1、生物技术药物的免疫毒性和免疫原性研究Kaiyong LIU 华南农业大学生物技术药物 生物技术药物 包括体内诊断、治疗与预防用途；来源于细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞 蛋白质、多肽及其衍生物、核酸 如细胞因子、生长因子、融合蛋白、酶、激素、单抗、载体等 特殊性 结构、生产工艺、保存条件、同源性、作用靶点明确等固有的特点免疫毒性/免疫原性 免疫毒性 是指受试品引起免疫抑制或增强、过敏反应或自身免疫反应，可能与药理活性相关（如抗排斥药物）或不相关（如部分抗肿瘤药物）。免疫原性 指药物刺激机体形成特异性抗体或致敏淋巴细胞的性质。研究意义 意义重大：如 免疫抑制，感染，肿瘤 免疫增强，放大自身免
2、疫反应或过敏反应。免疫原性，是药物本身具有的性质，有免疫原性不一定导致毒性，但可以影响对药物毒性、毒代或药效的客观评价。但在规范及指导原则方面，缺乏共识，实验方法也不统一免疫毒性研究内容一 常规的免疫毒性指标包括：白细胞总数及其分类计数 球蛋白和白/球比值 补体水平 淋巴器官/组织的大体解剖 胸腺和脾脏的器官重量 免疫病理：胸腺、脾脏、引流淋巴组织免疫毒性研究内容二 额外的免疫毒性试验（additional studies），如 (1)常规免疫毒性检测结果提示免疫毒性，感染 (2)受试品的结构，与已知免疫调节剂相似 (3)药代动力学结果:原型药或代谢产物在免疫组织 蓄积 (4)适应症:如用于抗
3、HIV药物 (5)药理作用：常对免疫系统有影响常规的免疫毒性检测结果 引流淋巴组织检查图猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后回肠粘膜下集合淋巴小结：对照组，：高剂量组常规的免疫毒性检测 免疫抑制/增强 全血细胞变化、白细胞变化或淋巴细胞变化等。免疫器官重量改变或组织学检查显示相关器官或组织细胞密度变化 血清免疫球蛋白变化 用药组感染发生率升高 用药组肿瘤发生率增多(除遗传毒性、激素效应或肝酶诱导外)额外的免疫毒性试验内容 免疫功能检测 如T细胞依赖的抗体反应、NK细胞活性、CTL活性、细胞因子表达、巨噬细胞/中性粒细胞功能、皮肤超敏反应、宿主抵抗力研究）免疫表型检测 依据免疫学理论和具体靶分子种
4、类额外的免疫毒性试验方案 增设卫星组、增加免疫学指标或改变给药方案等。发育免疫毒性：在成年动物中发现免疫抑制作用后，需要评价发育免疫毒性作用，如观察母代暴露于药物后仔代的淋巴系统、血液系统、细胞因子等，两种以上功能检测等。不仅是免疫抑制！常规阶梯或分层或标准试验组合不一定合理，需个体化额外的免疫毒性试验方法 免疫功能检测 Macrophage/Neutrophil荧光标记的胶珠观察phagocytosis等 NK反映天然免疫功能TDARSRBC or 钥孔血蓝蛋白(KLH），用ELISA等CTL51Cr释放法，ELISPOT法CytokinesELISA法及胞内细胞因子检测额外的免疫毒性试验方
5、法 免疫功能检测hypersensitivity目前预测IV型变态反应 Buehler试验、豚鼠最大化试验（GPMT）、小鼠耳肿胀试验、小鼠局部淋巴结试验(LLNA)autoimmunity PLNA（报告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）host resistance 抗感染或抗肿瘤发生（整体，必要时）注：GPMT与人一致性约70%，LLNA约72%额外的免疫毒性试验方法 免疫表型检测 常用流式细胞仪检测，检测表达水平和比例 SurfacemarkersIg+PanB cellsThy 1.2+or CD3+Pan T cells、CD4+CD8-T Helper/del
6、ayed-type hypersensitivity cellsCD8+CD4-T Suppressor-cytotoxic cellsCD8+CD4+Immature T cells免疫功能检测 分泌IFN细胞图猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后外周血p24特异性的分泌IFN的淋巴细胞数量 免疫细胞表型检测 CD22阳性比例图 食蟹猴静脉注射SM03嵌合抗体后CD22标记阳性细胞率的变化 CD22阳性细胞比例（%）免疫细胞表型检测 CD4/CD8比例CD4/CD8比例图 猕猴iv 4周 LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例免疫毒性试验结果分析 统计学意义与生物学意义（尤其单一指标）
