1、-1-第第2 2节基因工程的基本操作程序节基因工程的基本操作程序学习目标1.概述基因工程的基本操作程序。2.说明利用PCR技术扩增目的基因的基本过程。3.理解基因表达载体的结构和各部分的作用及基因表达载体的构建。4.举例说明获取目的基因的途径,目的基因导入受体细胞的方法、检测与鉴定目的基因的方法。一、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取。2.基因表达载体的构建。3.将目的基因导入受体细胞。4.目的基因的检测与鉴定。二、目的基因的筛选与获取1.目的基因:用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因,如与生物抗逆性、优良品质、生物制药、毒物降解和工业用酶等相关
2、的基因。2.筛选合适的目的基因(1)从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。(2)应用测序技术、序列数据库、序列比对工具等认知更多的基因结构和功能,以便找到合适的目的基因。3.获取目的基因的途径(1)人工合成目的基因;(2)构建基因文库获取目的基因;(3)PCR获取目的基因。4.利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的目的:在体外对目的基因的核酸序列进行大量复制。(2)PCR原理:DNA半保留复制。(3)PCR条件:一定的缓冲溶液、DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。(4)每次循环的过程:变性复性延伸。变性:加热至90 以上时,双链DNA解聚
3、为单链。复性:冷却至50 左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸:加热至72 左右时,4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。(5)特点:上一轮循环的产物作为下一轮反应的模板,每一次循环后,目的基因的量可以增加一倍,即成指数形式扩增(约为2n,n为扩增循环的次数)。(6)鉴定:常用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。在琼脂糖凝胶电泳时,DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子
4、的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。预习反馈1.判断正误。(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。()(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。()(3)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶。()2.下列有关PCR技术的说法,错误的是()A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B.PCR技术的原理是DNA半保留复制C.利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列D.PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNA答案D解析PCR是一项在生物体外复制
5、特定的DNA片段的核酸合成技术,其原理是DNA半保留复制,A项和B项正确;利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物,C项正确;PCR扩增中双链DNA受热变性后解聚为单链,不需要解旋酶解开双链DNA,D项错误。三、基因表达载体的构建1.基因表达载体构建的目的使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成 3.基因表达载体的构建过程一般用同种或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和目的基因,再用DNA连接酶把两者连接,形成一个重组DNA分子(如下图)。预习反馈1.判断正误。(1)表
6、达载体的复制和目的基因的表达均启动于复制原点。()(2)外源DNA必须位于重组质粒的启动子上游或终止子的下游才能进行表达。()(3)基因表达载体中需要含有起始密码、终止密码、目的基因、标记基因。()(4)借助抗生素抗性基因可将含目的基因的受体细胞筛选出来。()2.下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述,正确的是()A.表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞中的mRNA反转录获得B.表达载体的复制开始于启动子C.胰岛素基因必须插入启动子与终止子之间D.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用答案C解析由于人肝细胞中胰岛素基因不能表达,所以无法利用肝细胞中的mRNA反转录获得胰岛素基因,A项错误;
