1、2022-12-6例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子例子1产朊假丝酵母发酵产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽法生产谷胱甘肽例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽有关谷胱甘肽的基本知识 生物活性三肽化合物 小分子硫醇类化合物 含有-肽键 主要有还原型（GSH）和氧化型（GSSG）两种形态例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的形态转换 图1-1 酵母细胞中谷胱甘肽的形态转化过程 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽在自然界中的分布情况动物：肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体植物：蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类微生物：酵母（主要为Saccharomyces属和Candida属）谷胱甘肽主要以
2、GSH形式存在，大多数生物细胞中GSH与GSSG的比例约为100:1。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的功能 维持生物体内适宜的氧化还原环境 广泛用于生物化学、医学、生物学和化学的研究测定 GSH可以迅速增强机体的免疫力 对消化系统、呼吸系统和新陈代谢等都有很大帮助 GSH具有消除疲劳的作用 近年来还发现GSH具有抑制艾滋病病毒的功效 加拿大麦基尔大学教授古特曼博士这样预测：“GSH很快就会象胆固醇一样深入民心，成为人们衡量健康的指标之一”。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽 GSH多用于治疗肝脏疾病 解毒 抗辐射 抗肿瘤、癌症 抗氧化衰老 协调内分泌 疗效明显且无副作用，这些同
3、类药物所不具有的优点使得GSH在临床医药领域有着极为广泛的用途。谷胱甘肽应用于临床例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表1-1 GSH的生理功能及其在临床上的应用 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽应用于食品行业 GSH具有独特的生理功能，被称为长寿因子和抗衰老因子 GSH在强化食品风味的同时对人体有保健作用 它在食品行业的应用前景显然要优于其它类型的防腐剂或抗氧化剂表1-2 GSH在食品加工业中的用途 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的应用前景医 药 工业食 品 工业体 育 运动生 物 研究GSH有一个巨大的市场研究兴趣日益增长需求量不断增加昂贵的市场价格GSH在各领域
4、中的广泛应用限制例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽的制备方法 有机溶剂萃取法 化学合成法 生物技术法 酶转化法 发酵法例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽酶法合成谷胱甘肽 谷胱甘肽合成酶系酶活的提高 ATP再生系统的构建 E.coli 细胞中的乙酸激酶反应 S.cerevisiae 细胞中的糖酵解途径 固定化酶（细胞）技术的应用 提高ATP的转移效率以及增加ATP在反应体系中的稳定性，以实现ATP再生系统的高效运行。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵法生产谷胱甘肽 高产菌株的选育 发酵过程的优化及控制 基因工程菌在谷胱甘肽生产中的应用 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽高产菌
5、株的选育 图1-3 高产GSH酵母菌株的选育方法与结果 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽 发酵条件优化 营养成分的选择 培养条件的优化 发酵过程控制 控制葡萄糖的浓度：流加发酵 控制细胞比生长速率：提高比GSH合成速率 前体物质的添加 添加策略：一次性添加、连续添加等发酵过程的优化及控制例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基因工程技术的应用 提高GSH合成酶系的酶活：增加质粒的拷贝数 降低酶系对GSH的敏感性：构建脱敏菌株 ！需要考虑质粒的稳定性 ！例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵法生产谷胱甘肽研究中仍存在的问题 对C.utilis发酵生产GSH的细胞生长规律和GSH合成特性还缺乏
6、了解 还没有发现从发酵动力学的角度，来分析并获得GSH发酵过程中出现的 规律性结果 在流加发酵中，高细胞密度和高GSH合成能力的矛盾还没有解决 未见运用代谢理论及其手段为GSH合成过程中发生的变化寻求合理的解释 如何将胞内GSH分泌至胞外也需要深入研究例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵法生产谷胱甘肽研究的意义 日本协和发酵和味之素公司在上世纪80年代就已实现GSH的 工业化生产，并基本垄断国际市场 我国在该方面的研究相对滞后 日本以明显的差价将GSH销往欧美和我国（欧美250美元/kg，我国450美元/kg）因此，大力研制开发并获得具有自主知识产权的GSH生产技术，对于我国功能食品和医药