7、变化程度 与剂量/暴露关系 与拟用临床剂量的关系 疗程关系 涉及动物种属数量和受影响的终点 可能继发于其他因素(e.g.,stress,）可能的细胞靶点和（或）作用机制 引起这些变化的剂量与产生其他毒性的剂量关系 可逆性免疫毒性靶器官的分析线索 靶分子在免疫器官或组织的分布 受试品或其代谢产物的分布 相关指标的变化 常规免疫指标、细胞因子变化等。免疫毒性机制推测 受体或药靶直接引起的毒性反应（on-target)如干扰素引起骨髓抑制 受体或药靶介导的间接毒性反应 如rhIL-12能诱导干扰素的分泌 非特异机制 如rhTNK-tPA引起肝细胞剂量依赖性的脂肪变性。免疫原性研究内容 免疫原性(im
8、munogenicity)指诱导宿主产生免疫应答的能力，具有这种能力的物质称为免疫原(immunogen）。产生特异性抗体或致敏淋巴细胞能力。影响因素 分子大小，10 000，5 00010 000，1000 5000 分子结构，蛋白质多糖核酸类脂 宿主因素、免疫方式免疫原性研究意义 免疫原性影响重复给药毒性试验结果的分析：中和药物活性、改变药物的清除、半衰期和组织分布 （neutralize drug activity and alter drug clearance,plasma half-life,and tissue distribution）建立免疫分析方法，供临床试验应用免疫原性研
9、究内容 抗体检测方法学验证 免疫反应检测 抗体滴度、抗体的出现时间、出现抗体的动物数、剂量关系、抗体滴度的动态变化、抗体的中和活性、。抗体与药代/药效和安全关系的评价 同期的药效/药代（毒代）/毒性反应的变化、补体激活与否、免疫复合物在肝肾的沉积、是否需要终止给药、临床意义分析等抗体检测方法 ELISA-桥法 包被药物，用标记的药物检测。ELISA-直接法 包被药物，用标记抗体检测。（缺点：包被时可能会掩盖或改变药物的表位，仅检测单一亚型，有种属特异性，多次洗涤时丢失低亲和力抗体，参考品与样本之间试剂可能不同）抗体检测方法 间接法 包被单抗或生物素，再加药物。放射免疫沉淀法（RIP）液相法，中
10、等或高通量水平 表面等离子体共振 液相法，不需结合物（酶标记抗体），能检测到不同亲和力的抗体和各亚型抗体 电化学发光法 液相法，可检测各种抗体亚型抗体检测方法考察 方法学考察灵敏度：500-1000ng/ml，低滴度抗体检出受试物干扰：如有文献报道，如血清中受试物浓度大于0.15g/ml，则难以检测到抗受试物抗体。一般从1：10开始稀释或对样品进行处理。长效?精确度：利用阳性对照品重复测量 阴性对照血清一般需从15只动物或50人中抽取免疫复合物在肝肾的沉积：溶剂对照组猴肾组织：重组葡激酶大剂量组肾组织图猕猴图猕猴iviv重组葡激酶周后肾组织的免疫组织化学染色重组葡激酶周后肾组织的免疫组织化学染
11、色抗体检测结果描述 抗体滴度结果表示 数据呈非正态分布，取对数后达正态分布，需用几何均数表示 抗体检测结果 抗体的出现时间、出现抗体的动物数、剂量关系、抗体滴度的动态变化抗体中和活性检测 常用依赖细胞株 抗病毒致细胞病变（CPE）克隆细胞株 靶基因检测等。游离或与抗体结合的受试品对中和活检测的干扰（偶联抗体的琼脂糖凝胶珠吸附）抗体中和活性的检测 CPE法图 猴经口免疫HIV-BPV 假病毒后血清对 HIV-1 HN 024的中和活性抗体中和活性检测方法 靶基因表达抗体产生对药效相关指标的影响图 注射表达EPO基因裸质粒8周后贫血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的检测抗体产生对药代的影响 临床上
12、连续应用重组水蛭素5以上可使74%的患者产生抗水蛭素抗体（AHAb）。抗体产生对药代的影响0481317210.010.1110TPO(ng/mL）-)时间时间(天天)图 猴皮下连续注射rhTPO 2 g.kg-1.d-120 d后血清rhTPO浓度(实测值和抗体滴度(,血清稀释倍数的倒数）抗体产生对毒性反应的影响对照组10ug/kg30ug/kg90ug/kg02468101214161820指标组别 WBC（x109)Ab titer ED50(IU/ml)图 食蟹猴sc 2周和4周PEG-IFN后白细胞计数、抗体滴度和血清中和活性 对照组10ug/kg30ug/kg90ug/kg0246
13、81012141618707274指标组别 WBC（x109)Ab titer ED50(IU/ml)*中和抗体产生对给药方案的意义 中和抗体影响了大多数动物的药理和（或）毒性反应，则可以考虑终止给药。中和抗体水平，在体外能中和安全剂量达到的血药浓度的作用时，可以考虑终止给药。需结合药动学资料。总 结 生物技术药物免疫毒性评价 重视，个体化原则，采用新方法 生物技术药物免疫原性评价 强调规范，分析与毒性反应等关系CD28激动剂TGN1412的期临床试验事件 德 国 公 司 研 制 的 抗 C D 2 8 超 级 激 动 剂TGN1412（人源化单抗）用于治疗白血病等，在1期临床试验中，单次静脉