7、表达载体的复制启动于复制原点,B项错误;胰岛素基因必须插入启动子与终止子之间,C项正确;启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,是转录的起点,而终止密码子位于mRNA上,在翻译中起作用,D项错误。四、将目的基因导入受体细胞1.导入植物细胞(1)农杆菌转化法。利用农杆菌细胞中Ti质粒上的T-DNA(可转移DNA)能够转移并整合到侵染细胞的染色体DNA上的特点,将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中,通过农杆菌的转化作用,可以使目的基因进入植物细胞。(2)花粉管通道法。用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。在植物受粉后的一段时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花
8、粉管通道进入囊胚。2.导入动物细胞(受精卵)显微注射技术。3.导入微生物细胞用Ca2+处理细胞,使受体细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,再将重组的基因表达载体导入其中。预习反馈1.判断正误。(1)目的基因导入植物细胞一般采用农杆菌转化法。()(2)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。()(3)常用卵细胞作为培育转基因动物的受体细胞。()2.(多选)下图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时,从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法正确的是()A.图中是质粒,步骤需要用到限制酶和DN
9、A聚合酶B.图中是含目的基因的重组质粒,步骤是将重组质粒导入棉花细胞C.图中是农杆菌,通过步骤将目的基因导入植物细胞D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达答案CD解析为质粒,步骤为基因表达载体的构建,需要用到限制酶和DNA连接酶,A项错误;图中步骤是将重组质粒导入农杆菌细胞,B项错误;图中步骤是将目的基因导入植物细胞,C项正确;基因的表达具有一定的独立性,剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达,D项正确。五、目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测(1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中。(2)检测目的基因是否转录出了mRNA。(3)检测目的基因是否翻
10、译出相应蛋白质,通常用抗体进行抗原抗体杂交。2.个体生物学水平的鉴定(1)通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。(2)通过相应病原微生物感染生物来确定相应抗病基因是否赋予了受体生物抗病特性以及抗性的程度。预习反馈1.判断正误。(1)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。()(2)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。()(3)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中,可用抗原抗体杂交技术。()2.下列判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中,不属于分子检测的是()A.通过观察害虫吃棉叶是否死亡B.检测棉花基因组DNA与DN
11、A探针能否形成杂交带C.检测棉花细胞中mRNA与DNA探针能否形成杂交带D.检测棉花细胞中的蛋白质能否与特定抗体形成杂交带答案A解析A项属于个体水平的鉴定,不是分子检测。探究点一探究点二探究点三探究点四目的基因的筛选与获取目的基因的筛选与获取情境导引巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫,能够传播脑炎、丝虫等传染病,而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播,科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因,当具有该基因的雄蚊与野生雌蚊交配时,这种基因可以进入雌蚊的基因组,并使雌蚊死亡,从而达到减少该种蚊子的数量,抑制疾病传播的目
12、的。探究点一探究点二探究点三探究点四请讨论回答下列问题。1.该项研究的目的基因是什么?其作用是什么?提示植入雄性致倦库蚊体内的一种特殊基因是该项研究的目的基因。该基因可以进入雌蚊的基因组,并使雌蚊死亡,从而减少该种蚊子的数量,抑制疾病传播。探究点一探究点二探究点三探究点四2.根据PCR获取和扩增目的基因的反应条件,完善表格。条件作用在一定的缓冲液中进行提供相对稳定的环境 合成DNA子链的原料DNA母链 催化合成DNA子链 与DNA母链相应互补序列结合答案pH4种脱氧核苷酸提供DNA复制的模板耐高温的DNA聚合酶引物探究点一探究点二探究点三探究点四3.PCR反应的过程 答案变性解旋复性碱基互补配
13、对延伸5端向3端延伸 探究点一探究点二探究点三探究点四归纳提升1.PCR技术与细胞内DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式 解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所主要在细胞核内PCR扩增仪(PCR仪)酶解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度,在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系(1)模板:均需要脱氧核苷酸单链作为模板(2)原料:均为4种脱氧核苷酸(3)酶:均需DNA聚合酶(4)引物:都需要引物,使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成探究点一探究点二探究点三探究点四2.PCR反应中应注意的问题(1)PCR设计的