7、工业的发展都具有重要的意义。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽发酵过程优化原理外因：内因：外因定量化：内因定量化：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽关键技术 1例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽关键技术 2例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽关键技术 3例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽关键技术 4例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本研究的主要内容 课题来源：江苏省高校高新技术产业发展项目“微生物发酵法生产谷胱甘肽”研究目标：酵母细胞和GSH的高产量、高得率和高生产强度研究内容：（6个部分）例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽碳源种类对谷胱甘肽发酵
8、的影响 表2-1 各种碳源对细胞生长及GSH合成的影响 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图2-2 糖类碳源对细胞生长及GSH合成的影响 Glucose;Sucrose;Fructose 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽氮源种类对谷胱甘肽发酵的影响 图2-3 各种氮源对细胞生长及GSH合成的影响 Beef extract;Peptone;Yeast extract;Urea;(NH4)2SO4;NH4Cl;NaNO3 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽混合氮源对谷胱甘肽发酵的影响 图2-4 混合氮源（硫酸铵+尿素）对细胞生长及GSH合成的影响 Mixed nitrogen source
9、 concentration:6 gL-1;8 gL-1;10 gL-1 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽KH2PO4和MgSO4对谷胱甘肽发酵的影响 图2-5 不同浓度磷酸二氢钾和硫酸镁对GSH生物合成的影响 GSH concentration;DCW;GSH content 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽发酵的营养条件正交优化试验 表2-2 L16(45)正交试验因素水平表 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表2-3 正交试验数据及BP神经网络处理结果 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图2-6 正交试验结果直观分析 GSH concentration;DCW;GSH
10、 content 以提高GSH产量为目的（即Y2最大化），通过直观分析图获得的较优化的营养条件组合为A2B3C2D4E2，即葡萄糖浓度30gL-1，(NH4)2SO4浓度4gL-1，尿素浓度4gL-1，KH2PO4浓度3gL-1，MgSO4浓度0.25gL-1。这与BP神经网络预测的结果是一致的。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽环境条件对谷胱甘肽发酵的影响 图2-7 环境条件对C.utilis WSH 02-08细胞生长及GSH合成的影响 GSH concentration;DCW;GSH content 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽 C.utilis WSH 02-08 生产谷胱
11、甘肽的摇瓶发酵过程 图2-8 C.utilis WSH 02-08摇瓶发酵生产GSH过程曲线 Residual glucose;pH;GSH concentration;DCW;GSH content 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽摇瓶分批补糖方式对谷胱甘肽发酵的影响 表2-4 摇瓶中不同补糖方式对GSH发酵的影响 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：1、确定了C.utilis WSH 02-08发酵生产GSH培养基的营养成分 及其浓度组合；2、以实现细胞的高产和GSH的高合成为目标，获得了较优的 环境条件组合；3、摇瓶发酵结果表明，DCW最大值达9.0 gL-1，GSH最大浓
12、度 208.3 mgL-1，胞内GSH含量2.35%；4、总糖浓度固定的情况下，适当的补糖策略对GSH的合成有 一定的促进作用。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽溶氧对谷胱甘肽分批发酵的影响 图3-1 不同搅拌转速下发酵过程的溶氧变化趋势1350 rmin-1;2300 rmin-1;3250 rmin-1;4200 rmin-1 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-2 不同搅拌转速下的GSH分批发酵过程 200 rmin-1;250 rmin-1;300 rmin-1;350 rmin-1 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽不控制pH的谷胱甘肽发