14、注射12-16h，6例均出现严重不良反应（多器官衰竭）。CD28激动剂TGN1412的期临床试验事件 研究发现注射受试品后很快导致前炎症因子释放（细胞因子风暴），心肺功能衰竭。猴长毒：CD4+和CD8+T细胞一过性升高,血清IL-2、IL-5、IL-6中度升高，但没有出现细胞因子释放综合征。CD28激动剂TGN1412的期临床试验事件的教训 期临床试验方案的教训：仅10min间隔 免疫毒性的种属差异及免疫毒性评价和分析的重要性（Toxicol in Vitr）。猴并非一定是相关动物，动物记忆T细胞少。主要参考文献 EMEA.Guideline on Comparability of Medic
15、inal Products Containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substance:Nonclinical and Clinical Issues ICH.preclinical safety evaluation ofbiotechnology-derived pharmaceuticalss6 ICH.immunotoxicity studies for human pharmaceuticals s8 FDA.Immunotoxicology Evaluation of Investigational New Drugs
16、 吕秋军等.生物技术药物临床前安全性评价研究进展。中国新药杂志，2001，10（4）：252-256 Lu Qiujun,et al.Safety evaluation of recombinant staphylokinase.Toxicologic Pathology,2003，31（1）：14-21 吕秋军.生物技术药物免疫原性的评价及面临的挑战.中国新药杂志,2007,16(3):181-188谢 谢！其实，世上最温暖的语言，“不是我爱你，而是在一起。”所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以诚相待，彼此尊重，相互包容，相互懂得，才能走的更远。相遇是缘，相守是爱。缘是多么的妙不可言，而懂得又
17、是多么的难能可贵。否则就会错过一时，错过一世！择一人深爱，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牵，一路笑对风雨。在平凡的世界，不求爱的轰轰烈烈；不求誓言多么美丽；唯愿简单的相处，真心地付出，平淡地相守，才不负最美的人生；不负善良的自己。人海茫茫，不求人人都能刻骨铭心，但求对人对己问心无愧，无怨无悔足矣。大千世界，与万千人中遇见，只是相识的开始，只有彼此真心付出，以心交心，以情换情，相知相惜，才能相伴美好的一生，一路同行。然而，生活不仅是诗和远方，更要面对现实。如果曾经的拥有，不能天长地久，那么就要学会华丽地转身，学会忘记。忘记该忘记的人，忘记该忘记的事儿，忘记苦乐年华的悲喜交集。人有悲欢离合，
18、月有阴晴圆缺。对于离开的人，不必折磨自己脆弱的生命，虚度了美好的朝夕；不必让心灵痛苦不堪，弄丢了快乐的自己。擦汗眼泪，告诉自己，日子还得继续，谁都不是谁的唯一，相信最美的风景一直在路上。人生，就是一场修行。你路过我，我忘记你；你有情，他无意。谁都希望在正确的时间遇见对的人，然而事与愿违时，你越渴望的东西，也许越是无情无义地弃你而去。所以美好的愿望，就会像肥皂泡一样破灭，只能在错误的时间遇到错的人。岁月匆匆像一阵风，有多少故事留下感动。愿曾经的相遇，无论是锦上添花，还是追悔莫及；无论是青涩年华的懵懂赏识，还是成长岁月无法躲避的经历愿曾经的过往，依然如花芬芳四溢，永远无悔岁月赐予的美好相遇。其实，人生之路的每一段相遇，都是一笔财富，尤其亲情、友情和爱情。在漫长的旅途上，他们都会丰富你的生命，使你的生命更充实，更真实；丰盈你的内心，使你的内心更慈悲，更善良。所以生活的美好，缘于一颗善良的心，愿我们都能善待自己和他人。一路走来，愿相亲相爱的人，相濡以沫，同甘共苦，百年好合。愿有情有意的人，不离不弃，相惜相守，共度人生的每一个朝夕直到老得哪也去不了，依然是彼此手心里的宝，感恩一路有你！感谢您对文章的阅读跟下载，希望本篇文章能帮助到您，建议您下载后自己先查看一遍，把用不上的部分页面删掉哦，当然包括最后一页，最后祝您生活愉快!