14、引物序列长度一般介于2030个核苷酸,若引物序列太长会使扩增效率降低,而引物太短又容易导致异常DNA的产生。(2)PCR技术通过高温加热使双链DNA解旋,该过程不需要解旋酶的参与。双链DNA在高温下解链的现象称为DNA的变性,在降温时,双链可以重新形成,所以DNA的热变性是可逆的。(3)PCR扩增时,复性温度的设定是成败的关键。复性温度的设定主要与引物的长度和碱基组成中GC比例呈正相关。如果复性温度太高,引物无法与模版链结合,无法进行DNA复制,PCR反应得不到任何扩增产物。(4)DNA聚合酶从引物的3端开始拼接单个的脱氧核苷酸进行PCR扩增。探究点一探究点二探究点三探究点四3.目的基因获取方
15、法的选择(1)PCR扩增。必须有目的基因上一段已知序列,以便设计引物。(2)人工合成。目的基因片段小,序列已知。(3)基因文库中获取。目的基因序列未知。探究点一探究点二探究点三探究点四典例剖析(多选)以下为逆转录过程和PCR扩增过程示意图。据图分析,下列说法正确的是()A.催化过程的酶是逆转录酶B.过程发生的变化是引物与单链DNA结合C.催化过程的酶都是DNA聚合酶D.如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%,则一个双链DNA中,A与U之和也占该DNA碱基含量的40%探究点一探究点二探究点三探究点四答案ABC解析由题意可知,分别表示的过程是逆转录、DNA的复制、DNA解链、引物结合到互
16、补DNA链、DNA子链的合成,B项正确;过程由逆转录酶催化完成,A项正确;催化过程的酶都是DNA聚合酶,C项正确;在DNA分子中有T无U,D项错误。探究点一探究点二探究点三探究点四活学活练1.下列关于 PCR 技术的叙述,错误的是()A.PCR 即聚合酶链式反应,利用其可获取大量目的基因B.PCR 的原理是 DNA半保留复制,可以在仪器中自动完成C.PCR 技术扩增目的基因时要知道目的基因的部分序列D.PCR 技术扩增目的基因时必须用解旋酶解开双链 DNA答案D解析PCR 即聚合酶链式反应,利用其可获取大量目的基因,A项正确;PCR 的原理是 DNA 半保留复制,可以在仪器(PCR仪)中自动完
17、成,B项正确;PCR 技术扩增目的基因时要知道目的基因的部分序列,以便设计引物,C项正确;PCR 技术扩增目的基因时用高温解开双链 DNA,D项错误。探究点一探究点二探究点三探究点四2.PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,利用该方法可以使目的基因迅速扩增,其简要过程如图所示。下列关于PCR技术的叙述,错误的是()A.PCR和体内DNA复制都需要模板、能量B.由PCR的反应过程可知,与氢键相比,磷酸二酯键对高温的稳定性更强C.PCR和体内DNA复制都要消耗4种脱氧核苷酸和2种引物D.PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板探究点一探究点二探究点三探究点四答案C解析PCR
18、技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,以极少量DNA为模板,复制出大量DNA,与体内DNA复制一样,都需要模板和能量,A项正确;由PCR的反应过程可知,高温使双链DNA解链,破坏的是碱基间的氢键,而没有破坏磷酸二酯键,则磷酸二酯键对高温的稳定性更强,B项正确;PCR和体内DNA复制都要消耗4种脱氧核苷酸,PCR是先解旋后复制特定DNA序列,需2种引物,而细胞内DNA复制是边解旋边复制,则需多种引物,C项错误;PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板,继续合成子代DNA片段,D项正确。探究点一探究点二探究点三探究点四基因表达载体的构建基因表达载体的构建情境导引游离的DNA进入细胞内
19、,一般会直接被分解,就算可以进行转录、翻译成蛋白质,游离DNA也无法跟着细胞分裂进行复制,导致子代细胞中不再含有该游离DNA。若游离的DNA整合至细胞的染色体DNA上,或以一种形式在细胞内独立稳定存在,能自我复制,则该游离DNA上的基因会随细胞分裂传递给子细胞或子代。请讨论回答下列问题。1.通过PCR技术获取足够量的目的基因后,能够直接导入受体细胞吗?为什么?提示不能。若将目的基因直接导入受体细胞,目的基因可能被受体细胞分解或无法随细胞分裂进行复制,不能稳定遗传和表达。探究点一探究点二探究点三探究点四2.基因表达载体的基本组成有哪几部分?提示目的基因、启动子、终止子、标记基因等。3.标记基因的
20、作用是什么?常用什么基因来作标记基因?提示标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用抗性基因作为标记基因。4.培育转基因生物的核心工作是什么?构建基因表达载体的目的是什么?提示培育转基因生物的核心工作是基因表达载体的构建。构建基因表达载体的目的:(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代;(2)使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。探究点一探究点二探究点三探究点四归纳提升1.构建基因表达载体时限制酶的选择技巧探究点一探究点二探究点三探究点四根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,