13、酵过程 图3-3 不同pH控制方式下 GSH发酵过程曲线 glucose;DCW;extracellular GSH;intracellular GSH;pH;total GSH;intracellular GSH content;Panel A-C,no pH control;Panel D-F,pH 5.5 发现低pH培养环境下，产朊假丝酵母胞内合成的GSH大量向胞外渗漏例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽控制恒定pH时的谷胱甘肽发酵过程 图3-4 不同恒定pH条件下GSH发酵各过程参数比较 DCW;PGSH;qP;GSH content;GSH concentration;YX/S;YP
14、/S 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽基于动力学模型解析pH对谷胱甘肽发酵的影响 表3-2 不同pH下GSH分批发酵动力学参数模拟结果 KI表示底物浓度对细胞生长的抑制程度，且KI值越高则抑制效应越低。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-5 不同pH条件下GSH合成能力及细胞生长比较 pH为5.5时GSH总量达到最大，从动力学角度分析，是因为在这一pH下兼具了KI值高（底物对细胞生长的抑制效应小）、值低和值高（细胞生长过程中和生长结束后均可保持较高的比GSH合成速率）的特点。为直线斜率，表示在相同的条件下，细胞合成GSH能力的强弱；为截距，反映生长停止后（=0）细胞继续合成GSH能力
15、的高低。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽不同温度下的谷胱甘肽发酵过程分析图3-6 不同温度条件下GSH发酵过程及动力学参数随时间变化情况 and curve 1,32C;and curve 2,30C;and curve 3,28C;and curve 4,26C;and curve 5,24C 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表3-3 不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽细胞生长动力学模型及其参数估计 表3-4 不同温度下细胞生长动力学参数模拟结果 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽谷胱甘肽合成动力学模型及其参数估计 表3-5 不同温度下G
16、SH合成动力学参数模拟结果 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-7 温度对C.utilis WSH 02-08细胞生长动力学参数的影响及其模拟 不同温度和葡萄糖浓度下的细胞浓度随时间变化情况：例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-8 C.utilis WSH 02-08细胞生长动力学模型的验证A:Temperature 29C,initial glucose concentration 28.3 gL-1B:Temperature 30C,initial glucose concentration 33.2 gL-1 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽分阶段温度控制策略的提出与实现
17、 表3-8 不同温度下分批发酵8 h前后的平均比生长速率 和平均比GSH合成速率比较结果 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图3-9 分阶段温度控制策略下的GSH发酵过程曲线 Glucose;GSH;DCW 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表3-3 不同温度条件下GSH分批发酵过程参数比较 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽 本章小结：1、在满足细胞生长的范围内，溶氧对胞内GSH含量影响不大。在葡萄糖浓度为30 gL-1且通气量1.2 vvm的情况下，将搅拌转速恒定在300 rmin-1即可满足细胞生长和GSH合成对溶解氧的需求；2、不控制pH时，发酵液pH迅速下降，至pH 1.5时胞
18、内合成的GSH开始向胞外 渗漏，最终DCW和GSH产量比pH 5.5时的发酵结果分别低27%和95%，且GSH的胞外渗漏量约占GSH合成总量的50%；3、在pH 4.06.5范围内，pH 5.5时最有利于GSH的合成。从分批发酵动力学角度进行分析，解释了pH对细胞生长和GSH合成的影响这一生理学现象；例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽4、在24C32C范围内，较高温度对C.utilis WSH 02-08细胞生长有促进作用，而较低温度更有利于GSH的合成；5、根据细胞生长动力学参数，得到24C32C范围内GSH分批发酵过程中细胞浓度同温度以及底物浓度之间的一般关系式：验证实验结果表明，该模型
