1、lBin Lul Attardi Institute of Mitochondrial Biomedicine 不同组织细胞和器官的结构和功能、生不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在体外培养中所需的分离方长特性不同，在体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。法和生长条件也不同。许多器官上的上皮细胞具有特定的功能，如肾和肠道上皮细许多器官上的上皮细胞具有特定的功能，如肾和肠道上皮细胞具有吸收功能，肝和胰上皮细胞的分泌功能，肺上皮细胞胞具有吸收功能，肝和胰上皮细胞的分泌功能，肺上皮细胞的气体交换功能；的气体交换功能；上皮组织还常发生肿瘤。上皮组织还常发生肿瘤。1.上皮组织的形态结构上
2、皮组织的形态结构 群体依赖性（群体依赖性（population dependence)接触抑制（接触抑制（contact inhibition)2.上皮细胞的极性上皮细胞的极性 贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞-贴壁生长贴壁生长 生长基质生长基质 3.上皮细胞间的连接上皮细胞间的连接1.形态学结构：形态学结构：均质性、透明性很强，结构不明显均质性、透明性很强，结构不明显(1)体外培养的特殊条件：体外培养的特殊条件：l 防范微生物污染防范微生物污染l 生长基质的支持生长基质的支持l 特殊的培养基特殊的培养基 M199 RPMI1640 DMEM Fam F12 无血清培养基无血清培养基l 去成纤维细
3、胞去成纤维细胞根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。培养中所使用的各种液体，包括细胞培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液保存液、分离液以及以及培养基
4、培养基等需添加等需添加抗生素抗生素，抗生素抗生素浓度比其它组织培养高。浓度比其它组织培养高。防范微生物污染防范微生物污染皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。贴壁依赖性细胞。在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化使细胞细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化使细胞极性表现更为明显。极性表现更为明显。生长基质的支持生长基质的支持M199
5、和和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。DMEM和和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。HamFl2培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。成分中添加微量元素的无机离子
6、，更加利于细胞的生长和代谢。在实际培养时，将在实际培养时，将DMEM与与HamFl2按一定比例混合用于上皮组按一定比例混合用于上皮组织培养。织培养。特殊的培养基特殊的培养基去除成纤维细胞去除成纤维细胞上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易力强的特点，很容易“疯长疯长”为培养物中的优势细胞群，为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上
7、皮细胞的生长，成为上皮细胞的从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源细胞污染源”。因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。胞的生长。1.一般形态学观察一般形态学观察 光镜：光镜：形态、轮廓、生长情况等。形态、轮廓、生长情况等。细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清 电镜：电镜：桥粒、形态结构特征、细胞间关系桥粒、形态结构特征、细胞间关系培养液培养液pH变化：变化：颜色变化？颜色变化？培养物
8、的污染情况：培养物的污染情况：透明度变化？透明度变化？2.组织化学与免疫组织化学观察与检测组织化学与免疫组织化学观察与检测酶类：酶类：碱性磷酸酶碱性磷酸酶 琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶特异性抗原标记物：特异性抗原标记物：角蛋白、上皮细胞膜抗原角蛋白、上皮细胞膜抗原 VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白组织来源：组织来源：婴儿脐带婴儿脐带培养用液：培养用液：M199+20%FCS D-Hanks 0.1%胶原酶溶液胶原酶溶液1.主要材料：主要材料：2.培养方法：培养方法：分离细胞培养法1)将将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。
9、溶液中储存。（注：（注：4下最多贮存下最多贮存24小时，室温下不超过小时，室温下不超过6小时，否则废小时，否则废弃）弃）2)用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。次，将污血冲洗干净为止。3)用手术钳夹紧脐带下端，加入用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（的胶原酶（1mg/ml）室温下消化室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。分钟，并不时上下摇动脐带。4)消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无无菌离心管中，用无菌的菌离心管中，
10、用无菌的PBS溶液冲洗脐带溶液冲洗脐带2-3次。次。5)将收集液离心（将收集液离心（2000转转/分）分）3分钟，去上清，加入分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。(1)关于接种材料的制备关于接种材料的制备 取材与消化取材与消化 消化酶、浓度、时间消化酶、浓度、时间 (2)排除成纤维细胞排除成纤维细胞 传代去除法传代去除法 加肝素培养法加肝素培养法(90u/ml)刮除法刮除法 (3)关于培养液关于培养液 (4)关于传代培养关于传代培养