21、如图甲可选择Pst;不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择Sma;为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用Pst 和EcoR 两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保产生相同的黏性末端;质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因;如果所选酶的切割位点不止一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能进行复制探究点一探究点
22、二探究点三探究点四2.启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别 项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质有特殊序列结构的DNA片段有特殊序列结构的DNA片段mRNA上三个相邻碱基mRNA上三个相邻碱基位置基因上游基因下游mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录终止转录翻译的起始点终止翻译探究点一探究点二探究点三探究点四易错提醒 基因表达载体易错点剖析(1)基因工程中的基因表达载体不等同于载体。基因表达载体与载体相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位点不是随意的。目的基因应插入启动子和终止子之间的部位,若目的基因插入启动子部位,目的基因将无法表达。探究点一探究
23、点二探究点三探究点四典例剖析如图是利用基因工程技术培育转基因植物,进而生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中Pst、Sma、EcoR、Apa为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是()探究点一探究点二探究点三探究点四A.图示过程是基因工程的核心步骤B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaC.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D.除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构答案B解析图示过程为基因表达载体的构建过程,是基因工程中的核心步骤,A项正确;构建表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来,此时要用到限制酶Pst、EcoR,B项错误;抗卡那霉素基因是标记基因,目的是
24、便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞,C项正确;基因表达载体应包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等结构,D项正确。探究点一探究点二探究点三探究点四活学活练1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述,正确的是()A.切割含抗虫基因的DNA片段和载体必须用同一种限制酶B.抗虫基因表达载体中要有启动子和终止密码子C.抗虫基因表达载体必须具备标记基因,其作用是筛选含有目的基因的受体细胞D.抗虫基因的表达启动于复制原点探究点一探究点二探究点三探究点四答案C解析切割含抗虫基因的DNA片段和载体可以用不同的限制酶,只要切割出的切口末端相同即可,A项错误;抗虫基因表达载体必须具备启动子和终止子,终止密码子位于mRNA
25、上,B项错误;基因表达载体必须具备标记基因,其作用是用于检测目的基因是否导入到受体细胞中,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来,C项正确;抗虫基因的表达开始于启动子,D项错误。探究点一探究点二探究点三探究点四2.图甲、乙中的箭头表示限制性内切核酸酶的酶切位点,ampr表示氨苄青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是()A.图甲中的质粒用BamH 切割后,含有4个游离的磷酸基团B.在构建重组质粒时,可用Pst 和BamH 切割质粒和外源DNAC.用Pst 和Hind 切割质粒和外源DNA,可以保证重组DNA序列的唯一性D.导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长探究
26、点一探究点二探究点三探究点四答案C解析图甲中的质粒用BamH切割后,获得一个DNA片段,其只含有2个游离的磷酸基团,A项错误;在构建重组质粒时,不能使用BamH切割外源DNA,因为用BamH会破坏目的基因的结构,但可以用Pst和Hind 切割质粒和外源DNA,B项错误;用Pst和Hind 切割质粒,切开的质粒由于两切口处黏性末端不同,不会自身连接,用这两种限制酶切割外源DNA,可得到目的基因的完整序列,且切口处黏性末端只能与切开的质粒的互补的黏性末端连接,保证了重组DNA序列的唯一性,C项正确;由于用Pst切割质粒后,其中的氨苄青霉素抗性基因已被破坏,所以导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉
27、素的培养基中生长,D项错误。探究点一探究点二探究点三探究点四将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞情境导引下图表示培育转基因抗病毒番茄的过程示意图。探究点一探究点二探究点三探究点四请回答下列问题。1.简述农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程。提示将目的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中,通过农杆菌对植物细胞的侵染作用,Ti质粒上的T-DNA转移至被侵染的植物细胞,并将其整合到该细胞的染色体DNA上。2.将目的基因导入植物细胞最常用的是哪种方法?简便经济的方法是哪种?我国科学家独创的方法是哪种?提示农杆菌转化法最常用。除此之外还有花粉管通道法,这是一种更为简便经济的方法,也是我国科
28、学家独创的方法。探究点一探究点二探究点三探究点四3.将目的基因导入动物细胞通常采用的方法是什么?选取的受体细胞是什么细胞?提示显微注射法。受精卵。4.简述将目的基因导入大肠杆菌的基本过程。提示用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。基因表达载体溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收基因表达载体。探究点一探究点二探究点三探究点四归纳提升1.受体细胞的选择(1)对于植物来说,受体细胞可以是受精卵或体细胞,因为植物细胞具有全能性。(2)对于动物来说,受体细胞一般是受精卵,因为受精卵的全能性高,而高度分化的动物体细
29、胞的全能性受到抑制。(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞,但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞,而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器),所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时,酵母菌比大肠杆菌有优势。探究点一探究点二探究点三探究点四2.目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别 探究点一探究点二探究点三探究点四(1)图中a细胞减数分裂时,细胞质是不均分的,子细胞不一定含有目的基因。(2)图中b在进行细胞减数分裂时,细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中,保证了亲子代遗传性状的稳定性,细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。易错提醒 在将目的基因导入受体细胞之前,都必须进
30、行基因表达载体的构建,也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子,而不是直接导入目的基因。探究点一探究点二探究点三探究点四典例剖析(多选)下图表示培育转基因抗病毒农作物的过程示意图。下列叙述正确的是()A.过程a需要限制酶和DNA连接酶的参与B.过程b需要用CaCl2处理,以提高农作物细胞细胞壁的通透性C.抗病毒基因一旦整合到农作物细胞的染色体上,就能正常表达D.转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定探究点一探究点二探究点三探究点四答案AD解析题图中过程a为构建基因表达载体,需要用到限制酶和DNA连接酶,A项正确;CaCl2处理只是提高农杆菌细胞(原核细胞)细胞壁的通透性,B
31、项错误;抗植物病毒基因整合到农作物细胞的染色体上,不一定能表达,C项错误;转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒,观察农作物是否被感染来进行鉴定,D项正确。探究点一探究点二探究点三探究点四活学活练受体细胞不同,将目的基因导入受体细胞的方法也不相同,下列受体细胞与导入方法匹配错误的是()选项受体细胞导入方法A棉花细胞花粉管通道法B大肠杆菌农杆菌转化法C羊受精卵显微注射法D水稻细胞农杆菌转化法探究点一探究点二探究点三探究点四答案B解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法,我国的转基因抗虫棉培育过程用到此种方法,A项正确;将目的基因导入微生物细胞用Ca2+处理法,这种方法能使大肠杆菌细胞
32、处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,B项错误;显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法,C项正确;可用农杆菌转化法将目的基因导入水稻细胞,D项正确。探究点一探究点二探究点三探究点四目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定下图为抗虫棉的接种实验,结合图示(左图为转基因抗虫棉使虫体发育不正常)探究以下问题。1.分子水平的鉴定包括哪些内容?提示目的基因的检测与鉴定在分子水平包括:目的基因是否插入受体DNA,目的基因是否转录出mRNA和目的基因是否翻译出蛋白质三个层次。探究点一探究点二探究点三探究点四2.观察下图,完善目的基因是否导入受体细胞,目的基因是否转录