19、在24C32C范围内可用于预测不同温度下的细胞生长情况；6、提出分阶段温度控制策略：发酵起始温度30C，8 h后切换至26C并保持到发酵结束。结果表明，分阶段温度控制策略的实施可以进一步提高GSH的合成能力，其中GSH产量分别比在26C和30C时提高了5%和23%，而胞内GSH含量更是高达2.61%。因此，该策略具有很好的实用性。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽初糖浓度对谷胱甘肽分批发酵的影响 图4-1 不同初糖浓度下的GSH发酵过程 17.2 gL-1;25.2 gL-1;33.2 gL-1;41.8 gL-1;49.9 gL-1 例子1产朊假丝酵母发
20、酵法生产谷胱甘肽表4-1 不同初糖浓度下的GSH发酵过程参数比较 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽分批补料培养生产谷胱甘肽的发酵过程 图4-2 分批补料培养方式下的GSH发酵过程 Glucose;DCW;GSH;GSH content 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽恒速流加发酵对谷胱甘肽生产的影响 图4-3 葡萄糖恒速流加下 的GSH发酵过程 Glucose;DCW;GSH;GSH content;A-B,4.2 gL-1h-1;C-D,5.0 gL-1h-1;E-F,6.4 gL-1h-1 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽指数流加发酵对谷胱甘肽生产的影响 图4-4 葡萄糖指数流
21、加培养下的GSH发酵过程 Glucose;DCW;GSH;GSH content例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽不同培养方式下谷胱甘肽生产情况比较 表4-2 不同培养方式下细胞生长和GSH合成过程参数比较 a Fed-batch(1),(2),(3)were representative for glucose feeding at constant rate of 4.2 gL-1h-1,5.0 gL-1h-1 and 6.4 gL-1h-1,respectively,while Fed-batch(4)was representative for the cultivation mod
22、e of glucose feeding at a exponential rate.b qP refers to specific GSH production rate.例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：1、不同葡萄糖浓度下的实验结果表明，仅通过分批培养难以实现细胞和GSH 高产量、高得率和高生产强度的有机统一；2、分批补料、恒速流加和指数流加等几种培养方式都可以实现酵母细胞和 GSH的高产量，其中指数流加还可以同时提高细胞和GSH的生产强度。经 过48 h的指数流加培养，DCW达到40.9 gL-1，GSH产量和胞内GSH含量均 达到最大值857.2 mgL-1和2.25%。
23、例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽L-谷氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响 图5-1 L-谷氨酸的添加对GSH发酵的影响 0 h;6 h;12 h;16 h 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽甘氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响 图5-2 甘氨酸的添加对GSH发酵的影响 0 h;6 h;12 h;16 h 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽L-半胱氨酸添加对谷胱甘肽发酵的影响 图5-3 L-半胱氨酸对GSH摇瓶发酵的影响 0 h;4 h;8 h;12 h;16 h 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽分批发酵中L-半胱氨酸对谷胱甘肽过量合成的作用 图5-4 L-半
24、胱氨酸对分批发酵过量合成GSH的影响 Glucose;DCW;GSH;Residual thiols;Total thiol;GSH content;A-B,添加8mmo/L的LCys;C-D,添加16mmo/L的LCys 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽流加发酵中添加L-半胱氨酸促进谷胱甘肽的合成 图5-5 L-半胱氨酸对流加发酵培养生产GSH的影响 Glucose;DCW;GSH;Residual thiols;Total thiol;GSH content 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽L-半胱氨酸对不同培养方式下GSH生产影响的比较 表5-1 L-半胱氨酸添加对不同培养方式下