11、5.讨论：(1)光镜检查光镜检查 (2)透射电镜检查：透射电镜检查：W-P小体小体 (3)VIII因子相关抗原的免疫组化检测因子相关抗原的免疫组化检测6.内皮细胞的鉴定：内皮细胞的鉴定：巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活23周，多用做原周，多用做原代培养，难以长期生存。代培养，难以长期生存。巨噬细胞也建有
12、无限细胞系，大多巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l，培养中呈巨噬，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用。腹腔取材法最为实用。动物：动物：小鼠、大鼠、兔、人小鼠、大鼠、兔、人培养基：培养基：Eagle MEM RPMI1640 HamF12常用的巨噬细胞：常用的巨噬细胞：肺泡和腹腔巨噬细胞肺泡和腹腔巨噬细胞（一）肺泡巨噬细胞（一）肺
13、泡巨噬细胞 支气管肺泡灌洗法支气管肺泡灌洗法 支气管镜肺泡灌洗法支气管镜肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬细胞（二）腹腔巨噬细胞 1.小鼠腹腔巨噬细胞的获取：小鼠腹腔巨噬细胞的获取：(1)主要材料：主要材料：实验动物实验动物:6周龄小鼠周龄小鼠 培养液：培养液：10%FCS RPMI1640 1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。2、引颈处死小鼠。、引颈处死小鼠。3、手提鼠尾将其全浸入、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中乙醇中35秒。秒。4、置动物于解剖、置动
14、物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。5、用、用70%酒精擦洗腹膜壁，酒精擦洗腹膜壁，注射器吸注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。壁，使液体在腹腔内流动。6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。侧使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。7、小心拔出针、小心拔出针头，把液体注入离心管。头，把液体注入离心管。
15、8、4下下250g离心离心10分钟后，去上清，分钟后，去上清，加加10ml DMEM培养基。培养基。9、计数细胞。每只鼠可产生、计数细胞。每只鼠可产生20一一30106细胞，其中细胞，其中90%为巨噬细胞。为巨噬细胞。10、以、以3105个贴附细胞个贴附细胞/平方厘米接种。平方厘米接种。11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用白细胞，纯化培养细胞，用DMEM液冲洗液冲洗1一一2次，再加新次，再加新DMEM培养液置培养液置CO2温箱中。温箱中。1 1、原理：、原理：巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点2.2.
16、方法：方法：用贴壁法纯化巨噬细胞用贴壁法纯化巨噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞1用含用含2040小牛血清的小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配培养液将巨噬细胞配成成21064106/ml的浓度。以每平方厘米的浓度。以每平方厘米21054105个个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。养皿（瓶）中。37 5 CO2培养箱中培养培养箱中培养1小时或小时或24小时。小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，
17、而24小小时可以得到较多的巨噬细胞。时可以得到较多的巨噬细胞。2040的小牛血清可以减少的小牛血清可以减少B淋巴细胞的粘附。淋巴细胞的粘附。2摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温的温的Hanks液洗涤细胞液洗涤细胞34次。悬浮细胞可重复粘附，得到更次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。用适量含多巨噬细胞。用适量含2.5mM EDTA的无钙镁的无钙镁Hanks液消化细液消化细胞胞37 1530分钟。用吸管吹打分离细胞，离心分钟。用吸管吹打分离细胞，离心250g 10分钟，分钟，去上清液。去上清液。3用预冷用预冷Hanks液
18、洗涤细胞液洗涤细胞34次，每次离心次，每次离心250g 10 min，去上清。最后用含去上清。最后用含10FBS的的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并测细胞活力，将细胞配成所需浓度。盼蓝染色计数细胞并测细胞活力，将细胞配成所需浓度。用贴壁法纯化巨噬细胞用贴壁法纯化巨噬细胞 1取取15ml离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序依次分层加在离心管中，每个浓度淡的顺序依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。最后加上上。最后加上上述巨噬细胞悬液述巨噬细胞悬液35ml（约含（约含21075107细胞）。细胞）。
19、24中，水平离心中，水平离心1000g 30分钟，垂直取出离心管，小心分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交界面的细胞。分别用预冷的含吸出各交界面的细胞。分别用预冷的含1小牛血清小牛血清RPMI-1640培养液洗涤各交界面细胞培养液洗涤各交界面细胞2次，每次次，每次200g 10分钟。用含分钟。用含10小牛血清的小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成所需的浓度。培养液将细胞配成所需的浓度。用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞 （一）主要材料：（一）主要材料：培养液：培养液：RPMI1640 等等+1040%FCS+抗生素抗生素（二）实验步骤：（二）实验步骤：a.冷