33、出mRNA的鉴定方法和原理。探究点一探究点二探究点三探究点四(1)由图可知,的基本原理是具有一定同源性的两条DNA单链,在一定条件下(适宜的温度等)按照原则形成双链。杂交过程是高度特异性的,杂交的双方是和用放射性同位素标记的(又称基因探针)。若转基因生物的染色体DNA中有能与探针的特异DNA片段,用于示踪的放射性同位素标记将指示其所在的位置,表明目的基因已插入到转基因生物中。(2)同理,利用DNA和mRNA之间分子杂交技术,检测目的基因是否。答案(1)DNA分子杂交法碱基互补配对待测的DNA已知DNA片段互补染色体的DNA(2)转录出mRNA探究点一探究点二探究点三探究点四3.如何检测目的基因
34、是否翻译成了蛋白质?提示提取转基因生物的蛋白质,以相应的抗体进行抗原抗体杂交,若出现杂交带说明目的基因表达出相应蛋白质。也可进行个体生物学水平的鉴定。4.对于转基因抗虫或抗病植株,在个体生物学水平的鉴定包括哪些内容?提示一个抗虫或抗病的目的基因导入植物细胞后,是否赋予了植物抗虫或抗病特性,在个体生物学水平上需要做抗虫或抗病的接种实验,以确定是否具有抗性以及抗性的程度。探究点一探究点二探究点三探究点四归纳提升1.目的基因的检测与鉴定探究点一探究点二探究点三探究点四2.不同分子检测原理的异同(1)检测目的基因是否插入受体DNA中、目的基因是否转录时,用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的D
35、NA片段。检测原理都是碱基互补配对原则,只是被检测的物质不同,一个是转基因生物的基因组DNA,一个是转基因生物细胞内的mRNA。(2)进行翻译水平的检测,通常以目的基因表达产物(蛋白质)作抗原,制备相应抗体,检测转基因生物的蛋白质,利用抗原与抗体特异性结合的原理。(3)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测,都是在体外进行的。探究点一探究点二探究点三探究点四易错提醒 基因工程操作过程中碱基互补配对现象基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象;第一步筛选与获取目的基因,用人工合成、PCR获取或基因文库获取,三种常用方法都涉及碱基互补配对;第二步基因表达载体的
36、构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体,第四步利用分子杂交的方法检测(DNA、mRNA),也都存在碱基互补配对现象。探究点一探究点二探究点三探究点四典例剖析目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()检测受体细胞中是否有目的基因检测受体细胞中是否有致病基因检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质A.B.C.D.探究点一探究点二探究点三探究点四答案C解析对转基因中目的基因的分子水平的检测包括三个方面:检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交技术;检测目的基因是否转录出了相
37、应的 mRNA,方法也是使用基因探针与之杂交;检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质,常用的方法是抗原抗体杂交。探究点一探究点二探究点三探究点四活学活练1.利用外源基因在受体细胞中表达,可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因在导入受体细胞后完成表达的是()A.棉花细胞中检测到载体上的标记基因B.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素基因C.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNAD.酵母菌细胞中提取到人的干扰素答案D解析A、B两项只说明目的基因已导入受体细胞中,C项说明目的基因在受体细胞中转录出了mRNA。D项含有人的干扰素基因的酵母菌合成了人的干扰素,说明目的基因完成表达。探究点一探究点二探究点
38、三探究点四2.科学家将大麦细胞中的LTP1基因植入啤酒酵母菌中,获得的啤酒酵母菌可产生相应蛋白质,并酿出泡沫丰富的啤酒,其基本的操作过程如下图所示。请据图回答下列问题。探究点一探究点二探究点三探究点四(1)图中所示技术定向改变了酵母菌的性状,所利用的原理是。(2)本操作中为了将LTP1基因导入酵母菌细胞内,所用的载体是。(3)图中a、b过程使用到的酶分别是。(4)将LTP1基因导入酵母菌细胞并成功表达,这里“成功表达”的含义是。探究点一探究点二探究点三探究点四答案(1)基因重组(2)质粒(3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶(4)啤酒酵母菌可产生相应蛋白质解析(1)基因工程实现了不同种生物基因的重新组合,依据的原理是基因重组。(2)大肠杆菌细胞中的质粒是小型环状DNA分子,适于作为载体。分析题图可知,将目的基因导入酵母菌细胞使用的载体是质粒。(3)a过程中,用限制性内切核酸酶对含目的基因的DNA片段进行切割;b过程构建重组质粒,需用DNA连接酶连接目的基因和载体。(4)将LTP1基因导入酵母菌细胞并成功表达,这里“成功表达”的含义是LTP1基因在酵母菌细胞中通过转录和翻译合成了相应蛋白质。
