可能产生基因的丢失，因此，对于一个携带外源基因的小鼠还需通过其表型特征或基因的蛋白表达分析等进一步确认其是否具有相应的表现型；另外通过交配繁殖确认是否具有生殖系遗传等。一旦确认小鼠带有该外源基因并可传代，则可进一步传代及纯化，筛选并确立一个稳定的新品系辐射生物学研究方法 基因敲除小鼠则是利用同源重组的方式，将一对同源染色体上相同的等位基因都用失活的基因取代 首先要利用同源重组的方式“修饰”一个等位基因，得到嵌合体小鼠；通过两代或多代的选择育种，选择出等位基因完全被“修饰”而失活的纯合体小鼠。转基因及基因敲除小鼠辐射生物学研究方法基因的微阵列分析 DNADNA微阵列微阵列（DNA mic
38、roarray）又称DNADNA阵列阵列或DNADNA晶晶片片，比较常用的名字是基因晶片基因晶片（gene chip）。是一块带有DNADNA微阵列（micorarray）的特殊玻璃片或矽晶元片，在数平方公分之面积上分布了数千或数万个核酸探针；检验中的DNA、cDNA、RNA等与探针结合后，通过荧光或电流的改变来探测。一次实验，即可提供大量基因序列相关信息 目前使用的芯片有两种类型 DNA探针的目标物被固定在惰性的固体芯片上 寡核苷酸探针在芯片上原位合成 此外，还有cDNA和mRNA等芯片，已经商业化辐射生物学研究方法Westertn Blotting 蛋白免疫印迹（蛋白免疫印迹（Wester
39、tnWestertn Blotting Blotting）：）：与southern和northern方法类似，只是被检测物是蛋白质而非DNA或RNA。该方法中使用的“探针”是与待测蛋白特异结合的抗体，再通过带有第二抗体的底物来显色。是目前实验室中最长使用的分析蛋白表达的方法。辐射生物学研究方法 蛋白提取 蛋白变性 凝胶电泳 转膜 一抗标记 二抗标记 底物显色Westertn Blotting辐射生物学研究方法 底物的显色方式 HRP 辣根过氧化酶：最常见的酶促发光或显色的交联酶，比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用 放射标记二抗：目前已较少使用 通
40、过比较底物发光的有无来判断蛋白是否表达，但这种方法只能对蛋白水平做相对定量Westertn Blotting辐射生物学研究方法免疫沉淀 免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶联的agaose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。辐射生物学研究方法酶联免疫吸附法（ELISA）它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通它采用抗原与抗体的特异反应
41、将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原以是抗体也可以是抗原 其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。辐射生物学研究方法荧光蛋白 有些蛋白能自然发荧光，可以作为报告分子使用 两种最常用的荧光蛋白 GFP：绿色荧光蛋白 RFP：红色荧光蛋白 常将荧光蛋白的基因与待追踪的基因一起进行转导，表达后以追踪目标基因的表达情况及在细胞内或体内的分布辐射生物学研究方法什么是蛋白
42、质组？什么是蛋白质组？蛋白质组是指“由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质”。荧光染色的细胞内蛋白质蛋白质组学辐射生物学研究方法蛋白质组学 在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。认识。蛋白质组研究中的关键技术双向凝胶电泳辐射生物学研究方法双向电泳(2DE/DIGE)是等电聚焦电泳电
43、聚焦电泳和SDS-PAGESDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分析辐射生物学研究方法提取的总蛋白溶液等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离SDS-PAGE分离，使得蛋白质按分子量大小排序分子量大小通过双向电泳使得不同等电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离辐射生物学研究方法 硝酸银染色硝酸银染色 优点：灵敏度高，缺点：重复性差，质谱兼容性低 考马斯亮兰染色：考马斯亮兰染色：优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低 荧光染色：荧光染色：优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点：价格贵 其它染色方法：其它染色方法：胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等辐射生物学研究方法