20、分离冷分离 b.调整细胞浓度：调整细胞浓度：24106/ml c.接种培养接种培养（三）培养结果：（三）培养结果：大大 小：小：2050 m形形 态：态：菱形、星形、圆形菱形、星形、圆形功功 能：能：吞噬功能吞噬功能增殖情况：增殖情况：不增殖、存活不增殖、存活13周周（四）巨噬细胞的鉴定（四）巨噬细胞的鉴定1.吞噬实验：吞噬实验：加入加入0.001M(final con.)SiO2 吞噬泡吞噬泡2.抗胰蛋白酶消化能力试验：抗胰蛋白酶消化能力试验：0.25%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化20min、再用吸管反复吹打、再用吸管反复吹打 细胞变园但不脱落细胞变园但不脱落3.细胞化学试验：细胞化学试验：AC
21、P酶染色：棕黑色酶染色：棕黑色 NSE酶染色：紫蓝色酶染色：紫蓝色表面标志：表面标志：1.表面受体：TCR SRBC R Fc R MR Measles viruse RT淋巴细胞：淋巴细胞：MHC CD2.表面抗原1.表面受体表面受体 BCR FcR CR 丝裂原受体丝裂原受体 EBV R2.表面抗原表面抗原 MHC抗原抗原 CD抗原（抗原（CD19、20、21、23、45）密度梯度离心法密度梯度离心法外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作）作密度梯度离心密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度，使一定比重的细
22、胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。外周血外周血红细胞红细胞粒细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞血小板血小板淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞1.0931.0301.0351.0751.090Ficoll：1.0770.001(PBMC)1.092PBMC:Peripheral blood mononuclear cell1.1.每毫升外周血液大约可获每毫升外周血液大约可获1 110106 6单个核细胞单个核细胞 2.Ficoll2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释应适量，外周血应充分稀释 2.2.温度直接影响到温度直接影响到FicollFico
23、ll的比重和分离效果的比重和分离效果 3.3.在在FicollFicoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 4.4.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染液而导致血小板污染1500rpm,20,30minPBMC红细胞红细胞粒细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释的血浆、稀释的血浆、血小板血小板1.玻璃黏附法玻璃黏附法2.羰基铁粉法羰基铁粉法1.T细胞花环沉降法细胞花环沉降法2.尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法（五）（五）FACS仪分离仪分离（六）免疫磁珠法（六
24、）免疫磁珠法1.用用IL-2建立建立T淋巴细胞克隆淋巴细胞克隆2.用用EB病毒转化病毒转化B淋巴细胞淋巴细胞3.用用B细胞生长因子建立细胞生长因子建立B淋巴细胞株淋巴细胞株 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：瘤细胞具以下突出特点：肿瘤细胞在体外的生长生
25、物学特性肿瘤细胞在体外的生长生物学特性 形态和性状形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。生长增殖生长增殖 肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养
26、中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（25）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容
27、易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。肿瘤细胞永生性肿瘤细胞永生性（四）浸润性（四）浸润性 浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细
28、胞中，种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。并有穿透人工隔膜生长的能力。（五）异质性（五）异质性 所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（呈
29、活跃增殖状态的细胞称干细胞（Stem Cells）、只有这些干细）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。（六）细胞遗传（六）细胞遗传 大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。（七）其它（七
30、）其它肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性；影响癌细胞增殖生长的活性；肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，
31、达不到肿瘤生长肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。肿瘤细胞的培养方法肿瘤细胞的培养方法 肿瘤细胞培养成功关键在于：肿瘤细胞培养成功关键在于：取材取材、成纤维细胞的成纤维细胞的排除排除、选用、选用适宜的培养液适宜的培