25、GSH合成的影响 a Average qP here refers to the average specific GSH production rate after L-cysteine addition.b Average qP here was representative for the average specific GSH production rate of the whole process.例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：1、L-谷氨酸和甘氨酸在细胞不同生长阶段的添加对GSH发酵过程并无太 大的影响，L-半胱氨酸虽然对细胞生长有抑制作用，但可以大幅度提 高GS
26、H产量和胞内GSH含量；2、对于分批发酵来说，在L-半胱氨酸添加前后，GSH的合成量约各占总 量的50%，对于流加发酵，最终GSH产量可以高达1150 mgL-1；3、总体上来看，L-半胱氨酸对GSH发酵的影响主要表现在GSH产量和胞 内GSH含量提高的幅度上，以及添加前后GSH平均比合成速率变化的 差异上。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽 代谢工程的概念起源于上世纪90年代初，实质是对细胞代谢通量及其控制进 行定量分析，并对代谢进行合理改造，以最大限度提高目的代谢产物的产率 涉及生理学、分子生物学、生物化学及生物途径工程学等多门学科 常用的定量方法有代
27、谢控制分析、代谢通量分析、生化系统理论、途径分析、控制论模型等 代谢通量分析模型（MFA）是代谢工程基础研究中最主要的计算代谢途径中 各物质通量的手段 MFA假定细胞内的物质、能量处于拟稳态，在测定胞外代谢物浓度和菌体组 成的基础上，根据物料平衡和已知的代谢途径计算细胞内的代谢通量 代谢工程的基本知识例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图6-1 C.utilis WSH 02-08分批培养合成GSH的代谢网络结构模型 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽代谢通量的计算 代谢通量分析（MFA）最主要的基础是拟稳态假设 采用化学计量方程对各代谢物的质量平衡进行计算 Ar=X 计算原则 1、矩阵A中
28、元素的确定遵循“反应为负，生成为正”和“1 C-mol基准”原则；2、代谢物通量都是以消耗葡萄糖的比速率为基准的相对碳摩尔通量，葡萄糖 的摄入（r1）以100计。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图6-2 GSH分批发酵第一阶段的代谢通量分布（06 h）例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽图6-2 GSH分批发酵第二阶段的代谢通量分布（614 h）例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽5.6图6-2 GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布（1430 h）例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽5.3图6-3 分阶段温度控制策略下GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘
29、肽5.0图6-4 L-半胱氨酸添加后GSH分批发酵第三阶段的代谢通量分布 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：1、分析了C.utilis WSH 02-08细胞生物合成GSH的代谢网络，发现在分批发酵 前期，HMP途径代谢活跃，为细胞的生物合成提供足够的NADPH；在发 酵中后期，EMP途径和TCA循环代谢加强，产生更多的NADH和FADH2进 入呼吸链被氧化而产生ATP以供给细胞代谢维持的需要；2、温度的切换（30C26C）使更多的NADPH参与到CYS的合成成为可能，而经过SER进入CYS碳通量的增加，直接的结果是流向GC和GSH碳通量的 增加，因而提高了GSH的产量；3、L-半
30、胱氨酸的添加使HMP途径近似于关闭，碳通量直接进入EMP途径和 TCA循环，同时外加的L-半胱氨酸使经过CYS的碳通量大增，最终GSH产 量提高将近1倍。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽表面活性剂对细胞生长的影响 图7-1 不同类型表面活性剂对细胞生长的影响 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽低浓度离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响 图7-2 低浓度离子型表面活性剂对GSH合成的影响 Intracellular GSH;Extracellular GSH；Total GSH；GSH content 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽高浓度离子型表面
31、活性剂对GSH胞外积累的影响 图7-3 高浓度离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响 Extracellular GSH;Intracellular GSH;DCW;GSH content;Total GSH;TGSH/DCW 8 h;16 h;24 h 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽非离子型表面活性剂对谷胱甘肽合成的影响 图7-4 非离子型表面活性剂对GSH胞外积累的影响,Intracellular GSH;,Extracellular GSH;,Total GSH;,TGSH/DCW;0 h;16 h 例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽本章小结：1、离子型表面活性剂SDS和CTAB
