1、细胞培养中应注意的几个问题细胞培养中应注意的几个问题 1 1）培养液和培养物的比例：）培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。体积的细胞浓度。2 2）PHPH：初培养初培养pHpH应为应为7.47.4，培养过程应不低于，培养过程应不低于7.07.0。3 3）培养瓶内的空间：）培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为面上的空间体积之比为1:101:10。4 4）容积、深度、表面面积：）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面培养液体积与
2、表面面积的比例为积的比例为0.2-0.5ml/cm0.2-0.5ml/cm2 2。需高浓度氧的，在浅的培。需高浓度氧的，在浅的培养液（养液（2mm2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培养液（养液（5mm5mm）中生长较好。）中生长较好。5 5）去除死细胞）去除死细胞6 6）温度控制：）温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于大。温度低于36.536.5，细胞生长缓慢；温度高于，细胞生长缓慢；温度高于37.537.5，细胞存活力降低。细胞存活力降低。细胞培养中应注意的几个问题细胞培养中应注意的几个问题 细胞
3、传代方法细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3 3种。种。1 1悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法传代：离心（10001000转转/分分）去上清，沉淀物加新）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除除l l2 2一一2 23 3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 2 半悬浮生长细胞传代（半悬浮生长细胞传代（HelaHela细胞）细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁
4、不牢，可用直此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3 3贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。细胞计数：1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml4大格细胞总数/410000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应
5、按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。2台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；方法：1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。MTT比色法操作步骤：（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总
6、量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时；（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。慢冻程序慢冻程序标准程序：当温度在-25以上时，12/min 当温度达-25以下时，510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分
7、钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。细胞冻存方法细胞冻存方法 1预先配制冻存液：含预先配制冻存液：含20%血清培养基，血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；2取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞细胞/ml)；3 3加入加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。冷冻日期。细胞复苏方
8、法细胞复苏方法 （1 1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37373838水浴中，水浴中，使其融化（使其融化（1 1分钟左右）；分钟左右）；（2 2）5 5分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的1010倍以上；倍以上；（3 3）低速离心）低速离心1010分钟；分钟；（4 4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。实验准备实验用品：实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸酸缸CO2培养箱培养箱倒置显微镜倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器酶标仪、微孔板震
9、荡器液氮液氮罐罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，培养板，耗材：培养瓶，吸管，培养板，冻存管冻存管压力蒸汽消毒器：压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 滤器：滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒 完全培养基的组成完全培养基的组成基础培养基基础培养基 8080一一9595血清血清 5 5一一2020碳酸氢钠碳酸氢钠 2.
10、0 g/L2.0 g/L青、链霉素青、链霉素 各各100100单位毫升单位毫升一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性毒性主要作用主要作用:防止培养基防止培养基pHpH迅速变动。在开放式培养条件下，迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了观察细胞时培养基脱离了5%CO25%CO2的环境，的环境，CO2CO2气体迅速逸气体迅速逸出，出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此时可以维持，此时可以维持pH7.0pH7.0左左右。一般在进行克隆化培养时要添加右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPESHEPESmmol/Lmmol/L使用时可向使用时可向100ml100ml培养液中加入培养液中加入2ml 2ml 浓缩液，终浓度为浓缩液，终浓度为20mmol/L 20mmol/L