32、养液和和培养底物培养底物等几个方面。在具等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。RPMI1640+1020%FCS+0.03%谷氨酰胺：谷氨酰胺：上皮性癌细胞或悬浮性肿瘤细胞上皮性癌细胞或悬浮性肿瘤细胞DMEM、199、MEM：肉瘤细胞的培养肉瘤细胞的培养F12、L-15:上皮性癌细胞的培养（如肝癌细胞）上皮性癌细胞的培养（如肝癌细胞）加加:2 g/L NaHCO3 20 mmol/L HEPES肿瘤细胞的培养方法：肿瘤细胞的培
33、养方法：肿瘤细胞体外培养常用肿瘤细胞体外培养常用的培养基的培养基（一）培养液的种类和选择（一）培养液的种类和选择（二）培养液特殊添加剂二）培养液特殊添加剂 常用的促细胞生长因子及使用的终浓度常用的促细胞生长因子及使用的终浓度 添加剂添加剂 终浓度终浓度 BSA 10-5 mol/ml TRF 510 ug/ml Insulin 5 ug/ml 氢化可的松氢化可的松 10-6mol/ml EGF 5 ng/ml FGF 5 ng/ml NGF 5 ng/ml肿瘤组织细胞的原代培养肿瘤组织细胞的原代培养取材：取材：人肿瘤细胞来自外科手术、活检瘤组织、胸腹水穿刺、细人肿瘤细胞来自外科手术、活检瘤组织
34、、胸腹水穿刺、细针头穿刺、内窥镜活检等。针头穿刺、内窥镜活检等。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴区，取材时尽量避免，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。结或胸腹水是好的培养材料。关键：新鲜、无菌、及时、准确关键：新鲜、无菌、及时、准确技术技术-分离纯化分离纯化分离：分离：剪碎、酶消化、剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等等 密度沉降分离密度沉降分离纯化：纯化：反复贴壁去除成纤维细胞反复贴壁去除成纤维细胞 自然淘汰去除正常细胞自然淘汰去除正常细
35、胞 利用特异抗原标志筛选法利用特异抗原标志筛选法(panning)分亚型分亚型 流式细胞仪分选流式细胞仪分选 克隆建株克隆建株 高转移株的建立：反复接种高转移株的建立：反复接种l原代培养：原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞，去除纤维细胞及淋巴细胞，防止细菌、真菌污染。防止细菌、真菌污染。l传代培养：传代培养：增殖力低的细胞需要饲养增殖力低的细胞需要饲养 细胞适当密度细胞适当密度,基本长满后基本长满后 传代传代,前前10代不稳定，注意代不稳定，注意 培养条件，适当调整培养基。培养条件，适当调整培养基。l鉴定：鉴定：组织来源组织来源、形态特征、核型染色体分析、生、形态特征、核型染色体分析、生长特性、
36、对细胞因子的反应（长特性、对细胞因子的反应（TNF)、集落形成、致、集落形成、致瘤实验（裸小鼠）瘤实验（裸小鼠）l建株：建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电镜观察、生长半年以上，病理诊断、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况况l注意：注意：不是每一肿瘤组织都能建株不是每一肿瘤组织都能建株肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640RPMIl640、DMEM DMEM、Mc-Coy5AMc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细等培养基等皆可用于肿瘤细胞培
37、养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（自泌（AutocrineAutocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤
38、细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子如胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。长因子培养更易成功。成纤维细胞的排除：成纤维细胞的排除：成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤
39、细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。去除成纤维细胞的方法去除成纤维细胞的方法是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不 锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为：（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；（3）用 Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。1 1、机械刮除法
40、：、机械刮除法：2、反复贴壁法：、反复贴壁法：根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗 2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；（2）取编号为此 A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入 A培养瓶中。置温箱中静止培养 520分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入 B培养瓶中后；向 A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；（3）培养B瓶中细胞 520分钟后，接处理 A的方法，把培养液注
41、入 C培养瓶中；再向 B瓶中补加完全培养基。当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见功，次日观察可见 A瓶主要为成纤维细胞，瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止化为止。3 3、消化排除法：、消化排除法：此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：（1）先是用）先是用 0.5%胰蛋白酶和胰蛋白酶和 0.02EDTA（1：1）混合液漂洗培）混合液漂洗培