32、对酵母细胞生长存在临界浓度现象，醚类 非离子表面活性剂Brij30只有在高浓度时才对细胞生长产生部分抑制，而 酯类非离子表面活性剂Tween80对细胞生长几乎没有负面影响；2、低于临界浓度的离子型表面活性剂影响了酵母细胞的GSH合成能力，但不 能促进GSH向胞外积累；高于临界浓度时，对于培养后期的酵母细胞内 GSH的胞外分泌具有积极的作用；3、Brij30在一定浓度下对细胞生长和GSH合成表现出与离子型表面活性剂相 似的特点，但对GSH的胞外积累贡献不大；Tween80对GSH发酵过程以及 酵母细胞合成GSH的能力几乎没有影响。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽结 论(1)以C.utilis
33、 WSH 02-08作为微生物发酵法生产GSH的出发菌株。在单因素实验 的基础上，采用L16(45)正交表安排发酵培养基中各营养组分及其浓度的正交优 化试验，结合BP神经网络的预测，得到以提高GSH产量为目标的营养条件组 合为：葡萄糖 30 gL-1，(NH4)2SO4 4 gL-1，尿素 4 gL-1，KH2PO4 3 gL-1，MgSO4 0.25 gL-1。进一步获得了GSH摇瓶发酵较优的环境条件组合为：初始 pH 6.0、装液量50 mL/500 mL、接种量10%。(2)在C.utilis WSH 02-08发酵生产GSH的摇瓶培养过程中，26 h时DCW达最大值 9.0 gL-1，
34、28 h时GSH积累至最大浓度208.3 mgL-1，胞内GSH含量2.35%。在 总糖浓度固定的情况下，合适的摇瓶补糖方式对GSH合成具有促进作用，最 多可以提高GSH产量约10%，胞内GSH含量也高达2.52%。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽(3)在7 L搅拌式发酵罐中进行C.utilis WSH 02-08分批培养生产GSH，搅拌转速 对胞内GSH含量影响较小。因此，当葡萄糖浓度为30 gL-1且通气量控制在 1.2 vvm时，搅拌转速只要不低于300 rmin-1即可满足细胞生长和GSH合成对 溶解氧的需求。(4)不同pH控制方式对GSH分批发酵的影响有较大差异。不控制pH时，不
35、仅会 引起发酵后期GSH向胞外渗漏，而且最终DCW和GSH产量均比恒定pH条件 下的结果低。通过对pH4.06.5范围内的各GSH分批发酵过程参数进行比较，发现在pH 5.5最有利于GSH的合成，并从发酵动力学的角度解释了pH对细胞 生长和GSH合成的影响这一生理学现象。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽(5)根据温度同细胞生长动力学参数之间的内在联系，得到GSH分批发酵过程 中细胞浓度的变化同温度以及底物浓度之间的一般关系式：验证实验结果表明，该模型在24C32C范围内具有很好的适用性。(6)提出了分阶段温度控制策略：发酵起始温度30C，8 h后切换至26C并保持 到发酵结束。该温度控制策
36、略的实施可以进一步提高GSH的合成能力，其 中GSH产量分别比在26C和30C时提高了5%和23%，而胞内GSH含量更是 高达2.61%。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽(7)不同葡萄糖浓度下的实验结果表明仅通过分批培养难以实现细胞和GSH高产 量、高得率和高生产强度的有机统一。分批补料、恒速流加和指数流加发酵 和分批培养相比均可提高菌体细胞和GSH的产量和生产强度，其中指数流加 方式下C.utilis WSH 02-08的细胞干重40.9 gL-1，GSH产量857.2 mgL-1，胞内 GSH含量2.25%，比较适合于GSH的高效生产。(8)L-半胱氨酸对GSH发酵过程有很大影响，是G
37、SH合成的关键氨基酸。当L-半 胱氨酸添加浓度为8 mmolL-1时，摇瓶下GSH产量和胞内GSH含量分别比对照 提高了91%和106%；分批培养下GSH产量明显提高，胞内GSH含量高出将近 一倍；而对于流加发酵，最终GSH产量可以高达1150 mgL-1，L-半胱氨酸添 加后的平均比GSH合成速率更是高出110%。例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽(9)根据C.utilis WSH 02-08利用葡萄糖作为唯一碳源时生物合成GSH的代谢网络，利用代谢通量分析方法分析了典型的GSH分批发酵不同阶段下各代谢物通量的 变化规律，对分阶段温度控制策略下和L-半胱氨酸添加时的代谢网络中通量的 改变进行比较，并对这些培养方式下GSH的过量合成进行了解释。(10)离子型表面活性剂SDS和CTAB对酵母细胞生长存在临界浓度现象，醚类非离 子表面活性剂Brij30对细胞生长只有部分抑制，而酯类非离子表面活性剂 Tween80对细胞生长几乎没有负面影响。SDS和CTAB对细胞的GSH合成能力会 产生影响，且高浓度的SDS和CTAB在发酵后期加入可以使胞内合成的GSH积 累至胞外；Brij30只能部分促进GSH的胞外积累，而Tween80的存在对GSH的胞 外积累没有任何作用。2022-12-6例子1产朊假丝酵母发酵法生产谷胱甘肽