42、养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。可能把
43、成纤维细胞除净。4 4、胶原酶消化法：、胶原酶消化法：本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。化进行选择。（1）可用）可用 0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；（2）用）用 Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。5 5、其它
44、方法：、其它方法：选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。体外培养肿瘤细胞生物学检测体外培养肿瘤细胞生物学检测 一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系（或株）后，不论用于实验研究还是建立细胞系，都需胞系（或株）后，不论用于实验研究还是建立细胞系，都需要做一系列的细胞生物学测定，主要的目的在于求得证明：要做一系列的细胞生物学测定，主要的目的在于求得证明：1.所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非所
45、培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非 正常细胞或其它细胞；正常细胞或其它细胞；2.均具有瘤种特异性；均具有瘤种特异性；3.阐明一般生物学性状。阐明一般生物学性状。测定项目数量无明确规定，根据需要而定，以下为常做的项测定项目数量无明确规定，根据需要而定，以下为常做的项目和要点。目和要点。形态观察：形态观察：主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。的排列状态等。细胞生长增殖：细胞生长增殖：检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增检测细胞生
46、长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。时间、细胞周期时间。细胞核型分析：细胞核型分析：检测核型特点，染色体数量、标记染色体检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。的有无、带型等。凝集试验：凝集试验：检测凝集力。检测凝集力。软琼脂培养：软琼脂培养：检测集落形成能力。检测集落形成能力。异体动物接种：异体动物接种：向异体动物体内（皮下）接种细胞悬液，观察成瘤能力。其它：其它：除上述项目外，根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。在上述肿瘤细胞生物学检测中，最主要的为：异体动物（以用裸鼠为上）接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。当然从分子
47、细胞学角度考虑尚应做癌基因癌基因和抑癌基因抑癌基因等的检测。1、鉴定细胞系的纯度、鉴定细胞系的纯度2、细胞系的稳定性、细胞系的稳定性3、细胞学特征、细胞学特征4、微生物污染检测、微生物污染检测5、染色体稳定性、染色体稳定性6、有无细胞系（株）交叉污染、有无细胞系（株）交叉污染l组织起源和已传代数组织起源和已传代数l冻存液冻存液l细胞活力细胞活力l培养液：培养基、血清、抗生素等培养液：培养基、血清、抗生素等l细胞生长特征细胞生长特征l接种存活率接种存活率l细胞形态细胞形态对肿瘤细胞系或细胞株的评价对肿瘤细胞系或细胞株的评价 在使用已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株时应持特别审慎态在使用已建成的各种肿
48、瘤细胞系或细胞株时应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。的可能。长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。另外也可能发生长期传代细胞系染色体核型常是不稳定的。另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。其结果可能导致细胞产生如基因突变、基因易位或缺失等变化。其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变动。以近年建成的各种肿瘤细胞系为例，都已生物学性状上的变动。以近年建成的各种肿瘤细胞系为例，都已传代少则几十，多则百代以上后，才确认建成了细胞系。这种情传代少则几十，多则百代以上后，才确认建成了细胞系。这种情
49、况下很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。况下很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。癌细胞在培养中并非能很顺利地传下去，凡已长期传代的细癌细胞在培养中并非能很顺利地传下去，凡已长期传代的细胞系，都已获得不死性。当前尚未完全确证所有癌细胞都具有不胞系，都已获得不死性。当前尚未完全确证所有癌细胞都具有不死性；因此尚难肯定在长期培养中的癌细胞的生物学性状与体内死性；因此尚难肯定在长期培养中的癌细胞的生物学性状与体内时仍完全相同（包括不死性）。对用癌细胞系所获实验结果应尽时仍完全相同（包括不死性）。对用癌细胞系所获实验结果应尽量做分析性的结论，避免做概括性的与体内等同的结论，外推与量做分析
50、性的结论，避免做概括性的与体内等同的结论，外推与体内等同更是不妥的。广泛来说，应用各种较长时间培养细胞做体内等同更是不妥的。广泛来说，应用各种较长时间培养细胞做实验时，都应如此。实验时，都应如此。一、肿瘤细胞对组织浸润的体外研究一、肿瘤细胞对组织浸润的体外研究二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究三、肿瘤细胞的体外分化实验三、肿瘤细胞的体外分化实验四、培养肿瘤细胞的凋亡诱导研究四、培养肿瘤细胞的凋亡诱导研究五、肿瘤细胞的体外化疗药物敏感性实验五、肿瘤细胞的体外化疗药物敏感性实验细胞培养的基本条件？细胞培养的基本条件？举一个例子，阐述上皮细胞体外培养技术和流程。举一
